非洲豬瘟病毒入侵細(xì)胞機(jī)制的研究進(jìn)展

彭國(guó)瑞，鄒興啟，徐 嫄，徐小艾，朱元源，趙啟祖，劉業(yè)兵

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起豬的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。ASFV可以感染家豬、野豬和鈍緣蜱等。自2018年8月遼寧省報(bào)告我國(guó)首例非洲豬瘟疫情[1]以來(lái)，非洲豬瘟已給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。到目前為止，針對(duì)ASFV還沒(méi)有有效的疫苗和抗病毒策略。ASFV是一種有囊膜雙鏈DNA病毒，粒子直徑約250 nm，呈正二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，中央是包含基因組的核心結(jié)構(gòu)，被一層含有多種蛋白成分的核殼包裹，緊接著向外延伸，分別是內(nèi)脂膜，二十面體蛋白衣殼和最外層的外脂膜[3]。巨噬細(xì)胞是ASFV感染的主要靶細(xì)胞，體外經(jīng)適應(yīng)后可在PK15、Vero細(xì)胞和其他細(xì)胞上生長(zhǎng)[4]，病毒通過(guò)吸附、穿入和脫殼在細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制、組裝及子代病毒顆粒的釋放。本文就ASFV入侵細(xì)胞的有關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 病毒的吸附

1.1 受體介導(dǎo)的吸附 一般認(rèn)為病毒顆粒感染細(xì)胞的首要條件是吸附細(xì)胞表面的受體。Alcamí A等[5]通過(guò)定量電子顯微鏡形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ASFV在感染的早期通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入Vero細(xì)胞。之后，又用3H標(biāo)記的ASFV與細(xì)胞結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)膜上存在飽和結(jié)合位點(diǎn)，從而使ASFV能夠在Vero細(xì)胞中啟動(dòng)生產(chǎn)性感染。利用相同的方法，對(duì)于天然宿主巨噬細(xì)胞，病毒與細(xì)胞特定的飽和部位結(jié)合，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞[6]。在平衡狀態(tài)下，結(jié)合數(shù)據(jù)Scatchard分析表明，每個(gè)細(xì)胞大約有104個(gè)細(xì)胞受體位點(diǎn)，解離常數(shù)(Kd)為70 pM[7]。通過(guò)ASFV與非易感動(dòng)物的巨噬細(xì)胞相互作用試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ASFV顆?？梢岳梅秋柡徒Y(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)進(jìn)入兔巨噬細(xì)胞，并能夠合成一些早期病毒蛋白，但病毒DNA合成沒(méi)有發(fā)生，病毒復(fù)制被終止，提示這些細(xì)胞中不產(chǎn)生生產(chǎn)性感染，可能與缺乏特異性受體有關(guān)，并在其他不易感動(dòng)物的巨噬細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的流產(chǎn)感染[8]。

1.2 病毒上的粘附蛋白 用非離子洗滌劑處理ASFV顆粒，釋放出蛋白p12(p17經(jīng)巰基乙醇處理后)能夠與Vero細(xì)胞結(jié)合，不能與非洲豬瘟不易感的細(xì)胞結(jié)合，并且這種結(jié)合能夠被病毒顆粒特異性的阻斷，由此認(rèn)為p12作為粘附蛋白參與細(xì)胞受體的識(shí)別[9]。然而，盡管通過(guò)自然感染和接種滅活病毒或重組蛋白p12的動(dòng)物，可以誘導(dǎo)出針對(duì)p12蛋白的特異性抗體，但這些抗血清不能抑制病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合或中和病毒的傳染性[10]。此外，位于病毒顆粒類脂外膜的結(jié)構(gòu)蛋白p54、p30能夠與豬肺泡巨噬細(xì)胞結(jié)合，用康復(fù)期豬或用重組p54或p30免疫豬獲得的抗體，能夠特異性的抑制這些蛋白與細(xì)胞的結(jié)合，同時(shí)，在易感細(xì)胞上p54和p30有著不同的飽和結(jié)合位點(diǎn)，且以劑量依賴的方式獨(dú)立地阻止病毒感染。用重組p54或p30蛋白的抗體，可以抑制病毒對(duì)易感細(xì)胞的附著或內(nèi)化。然而，對(duì)免疫后的豬攻毒并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)保護(hù)，病程也沒(méi)有改變。與此相反，用p54和p30蛋白組合免疫豬可以刺激產(chǎn)生對(duì)病毒的中和效應(yīng)，并極大地改變病程，從延遲發(fā)病到完全阻止病毒感染產(chǎn)生了不同程度的免疫保護(hù)。p54阻斷了病毒顆粒與巨噬細(xì)胞的特異性結(jié)合，而蛋白p30阻斷了病毒的內(nèi)化，二者都有助于抗體介導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)[11]。

1.3 細(xì)胞上的膜蛋白受體 目前，對(duì)于ASFV的細(xì)胞受體仍不明確。鑒于p12與病毒吸附Vero細(xì)胞相關(guān)，用不同的酶和凝集素處理細(xì)胞表面，其中有幾種蛋白酶能夠抑制p12與細(xì)胞的結(jié)合，但沒(méi)有糖苷酶或脂肪酶，因此推斷該細(xì)胞受體由蛋白質(zhì)組成，而沒(méi)有碳水化合物或脂類參與病毒的吸附；受體活性的恢復(fù)需要合成新的蛋白，而不是糖基化，因此，ASFV的受體是一種細(xì)胞表面的膜蛋白[12]。有學(xué)者就推測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD163可能是受體，用抗CD163的抗體作用巨噬細(xì)胞可以抑制ASFV，但對(duì)巨噬細(xì)胞上完全敲除CD163的豬，攻擊ASFV基因2型的Georgia 2007/1株后，敲除型豬和野生型豬都被感染，臨床癥狀、死亡率、病理或病毒血癥等都沒(méi)有差異；體外感染巨噬細(xì)胞試驗(yàn)也沒(méi)有差異[13]，這項(xiàng)研究排除了CD163在ASFV感染中的重要作用。

2 病毒的穿入

病毒的吸附穿入是一個(gè)能量依賴的過(guò)程，可以通過(guò)多種方式進(jìn)行；即便是同一種病毒也可以采用不同的內(nèi)吞方式，這取決于細(xì)胞的類型、病毒的多樣性和生長(zhǎng)條件。目前，對(duì)于ASFV進(jìn)入細(xì)胞的方式仍存在很多爭(zhēng)議，包括依賴液泡pH和溫度的受體介導(dǎo)內(nèi)吞[5]，或是通過(guò)網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)內(nèi)吞，還有人認(rèn)為除了受體介導(dǎo)內(nèi)吞外，病毒還可以同時(shí)以吞噬作用(phagocytosis)[3,14]或是大型胞飲(macropinocytosis)[4,15]進(jìn)入細(xì)胞。

2.1 網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞 Valdeira M L 等[16]利用電鏡研究ASFV與Vero早期相互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)病毒粒子附著在細(xì)胞表面后，被內(nèi)陷的凹窩包裹，由內(nèi)吞小體進(jìn)入細(xì)胞，最后出現(xiàn)在溶酶體中，并沒(méi)有出現(xiàn)在包被囊泡(Coated vesicles)中，也沒(méi)有見到病毒直接穿過(guò)質(zhì)膜的現(xiàn)象。與牛痘病毒(VV)不同，ASFV通過(guò)發(fā)動(dòng)蛋白依賴和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入豬巨噬細(xì)胞，強(qiáng)烈依賴pH，Bernardes C等[17]發(fā)現(xiàn)清除膽固醇或用膽固醇氧化酶處理的Vero細(xì)胞在結(jié)合或內(nèi)化病毒的能力上都沒(méi)有改變，但ASFV的融合和隨后的病毒復(fù)制卻被阻斷，因此，細(xì)胞膜中的膽固醇，而非脂筏或凹陷，是實(shí)現(xiàn)ASFV感染的必要條件。但是，Bruno Hernaez等[18]認(rèn)為網(wǎng)格蛋白覆蓋的凹窩成分Eps15為感染相關(guān)細(xì)胞因子，以及發(fā)動(dòng)蛋白GTPase活性、肌動(dòng)蛋白依賴的內(nèi)吞作用和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)活性等都參與了病毒的侵入[19]。

2.2 大型胞飲 Elena G Sa'chez等[15]將光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡結(jié)合，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)于Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的ASFV強(qiáng)毒株Ba71和強(qiáng)毒株E70可以引起細(xì)胞質(zhì)膜擾動(dòng)，起泡和褶皺。病毒粒子內(nèi)化依賴于肌動(dòng)蛋白重新組合、Na+/H+交換器的活性等典型的大胞飲內(nèi)吞機(jī)制的信號(hào)，而且病毒進(jìn)入細(xì)胞似乎直接刺激右旋糖酐攝取、肌動(dòng)蛋白極化和EGFR、PI3K-Akt、Pak1和Rac1的激活，而抑制這些重要的大胞飲調(diào)節(jié)因子，以及使用藥物乙基異丙基氨氯吡咪(EIPA)治療，可以顯著減少ASFV的進(jìn)入和感染[4]。但是，針對(duì)這觀點(diǎn)Bruno Hernaez 等發(fā)現(xiàn)Na+/H+離子通道抑制劑和肌動(dòng)蛋白聚合抑制沒(méi)有顯著改變ASFV感染，認(rèn)為大胞飲并不是ASFV的主要進(jìn)入途徑[18]。

2.3 巨噬細(xì)胞內(nèi)吞 Sameh Basta等[14]發(fā)現(xiàn)在病毒與細(xì)胞作用的過(guò)程中，二價(jià)陽(yáng)離子依賴活性特別重要，這與內(nèi)吞和內(nèi)涵體處理所需的微管組裝的病毒需求有關(guān)。肌動(dòng)蛋白依賴的內(nèi)吞作用和涉及微管活性的內(nèi)吞流通也密切相關(guān)，因此，認(rèn)為受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用不是病毒進(jìn)入感染宿主細(xì)胞M?的唯一方法，更像病毒是通過(guò)吞噬進(jìn)入細(xì)胞的。Germán Andrés等[3]則認(rèn)為ASFV通過(guò)巨噬細(xì)胞吞噬和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞兩種途徑進(jìn)入巨噬細(xì)胞。

3 在內(nèi)吞小體脫殼

ASFV感染的早期階段，病毒內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后一小時(shí)內(nèi)脫殼，首先涉及到外層衣殼層的脫落，隨后是病毒內(nèi)膜與內(nèi)吞小體的融合[15]，其中，內(nèi)吞小體的酸化對(duì)病毒的成功感染十分必要，逐步在低pH驅(qū)動(dòng)下內(nèi)吞小體分解[20]，再將裸的基因組核心釋放到細(xì)胞質(zhì)中。這一過(guò)程中由Rab蛋白和PIs協(xié)調(diào)的EE和LE隔間以及內(nèi)吞小體成熟通路的完整性發(fā)揮了核心作用[21]。病毒蛋白pE248R是病毒顆粒的晚期結(jié)構(gòu)成分，具有分子內(nèi)二硫鍵，氨基酸序列包含一個(gè)推定的肉豆蔻?；稽c(diǎn)和靠近其羧基末端的疏水跨膜區(qū)域，pE248R在感染過(guò)程中被肉豆蔻?；?，并與被感染細(xì)胞的膜部分結(jié)合成為一個(gè)完整的膜蛋白。pE199L是一個(gè)富含半胱氨酸完整的跨膜多肽，也具有分子內(nèi)二硫鍵。研究表明，pE199L和pE248R不是病毒組裝、釋放以及病毒與細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)吞所必需的，而是膜融合和病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞所必需的，缺少這兩個(gè)基因的突變毒株，早期和晚期基因表達(dá)將受到損害，感染性大幅降低[22]?？梢酝茢?，ASFV基因組進(jìn)入細(xì)胞依賴于由pE248R和pE199L組成的融合機(jī)制，病毒在細(xì)胞內(nèi)脫殼過(guò)程，這兩個(gè)蛋白發(fā)揮了與內(nèi)吞小體的融合作用[23]。

4 病毒的生物合成

一旦ASFV脫殼脫離了內(nèi)吞溶酶體復(fù)合體后，病毒就繞過(guò)成熟的溶酶體，包括自噬體-溶酶體傳遞，避免了被降解。然而，病毒的復(fù)制顯然還要依賴于某些溶酶體功能，即對(duì)丙胺敏感的活性是病毒所必需的，而長(zhǎng)春堿和亮肽酶素敏感的功能僅部分影響病毒的復(fù)制[14]。而且，病毒需要通過(guò)內(nèi)溶酶體、微管細(xì)胞骨架運(yùn)輸系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到生物合成的場(chǎng)所，已知的病毒編碼酶的合成、蛋白質(zhì)合成都發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)的不同位置，而病毒基因組復(fù)制在細(xì)胞核內(nèi)開始，而大部分的復(fù)制和組裝主要發(fā)生在細(xì)胞核周離散區(qū)域，即病毒工廠。在相關(guān)生物合成因子的研究方面，通過(guò)綠色熒光蛋白融合和MYC標(biāo)記蛋白的重疊試驗(yàn)結(jié)果表明，ASFV p37和p14蛋白具有核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性[24]。p14蛋白的作用是輸入到細(xì)胞核，p37蛋白在感染的早期階段存在于細(xì)胞核的局部，后期只在細(xì)胞質(zhì)中[25]，參與病毒DNA在細(xì)胞核內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)[26]。待病毒基因組和蛋白質(zhì)合成后組裝成子代病毒粒子，沿著微管被運(yùn)送到質(zhì)膜，在那里它們通過(guò)出芽或由肌動(dòng)蛋白推動(dòng)離開被感染的細(xì)胞，病毒的進(jìn)入和退出，都依賴于細(xì)胞骨架的各種成分[6]。與此同時(shí)，ASFV通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的通路誘導(dǎo)了感染細(xì)胞的凋亡[27]。

5 展 望

病毒進(jìn)入細(xì)胞的途徑和方式?jīng)Q定了病毒的趨向性和發(fā)病機(jī)制。ASFV作為一種重要的動(dòng)物傳染病原體，對(duì)其入侵的阻斷是預(yù)防和治療非洲豬瘟的重要研究目標(biāo)，對(duì)ASFV與宿主細(xì)胞相互作用的研究，可深入揭示病毒致病和機(jī)體免疫的機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)該病毒的新預(yù)防策略提供研究思路。但是，目前對(duì)ASFV入侵機(jī)制的了解仍然非常有限，特別是關(guān)于細(xì)胞受體、病毒穿入細(xì)胞的方式仍處于爭(zhēng)議之中，普遍認(rèn)為ASFV通過(guò)多種方式穿入細(xì)胞。同時(shí)，病毒與天然宿主巨噬細(xì)胞和適應(yīng)性Vero細(xì)胞的相互作用可能存在一定的區(qū)別。因此，進(jìn)一步揭示ASFV的宿主細(xì)胞受體、穿入細(xì)胞的方式以及脫殼機(jī)制的研究仍然是未來(lái)的研究方向，也具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。