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    代謝組學在糖尿病神經(jīng)病變研究中的應(yīng)用和進展

    2022-12-29 08:52:45梁曉春
    中國醫(yī)學科學院學報 2022年2期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)病代謝物組學

    張 倩,宋 瑋,梁曉春

    中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 1中醫(yī)科 2醫(yī)學科學研究中心,北京 100730

    糖尿病是導致全球人口死亡率增加的主要疾病之一,可以引起多種慢性并發(fā)癥,其中糖尿病神經(jīng)病變在臨床上較為常見,可累及中樞神經(jīng)、周圍神經(jīng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)。糖尿病是一種代謝性疾病,可引起機體的整體代謝紊亂,加速神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變,導致神經(jīng)損傷。代謝組學作為系統(tǒng)生物學中極為重要的研究方法,可以提供細胞、組織、體液等生物樣本的整體代謝信息。代謝物的產(chǎn)生和變化受基因和環(huán)境的共同影響,較基因組學和蛋白質(zhì)組學而言,代謝組學可以更為直接和靈敏地反映機體自身的變化情況以及環(huán)境對機體的影響,可為疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等提供更多的信息。目前已有大量文獻報道了糖尿病前期或糖尿病的代謝組學研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)無論是1型糖尿病還是2型糖尿病,均可引起氨基酸[1]、脂質(zhì)[2]、嘌呤[3]等多種代謝物的代謝紊亂,涉及多種代謝通路。代謝紊亂目前已被證明與糖尿病慢性并發(fā)癥的形成有關(guān)[4- 5]。利用代謝組學技術(shù)研究糖尿病神經(jīng)病變,有助于理解神經(jīng)系統(tǒng)在高血糖條件下的各種生理病理過程、整體代謝變化,闡釋其發(fā)病機制,并挖掘潛在的生物標志物,為臨床診療提供更多科學依據(jù)。本文針對近5年來糖尿病神經(jīng)病變的代謝組學相關(guān)研究結(jié)果綜述如下。

    代謝組學技術(shù)介紹

    代謝組學研究方法可以定量或半定量地檢測各類生物樣本中內(nèi)源性小分子(通常相對分子質(zhì)量為100~1000)的變化情況,最常用的技術(shù)平臺包括核磁共振 (nuclear magnetic resonance,NMR)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用兩種。其中色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)又根據(jù)樣品分離原理的不同,主要分為液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography coupled with mass spectrometry,LC-MS)和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography coupled with mass spectrometry,GC-MS)?;诤舜诺拇x組學方法樣品前處理簡單,但靈敏度較差,可能無法檢測到一些含量較低的代謝物[5];而基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學方法盡管樣本前處理需要更多步驟,但由于其靈敏度高,檢測到的代謝物數(shù)目更多,因此目前應(yīng)用更為廣泛[6]。

    此外,根據(jù)研究目的或?qū)ο蟮牟煌?,代謝組學又包括靶向代謝組學與非靶向代謝組學。其中,非靶向代謝組學又常稱為代謝物全譜分析,這種方法無差別地檢測生物樣本中盡可能多的代謝物,結(jié)合代謝物鑒定和多元統(tǒng)計分析,有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標志物[5,7]。但非靶向技術(shù)只能提供代謝物的相對含量信息,無法獲得某一代謝物的準確含量。靶向代謝組學檢測對象是研究者感興趣的一類或幾類代謝物,通常包括幾十至幾百個代謝物不等。借助靶向的方法,研究者可以側(cè)重于某些特定代謝途徑,或者某類代謝物,且在一定范圍內(nèi)對代謝物進行絕對定量分析[5- 6]。因此,可根據(jù)研究對象、目的的不同選擇不同方法。也有很多研究將二者結(jié)合起來,先通過非靶向的方法尋找到可能的差異代謝物或代謝通路,進而結(jié)合靶向方法進一步驗證。這些研究方法已廣泛應(yīng)用于糖尿病研究領(lǐng)域,可以為糖尿病神經(jīng)病變等并發(fā)癥研究提供新的技術(shù)手段,尋找更多線索。

    高血糖引起周圍神經(jīng)系統(tǒng)的代謝改變

    糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN),尤其是遠端多發(fā)性對稱性多神經(jīng)病病變(distal symmetric polyneuropathy,DSPN)是糖尿病神經(jīng)病變最常見的一種類型,可以表現(xiàn)為遠端感覺障礙或神經(jīng)病理性疼痛,是引起足部潰瘍、非創(chuàng)傷性截肢的主要原因[8],也增加了糖尿病患者的病死率[9]。以往研究發(fā)現(xiàn),DPN形成與多元醇旁路激活、蛋白非酶糖基化、氧化應(yīng)激、炎癥、神經(jīng)營養(yǎng)障礙等多方面因素有關(guān),但目前具體病理生理機制仍不清楚。近年來,代謝組學研究對DPN的代謝紊亂過程、病理機制、生物學標志物等進行了進一步的探索。

    三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)是線粒體產(chǎn)生能量的主要途徑,與脂代謝、氨基酸代謝等途徑密切相關(guān)。TCA循環(huán)在維持周圍神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)中起著重要作用。Rojas等[10]對鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的1型糖尿病小鼠進行了連續(xù)數(shù)月的縱向研究,使用基于質(zhì)譜法(MS)的非靶向代謝組學方法,檢測了坐骨神經(jīng)中代謝物的變化和血清中氨基酸的變化。研究發(fā)現(xiàn),周圍感覺神經(jīng)功能障礙和皮內(nèi)纖維減少發(fā)生在STZ給藥后22周,糖尿病小鼠在12、22周出現(xiàn)了早期的TCA 循環(huán)異常。經(jīng)過與正常對照小鼠對比發(fā)現(xiàn),12周后神經(jīng)組織中的山梨醇和L-乳酸水平升高;而血清支鏈氨基酸包括纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的含量顯著增加;隨著糖尿病的進展,酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、組氨酸、丙氨酸和脯氨酸水平也逐漸上升。提示在長期高血糖條件下,周圍神經(jīng)組織的TCA循環(huán)發(fā)生了異常,代謝底物向一些代償途徑轉(zhuǎn)移,伴隨著血清的支鏈氨基酸升高,與皮膚感覺神經(jīng)纖維丟失、DPN的發(fā)生和進展有關(guān)。在Freeman等[11]的研究中,糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中6個TCA循環(huán)相關(guān)的酶發(fā)生了改變,在長期高血糖的狀態(tài)下,坐骨神經(jīng)中葡萄糖的利用、能量代謝存在明顯障礙。Hinder等[12]采用基于LC-MS的靶向代謝組學技術(shù),對2型糖尿病小鼠腓神經(jīng)、坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)中的糖酵解和TCA循環(huán)代謝產(chǎn)物進行了定量分析,發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的腓神經(jīng)和坐骨神經(jīng)中的糖酵解中間產(chǎn)物(如葡萄糖- 6-磷酸,果糖- 6-磷酸,3-磷酸甘油酸,2-磷酸甘油酸等)消耗,腓神經(jīng)、坐骨神經(jīng)和DRG中檸檬酸和異檸檬酸TCA循環(huán)中間產(chǎn)物減少。從細胞層面,高糖可能引起神經(jīng)元能量代謝相關(guān)代謝物的變化,比如高糖培養(yǎng)條件下神經(jīng)細胞PC12出現(xiàn)了細胞內(nèi)的乳酸減少、細胞外的乳酸增加,琥珀酸和磷酸肌酸含量增加,均提示出現(xiàn)了能量代謝異常[13]。此外,高糖引起支鏈氨基酸(異亮氨酸和纈氨酸)合成谷氨酸的作用增強。一項針對體外神經(jīng)細胞的代謝組學研究結(jié)果提示,高糖導致包括能量代謝、氨基酸代謝等在內(nèi)的一系列的代謝異常,從而促進神經(jīng)元死亡[13]。

    源自人群的研究也發(fā)現(xiàn),TCA循環(huán)改變可能與糖尿病神經(jīng)病變有關(guān)。2019年Mathew等[14]在一項血漿靶向代謝組學研究中對1型糖尿病患者和健康對照者的心臟自主神經(jīng)功能進行了3年的隨訪,探索血漿TCA循環(huán)和氨基酸代謝產(chǎn)物與心臟自主神經(jīng)病變的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),血漿基線時的富馬酸升高、氨基酸代謝物天冬酰胺和谷氨酰胺降低均與心臟自主神經(jīng)功能參數(shù)(反映心率變異程度的R-R間期標準差)異常相關(guān);經(jīng)過調(diào)整糖化血紅蛋白、體重指數(shù)、血脂、尿蛋白等參數(shù)后,血漿中的谷氨酰胺和鳥氨酸水平也仍然與心臟自主神經(jīng)病變的進展有關(guān)(更低的R-R間期標準差)。結(jié)果提示,TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物蓄積與心臟自主神經(jīng)功能呈負相關(guān),推測TCA循環(huán)的改變很可能進一步驅(qū)動了蛋白翻譯后修飾、與受體的結(jié)合、氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)等。TCA循環(huán)異常使代謝底物偏離正常的代謝途徑,從而進入一些替代的代謝途徑,比如神經(jīng)組織葡萄糖超負荷,激活山梨醇旁路途徑,導致細胞滲透壓增高,同時又可誘導氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等,從而導致神經(jīng)損害。但尚不能確定TCA循環(huán)中哪些底物的變化與血清支鏈氨基酸之間的反應(yīng)過程,血清支鏈氨基酸升高與神經(jīng)損傷之間的關(guān)聯(lián)和具體機制亦不能完全明確。

    脂質(zhì)代謝越來越多的證據(jù)表明,除了長期高血糖以外,脂質(zhì)代謝紊亂也是促進糖尿病神經(jīng)病變形成的重要因素[15- 18]。脂質(zhì)組學是代謝組學的一個分支,近年來基于質(zhì)譜的脂質(zhì)組學分析擴大了對糖尿病并發(fā)癥中脂質(zhì)代謝紊亂的認識。在細胞水平的研究中,高濃度的棕櫚酸飽和脂肪酸可以破壞感覺神經(jīng)元線粒體的運輸,改變線粒體生物能量的生成[19]。Freeman等[11]采用GC-MS的方法,發(fā)現(xiàn)STZ誘導的糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)組織中出現(xiàn)了明顯的脂代謝紊亂,相對于健康大鼠,糖尿病大鼠的坐骨神經(jīng)組織中棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、二十烷酸(20∶0)含量顯著降低。為了進一步全面表征其脂質(zhì)譜,該團隊進一步開展了基于LC-MS的脂質(zhì)組學研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),坐骨神經(jīng)的397個非極性代謝物中,有257個的含量(64.7%)發(fā)生了顯著改變,其中改變最明顯的脂質(zhì)為三酰甘油類。這些脂質(zhì)成分的改變呈現(xiàn)出一種脂肪鏈碳鏈長度依賴的現(xiàn)象,碳鏈相對較短的脂質(zhì)在糖尿病組中減少,而較長鏈的脂類在糖尿病組中呈增加趨勢。在STZ誘導的糖尿病動物模型中,外周坐骨神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均觀察到了磷脂譜的變化[11,20- 21]。一項定量脂質(zhì)組學研究結(jié)果顯示,從糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)提取出的髓磷脂中表現(xiàn)出了異常的脂代謝變化,包括髓鞘飽和脂肪酸的蓄積[22]。研究還發(fā)現(xiàn)不同糖尿病微血管病變組織(如神經(jīng)、視網(wǎng)膜、腎臟)中的脂質(zhì)譜改變趨勢不同,總體的趨勢是神經(jīng)組織的大部分脂質(zhì)增加,而視網(wǎng)膜大部分脂質(zhì)減少,腎臟中除了甘油磷脂以外,其他脂類物質(zhì)變化的方向與周圍神經(jīng)相似。有研究發(fā)現(xiàn),DPN大鼠的血清代謝譜較正常大鼠發(fā)生明顯變化,血清中多個脂質(zhì)成分含量顯著升高,并與周圍神經(jīng)小纖維病變有關(guān)[23]。人群研究中亦發(fā)現(xiàn),2型糖尿病患者中三酰甘油水平升高與小的無髓神經(jīng)纖維丟失有關(guān),高三酰甘油血癥是增加DPN風險的獨立危險因素[17]。另外,脂質(zhì)代謝紊亂的程度在不同的周圍神經(jīng)組織中不盡相同。例如,脂質(zhì)代謝紊亂在遠端坐骨神經(jīng)組織中最為明顯,但在背根神經(jīng)節(jié)、腹腔神經(jīng)節(jié)中卻不明顯。盡管目前代謝組學領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)提供了更多脂質(zhì)代謝與DPN相關(guān)的證據(jù),但其具體機制以及如何應(yīng)用仍需進一步的研究探索。

    高血糖引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝異常

    糖尿病可以導致大腦結(jié)構(gòu)改變和認知功能損害,可由認知功能障礙逐漸發(fā)展為不可逆性癡呆。糖尿病相關(guān)認知功能減退是糖尿病導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變,但其發(fā)病機制仍不清楚。針對高血糖的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害,代謝組學分析也有一些新的發(fā)現(xiàn)。

    一項基于1H-NMR的代謝組學研究發(fā)現(xiàn),STZ誘導的糖尿病大鼠海馬內(nèi)的乳酸水平隨病程而增加,STZ給藥后8周較正常對照大鼠增加了30%,12周后增加了2倍,乳酸脫氫酶A的mRNA水平、蛋白水平和酶的活性均顯著上調(diào),提示糖酵解過程增強;與此同時,多數(shù)TCA循環(huán)的中間代謝物或產(chǎn)物水平也降低[24]。該研究結(jié)果提示,糖尿病大鼠海馬組織糖酵解過程增強,TCA循環(huán)活性降低,與糖尿病大鼠的認知功能損害有關(guān)。一項高脂飲食聯(lián)合STZ誘導的2型糖尿病大鼠模型的GC-MS代謝組學研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠的海馬組織內(nèi)檸檬酸水平較健康大鼠明顯降低,乳酸、5-磷酸核糖、5-磷酸木酮糖和糖醇水平明顯升高,丙酮酸減少和乳酸增加提示大量的丙酮酸生成了乳酸,進而可能影響了TCA循環(huán)的底物[25]。線粒體的主要功能是通過TCA循環(huán)、電子傳遞鏈和氧化磷酸化生成ATP,作為細胞能量的主要來源。在饑餓等特定條件下,酮體和脂肪酸也可以補充能量。人體25%以上的葡萄糖在腦組織中代謝產(chǎn)生能量,能量代謝障礙會對大腦認知功能產(chǎn)生不良影響[26]。糖尿病大鼠腦組織中葡萄糖和乳酸濃度顯著升高,提示糖酵解過程增強,而TCA循環(huán)中間產(chǎn)物改變,ATP水平降低,提示了在高血糖時腦組織中能量代謝底物利用、轉(zhuǎn)化障礙,從而引起能量代謝障礙,大腦能量耗竭,最終導致神經(jīng)功能下降[27]。

    在糖尿病小鼠的海馬組織也存在類似的變化,比如,乳酸明顯升高,同時琥珀酸、檸檬酸等TCA循環(huán)中間代謝物減少,谷氨酰胺水平升高,谷氨酸和γ-氨基丁酸水平降低,提示糖尿病相關(guān)認知能力下降可能與能量代謝改變、谷氨酰胺/谷氨酸在海馬區(qū)代謝異常有關(guān)[28]。與野生型小鼠相比,認知功能下降的db/db糖尿病小鼠腦組織中乳酸、谷氨酰胺和牛磺酸水平升高,提示糖尿病認知功能障礙與大腦無氧糖酵解增強、TCA循環(huán)障礙和谷氨酸/谷氨酰胺-γ氨基丁酸循環(huán)代謝紊亂有關(guān)[29]。另外,有研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了尿液中煙酸酰胺、焦谷氨酸、鞘氨醇、5-羥基-L-色氨酸4種代謝物可以作為糖尿病小鼠認知功能障礙前期的生物標志物,通路富集結(jié)果表明,這些代謝物主要涉及的代謝通路包括煙酸和煙酰胺代謝、谷胱甘肽代謝、色氨酸代謝和鞘脂代謝[30]。

    許多研究都觀察到,在糖尿病狀態(tài)下,大腦不同的區(qū)域發(fā)生了不同的代謝紊亂,比如糖尿病小鼠的小腦、海馬和紋狀體的代謝譜與野生型的小鼠相比較而言差異最大,大腦皮層的不同區(qū)域也有一定差異[29]。另一項研究也發(fā)現(xiàn),STZ 誘導的1型糖尿病大鼠腦組織中,不同的大腦區(qū)域存在特異性的代謝改變,其中包括了能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)、膜代謝和滲透調(diào)節(jié)[26]??傮w上,相對于其他大腦區(qū)域,海馬區(qū)的代謝異常對糖尿病認知功能損害的關(guān)聯(lián)性更為密切。無論是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域,還是不同的周圍神經(jīng)組織中,既存在共同的代謝狀態(tài)改變,也存在著各自的組織代謝特異性。繼發(fā)于高血糖引起的多個代謝途徑損傷后,不同的神經(jīng)組織也可能發(fā)生不同的反應(yīng)、變化,從而導致不同神經(jīng)組織的代謝譜具有一定的區(qū)別。

    評價與展望

    糖尿病是涉及多系統(tǒng)病理變化的復雜綜合征,高血糖引起多個方面的代謝紊亂,對周圍神經(jīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)的損傷。目前,代謝組學相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),長期高血糖可以引起TCA循環(huán)異常、氨基酸代謝障礙、脂質(zhì)代謝紊亂以及其他多種代謝途徑的異常。這些代謝異常與神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)損害和功能改變密切相關(guān)。然而,針對代謝組學層面發(fā)現(xiàn)的大量的生物學信息和相關(guān)代謝通路,還需通過更多深入的研究進行驗證。而且,代謝組學僅提供了代謝物類別和含量層面的信息,其背后代謝物水平升高或降低的原因仍需要通過其他手段進行確認。某個或某類代謝物的濃度異常可能是由于多種原因引起的。因此,樣本整體代謝譜的改變對于推測病理生理過程具有重要價值,但其代表的生物學意義仍需謹慎解釋和驗證。盡管如此,代謝組學作為一種高通量的篩選和發(fā)現(xiàn)手段,可以為在細胞、組織、動物模型中進一步的分子機制研究提供方向。代謝產(chǎn)物是環(huán)境與基因、蛋白質(zhì)相互作用的下游最終產(chǎn)物之一。研究者還可以進行多組學的關(guān)聯(lián)分析,對糖尿病狀態(tài)下神經(jīng)病變的多種病理生理特點、過程進行更為全面的了解。綜上,代謝組學可以為探索糖尿病神經(jīng)病變的病理生理機制、早期診斷、治療方式提供更多的線索。

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