代謝組學在糖尿病神經(jīng)病變研究中的應(yīng)用和進展

張 倩，宋 瑋，梁曉春

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 1中醫(yī)科 2醫(yī)學科學研究中心，北京 100730

糖尿病是導致全球人口死亡率增加的主要疾病之一，可以引起多種慢性并發(fā)癥，其中糖尿病神經(jīng)病變在臨床上較為常見，可累及中樞神經(jīng)、周圍神經(jīng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)。糖尿病是一種代謝性疾病，可引起機體的整體代謝紊亂，加速神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變，導致神經(jīng)損傷。代謝組學作為系統(tǒng)生物學中極為重要的研究方法，可以提供細胞、組織、體液等生物樣本的整體代謝信息。代謝物的產(chǎn)生和變化受基因和環(huán)境的共同影響，較基因組學和蛋白質(zhì)組學而言，代謝組學可以更為直接和靈敏地反映機體自身的變化情況以及環(huán)境對機體的影響，可為疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等提供更多的信息。目前已有大量文獻報道了糖尿病前期或糖尿病的代謝組學研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)無論是1型糖尿病還是2型糖尿病，均可引起氨基酸[1]、脂質(zhì)[2]、嘌呤[3]等多種代謝物的代謝紊亂，涉及多種代謝通路。代謝紊亂目前已被證明與糖尿病慢性并發(fā)癥的形成有關(guān)[4- 5]。利用代謝組學技術(shù)研究糖尿病神經(jīng)病變，有助于理解神經(jīng)系統(tǒng)在高血糖條件下的各種生理病理過程、整體代謝變化，闡釋其發(fā)病機制，并挖掘潛在的生物標志物，為臨床診療提供更多科學依據(jù)。本文針對近5年來糖尿病神經(jīng)病變的代謝組學相關(guān)研究結(jié)果綜述如下。

代謝組學技術(shù)介紹

代謝組學研究方法可以定量或半定量地檢測各類生物樣本中內(nèi)源性小分子(通常相對分子質(zhì)量為100～1000)的變化情況，最常用的技術(shù)平臺包括核磁共振 (nuclear magnetic resonance，NMR)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用兩種。其中色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)又根據(jù)樣品分離原理的不同，主要分為液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography coupled with mass spectrometry，LC-MS)和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography coupled with mass spectrometry，GC-MS)?；诤舜诺拇x組學方法樣品前處理簡單，但靈敏度較差，可能無法檢測到一些含量較低的代謝物[5]；而基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學方法盡管樣本前處理需要更多步驟，但由于其靈敏度高，檢測到的代謝物數(shù)目更多，因此目前應(yīng)用更為廣泛[6]。

此外，根據(jù)研究目的或?qū)ο蟮牟煌?，代謝組學又包括靶向代謝組學與非靶向代謝組學。其中，非靶向代謝組學又常稱為代謝物全譜分析，這種方法無差別地檢測生物樣本中盡可能多的代謝物，結(jié)合代謝物鑒定和多元統(tǒng)計分析，有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標志物[5，7]。但非靶向技術(shù)只能提供代謝物的相對含量信息，無法獲得某一代謝物的準確含量。靶向代謝組學檢測對象是研究者感興趣的一類或幾類代謝物，通常包括幾十至幾百個代謝物不等。借助靶向的方法，研究者可以側(cè)重于某些特定代謝途徑，或者某類代謝物，且在一定范圍內(nèi)對代謝物進行絕對定量分析[5- 6]。因此，可根據(jù)研究對象、目的的不同選擇不同方法。也有很多研究將二者結(jié)合起來，先通過非靶向的方法尋找到可能的差異代謝物或代謝通路，進而結(jié)合靶向方法進一步驗證。這些研究方法已廣泛應(yīng)用于糖尿病研究領(lǐng)域，可以為糖尿病神經(jīng)病變等并發(fā)癥研究提供新的技術(shù)手段，尋找更多線索。

高血糖引起周圍神經(jīng)系統(tǒng)的代謝改變

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)，尤其是遠端多發(fā)性對稱性多神經(jīng)病病變(distal symmetric polyneuropathy，DSPN)是糖尿病神經(jīng)病變最常見的一種類型，可以表現(xiàn)為遠端感覺障礙或神經(jīng)病理性疼痛，是引起足部潰瘍、非創(chuàng)傷性截肢的主要原因[8]，也增加了糖尿病患者的病死率[9]。以往研究發(fā)現(xiàn)，DPN形成與多元醇旁路激活、蛋白非酶糖基化、氧化應(yīng)激、炎癥、神經(jīng)營養(yǎng)障礙等多方面因素有關(guān)，但目前具體病理生理機制仍不清楚。近年來，代謝組學研究對DPN的代謝紊亂過程、病理機制、生物學標志物等進行了進一步的探索。

三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)是線粒體產(chǎn)生能量的主要途徑，與脂代謝、氨基酸代謝等途徑密切相關(guān)。TCA循環(huán)在維持周圍神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)中起著重要作用。Rojas等[10]對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的1型糖尿病小鼠進行了連續(xù)數(shù)月的縱向研究，使用基于質(zhì)譜法(MS)的非靶向代謝組學方法，檢測了坐骨神經(jīng)中代謝物的變化和血清中氨基酸的變化。研究發(fā)現(xiàn)，周圍感覺神經(jīng)功能障礙和皮內(nèi)纖維減少發(fā)生在STZ給藥后22周，糖尿病小鼠在12、22周出現(xiàn)了早期的TCA 循環(huán)異常。經(jīng)過與正常對照小鼠對比發(fā)現(xiàn)，12周后神經(jīng)組織中的山梨醇和L-乳酸水平升高；而血清支鏈氨基酸包括纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的含量顯著增加；隨著糖尿病的進展，酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、組氨酸、丙氨酸和脯氨酸水平也逐漸上升。提示在長期高血糖條件下，周圍神經(jīng)組織的TCA循環(huán)發(fā)生了異常，代謝底物向一些代償途徑轉(zhuǎn)移，伴隨著血清的支鏈氨基酸升高，與皮膚感覺神經(jīng)纖維丟失、DPN的發(fā)生和進展有關(guān)。在Freeman等[11]的研究中，糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中6個TCA循環(huán)相關(guān)的酶發(fā)生了改變，在長期高血糖的狀態(tài)下，坐骨神經(jīng)中葡萄糖的利用、能量代謝存在明顯障礙。Hinder等[12]采用基于LC-MS的靶向代謝組學技術(shù)，對2型糖尿病小鼠腓神經(jīng)、坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)中的糖酵解和TCA循環(huán)代謝產(chǎn)物進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的腓神經(jīng)和坐骨神經(jīng)中的糖酵解中間產(chǎn)物(如葡萄糖- 6-磷酸，果糖- 6-磷酸，3-磷酸甘油酸，2-磷酸甘油酸等)消耗，腓神經(jīng)、坐骨神經(jīng)和DRG中檸檬酸和異檸檬酸TCA循環(huán)中間產(chǎn)物減少。從細胞層面，高糖可能引起神經(jīng)元能量代謝相關(guān)代謝物的變化，比如高糖培養(yǎng)條件下神經(jīng)細胞PC12出現(xiàn)了細胞內(nèi)的乳酸減少、細胞外的乳酸增加，琥珀酸和磷酸肌酸含量增加，均提示出現(xiàn)了能量代謝異常[13]。此外，高糖引起支鏈氨基酸(異亮氨酸和纈氨酸)合成谷氨酸的作用增強。一項針對體外神經(jīng)細胞的代謝組學研究結(jié)果提示，高糖導致包括能量代謝、氨基酸代謝等在內(nèi)的一系列的代謝異常，從而促進神經(jīng)元死亡[13]。

源自人群的研究也發(fā)現(xiàn)，TCA循環(huán)改變可能與糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)。2019年Mathew等[14]在一項血漿靶向代謝組學研究中對1型糖尿病患者和健康對照者的心臟自主神經(jīng)功能進行了3年的隨訪，探索血漿TCA循環(huán)和氨基酸代謝產(chǎn)物與心臟自主神經(jīng)病變的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，血漿基線時的富馬酸升高、氨基酸代謝物天冬酰胺和谷氨酰胺降低均與心臟自主神經(jīng)功能參數(shù)(反映心率變異程度的R-R間期標準差)異常相關(guān)；經(jīng)過調(diào)整糖化血紅蛋白、體重指數(shù)、血脂、尿蛋白等參數(shù)后，血漿中的谷氨酰胺和鳥氨酸水平也仍然與心臟自主神經(jīng)病變的進展有關(guān)(更低的R-R間期標準差)。結(jié)果提示，TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物蓄積與心臟自主神經(jīng)功能呈負相關(guān)，推測TCA循環(huán)的改變很可能進一步驅(qū)動了蛋白翻譯后修飾、與受體的結(jié)合、氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)等。TCA循環(huán)異常使代謝底物偏離正常的代謝途徑，從而進入一些替代的代謝途徑，比如神經(jīng)組織葡萄糖超負荷，激活山梨醇旁路途徑，導致細胞滲透壓增高，同時又可誘導氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等，從而導致神經(jīng)損害。但尚不能確定TCA循環(huán)中哪些底物的變化與血清支鏈氨基酸之間的反應(yīng)過程，血清支鏈氨基酸升高與神經(jīng)損傷之間的關(guān)聯(lián)和具體機制亦不能完全明確。

脂質(zhì)代謝越來越多的證據(jù)表明，除了長期高血糖以外，脂質(zhì)代謝紊亂也是促進糖尿病神經(jīng)病變形成的重要因素[15- 18]。脂質(zhì)組學是代謝組學的一個分支，近年來基于質(zhì)譜的脂質(zhì)組學分析擴大了對糖尿病并發(fā)癥中脂質(zhì)代謝紊亂的認識。在細胞水平的研究中，高濃度的棕櫚酸飽和脂肪酸可以破壞感覺神經(jīng)元線粒體的運輸，改變線粒體生物能量的生成[19]。Freeman等[11]采用GC-MS的方法，發(fā)現(xiàn)STZ誘導的糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)組織中出現(xiàn)了明顯的脂代謝紊亂，相對于健康大鼠，糖尿病大鼠的坐骨神經(jīng)組織中棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、二十烷酸(20∶0)含量顯著降低。為了進一步全面表征其脂質(zhì)譜，該團隊進一步開展了基于LC-MS的脂質(zhì)組學研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)的397個非極性代謝物中，有257個的含量(64.7%)發(fā)生了顯著改變，其中改變最明顯的脂質(zhì)為三酰甘油類。這些脂質(zhì)成分的改變呈現(xiàn)出一種脂肪鏈碳鏈長度依賴的現(xiàn)象，碳鏈相對較短的脂質(zhì)在糖尿病組中減少，而較長鏈的脂類在糖尿病組中呈增加趨勢。在STZ誘導的糖尿病動物模型中，外周坐骨神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均觀察到了磷脂譜的變化[11，20- 21]。一項定量脂質(zhì)組學研究結(jié)果顯示，從糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)提取出的髓磷脂中表現(xiàn)出了異常的脂代謝變化，包括髓鞘飽和脂肪酸的蓄積[22]。研究還發(fā)現(xiàn)不同糖尿病微血管病變組織(如神經(jīng)、視網(wǎng)膜、腎臟)中的脂質(zhì)譜改變趨勢不同，總體的趨勢是神經(jīng)組織的大部分脂質(zhì)增加，而視網(wǎng)膜大部分脂質(zhì)減少，腎臟中除了甘油磷脂以外，其他脂類物質(zhì)變化的方向與周圍神經(jīng)相似。有研究發(fā)現(xiàn)，DPN大鼠的血清代謝譜較正常大鼠發(fā)生明顯變化，血清中多個脂質(zhì)成分含量顯著升高，并與周圍神經(jīng)小纖維病變有關(guān)[23]。人群研究中亦發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者中三酰甘油水平升高與小的無髓神經(jīng)纖維丟失有關(guān)，高三酰甘油血癥是增加DPN風險的獨立危險因素[17]。另外，脂質(zhì)代謝紊亂的程度在不同的周圍神經(jīng)組織中不盡相同。例如，脂質(zhì)代謝紊亂在遠端坐骨神經(jīng)組織中最為明顯，但在背根神經(jīng)節(jié)、腹腔神經(jīng)節(jié)中卻不明顯。盡管目前代謝組學領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)提供了更多脂質(zhì)代謝與DPN相關(guān)的證據(jù)，但其具體機制以及如何應(yīng)用仍需進一步的研究探索。

高血糖引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝異常

糖尿病可以導致大腦結(jié)構(gòu)改變和認知功能損害，可由認知功能障礙逐漸發(fā)展為不可逆性癡呆。糖尿病相關(guān)認知功能減退是糖尿病導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，但其發(fā)病機制仍不清楚。針對高血糖的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，代謝組學分析也有一些新的發(fā)現(xiàn)。

一項基于1H-NMR的代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導的糖尿病大鼠海馬內(nèi)的乳酸水平隨病程而增加，STZ給藥后8周較正常對照大鼠增加了30%，12周后增加了2倍，乳酸脫氫酶A的mRNA水平、蛋白水平和酶的活性均顯著上調(diào)，提示糖酵解過程增強；與此同時，多數(shù)TCA循環(huán)的中間代謝物或產(chǎn)物水平也降低[24]。該研究結(jié)果提示，糖尿病大鼠海馬組織糖酵解過程增強，TCA循環(huán)活性降低，與糖尿病大鼠的認知功能損害有關(guān)。一項高脂飲食聯(lián)合STZ誘導的2型糖尿病大鼠模型的GC-MS代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的海馬組織內(nèi)檸檬酸水平較健康大鼠明顯降低，乳酸、5-磷酸核糖、5-磷酸木酮糖和糖醇水平明顯升高，丙酮酸減少和乳酸增加提示大量的丙酮酸生成了乳酸，進而可能影響了TCA循環(huán)的底物[25]。線粒體的主要功能是通過TCA循環(huán)、電子傳遞鏈和氧化磷酸化生成ATP，作為細胞能量的主要來源。在饑餓等特定條件下，酮體和脂肪酸也可以補充能量。人體25%以上的葡萄糖在腦組織中代謝產(chǎn)生能量，能量代謝障礙會對大腦認知功能產(chǎn)生不良影響[26]。糖尿病大鼠腦組織中葡萄糖和乳酸濃度顯著升高，提示糖酵解過程增強，而TCA循環(huán)中間產(chǎn)物改變，ATP水平降低，提示了在高血糖時腦組織中能量代謝底物利用、轉(zhuǎn)化障礙，從而引起能量代謝障礙，大腦能量耗竭，最終導致神經(jīng)功能下降[27]。

在糖尿病小鼠的海馬組織也存在類似的變化，比如，乳酸明顯升高，同時琥珀酸、檸檬酸等TCA循環(huán)中間代謝物減少，谷氨酰胺水平升高，谷氨酸和γ-氨基丁酸水平降低，提示糖尿病相關(guān)認知能力下降可能與能量代謝改變、谷氨酰胺/谷氨酸在海馬區(qū)代謝異常有關(guān)[28]。與野生型小鼠相比，認知功能下降的db/db糖尿病小鼠腦組織中乳酸、谷氨酰胺和牛磺酸水平升高，提示糖尿病認知功能障礙與大腦無氧糖酵解增強、TCA循環(huán)障礙和谷氨酸/谷氨酰胺-γ氨基丁酸循環(huán)代謝紊亂有關(guān)[29]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了尿液中煙酸酰胺、焦谷氨酸、鞘氨醇、5-羥基-L-色氨酸4種代謝物可以作為糖尿病小鼠認知功能障礙前期的生物標志物，通路富集結(jié)果表明，這些代謝物主要涉及的代謝通路包括煙酸和煙酰胺代謝、谷胱甘肽代謝、色氨酸代謝和鞘脂代謝[30]。

許多研究都觀察到，在糖尿病狀態(tài)下，大腦不同的區(qū)域發(fā)生了不同的代謝紊亂，比如糖尿病小鼠的小腦、海馬和紋狀體的代謝譜與野生型的小鼠相比較而言差異最大，大腦皮層的不同區(qū)域也有一定差異[29]。另一項研究也發(fā)現(xiàn)，STZ 誘導的1型糖尿病大鼠腦組織中，不同的大腦區(qū)域存在特異性的代謝改變，其中包括了能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)、膜代謝和滲透調(diào)節(jié)[26]?？傮w上，相對于其他大腦區(qū)域，海馬區(qū)的代謝異常對糖尿病認知功能損害的關(guān)聯(lián)性更為密切。無論是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域，還是不同的周圍神經(jīng)組織中，既存在共同的代謝狀態(tài)改變，也存在著各自的組織代謝特異性。繼發(fā)于高血糖引起的多個代謝途徑損傷后，不同的神經(jīng)組織也可能發(fā)生不同的反應(yīng)、變化，從而導致不同神經(jīng)組織的代謝譜具有一定的區(qū)別。

評價與展望

糖尿病是涉及多系統(tǒng)病理變化的復雜綜合征，高血糖引起多個方面的代謝紊亂，對周圍神經(jīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)的損傷。目前，代謝組學相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，長期高血糖可以引起TCA循環(huán)異常、氨基酸代謝障礙、脂質(zhì)代謝紊亂以及其他多種代謝途徑的異常。這些代謝異常與神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)損害和功能改變密切相關(guān)。然而，針對代謝組學層面發(fā)現(xiàn)的大量的生物學信息和相關(guān)代謝通路，還需通過更多深入的研究進行驗證。而且，代謝組學僅提供了代謝物類別和含量層面的信息，其背后代謝物水平升高或降低的原因仍需要通過其他手段進行確認。某個或某類代謝物的濃度異常可能是由于多種原因引起的。因此，樣本整體代謝譜的改變對于推測病理生理過程具有重要價值，但其代表的生物學意義仍需謹慎解釋和驗證。盡管如此，代謝組學作為一種高通量的篩選和發(fā)現(xiàn)手段，可以為在細胞、組織、動物模型中進一步的分子機制研究提供方向。代謝產(chǎn)物是環(huán)境與基因、蛋白質(zhì)相互作用的下游最終產(chǎn)物之一。研究者還可以進行多組學的關(guān)聯(lián)分析，對糖尿病狀態(tài)下神經(jīng)病變的多種病理生理特點、過程進行更為全面的了解。綜上，代謝組學可以為探索糖尿病神經(jīng)病變的病理生理機制、早期診斷、治療方式提供更多的線索。