肌萎縮側(cè)索硬化致病蛋白與自噬相關(guān)研究進(jìn)展

劉玥 朱瑜 江建香 江師師 徐仁伵

(1江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西 南昌 330006；2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部研究生院)

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是以上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷為特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性病中的一種，其預(yù)后較差，一般平均生存期為3～5年。目前僅有利魯唑及依達(dá)拉奉用于臨床治療〔1〕?，F(xiàn)今流行的致病學(xué)說(shuō)較多，諸如蛋白質(zhì)的異常積聚及毒性作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)損傷神經(jīng)元，神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突運(yùn)輸損害等〔2〕，其中較為主流的致病學(xué)說(shuō)為蛋白質(zhì)的異常積聚及毒性作用，由于眾多異常蛋白的累積，細(xì)胞離不開(kāi)自噬與泛素蛋白酶體降解途徑。泛素蛋白酶體系統(tǒng)主要是對(duì)于短壽命蛋白質(zhì)的降解，而自噬則優(yōu)先用于選擇性降解長(zhǎng)壽命的蛋白質(zhì)和損傷的細(xì)胞器。自噬是高度保守的分解代謝細(xì)胞通路，用于降解基礎(chǔ)水平的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器及病理?xiàng)l件下的病原體和蛋白質(zhì)聚集體〔3〕。本文對(duì)自噬過(guò)程及其與ALS相關(guān)致病蛋白的相互作用進(jìn)行綜述。

1 自噬概述

自噬的定義為在所有真核生物中保守的分解代謝過(guò)程。從調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的基本代謝功能到各種疾病，如衰老、癌癥、神經(jīng)退行性疾病和溶酶體病等，自噬已經(jīng)成為控制人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)點(diǎn)〔4〕。自噬的神經(jīng)保護(hù)作用源于其消除諸如α-突觸核蛋白或tau蛋白等致病蛋白的能力。然而，不同的致病蛋白可能影響自噬過(guò)程的不同類型和步驟。自噬功能紊亂已在多種疾病中被報(bào)道，包括神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)及ALS等〔5～8〕。自噬是一種有效的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，可積極促進(jìn)致病蛋白清除，但在某些情況下，其會(huì)成為這些蛋白質(zhì)毒性作用的靶點(diǎn)。當(dāng)致病蛋白直接干擾自噬細(xì)胞內(nèi)維持細(xì)胞功能的組成成分時(shí)，或當(dāng)自噬過(guò)程受到間接干擾時(shí)，這種對(duì)自噬系統(tǒng)的毒性可能是導(dǎo)致疾病的主要原因。因此，了解自噬的分子機(jī)制及過(guò)程對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展及治療都有一定作用。根據(jù)到溶酶體的物質(zhì)，自噬途徑在哺乳動(dòng)物中有3種類型的自噬。在巨自噬中，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)底物首先被困在雙膜囊泡(自噬體)中，然后與溶酶體融合，使底物完全降解。參與這一過(guò)程的基因和蛋白質(zhì)被稱為自噬相關(guān)基因和自噬相關(guān)蛋白〔9,10〕，在伴侶介導(dǎo)的自噬中，蛋白質(zhì)被胞質(zhì)中協(xié)同作用的伴侶蛋白識(shí)別，該伴侶蛋白將底物帶到溶酶體表面，使其在溶酶體表面進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。最后，在微自噬和內(nèi)質(zhì)體微自噬中，底物通過(guò)溶酶體和內(nèi)質(zhì)體膜內(nèi)陷而內(nèi)化〔11〕。因此，了解自噬過(guò)程及相關(guān)蛋白與自噬的關(guān)系，有助于通過(guò)干預(yù)或誘導(dǎo)自噬等手段，緩解疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，以達(dá)到一定的治療目的。

2 ALS中致病蛋白與自噬

ALS中存在多種蛋白異常積聚，如 Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)1、Tar DNA結(jié)合蛋白(TDP)-43、肉瘤融合/脂肪肉瘤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FUS/TLS)、9號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框72編碼蛋白(C9orf72)、囊泡相關(guān)蛋白(VAP)B等〔12,13〕。這些相關(guān)蛋白的基因突變或蛋白積聚在ALS的發(fā)病過(guò)程中均參與一定作用。

2.1Cu/Zn SOD1 SOD1基因突變是經(jīng)典的ALS致病模型。被損害抗氧化功能的SOD1突變可導(dǎo)致超氧化物的毒性積累〔14〕。目前Perera等〔15〕發(fā)現(xiàn)在ALS相關(guān)的SOD1或TDP-43突變體的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞中進(jìn)行強(qiáng)烈自噬誘導(dǎo)，如對(duì)SOD1G93A小鼠施用Rilmenidine(一種抗高血壓劑，與咪唑啉-1受體激動(dòng)劑可誘導(dǎo)自噬)可上調(diào)脊髓中的自噬和線粒體自噬，從而導(dǎo)致可溶性mtSOD1水平降低。同時(shí)，Rudnick等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)在表達(dá)突變型SOD1的ALS小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在疾病進(jìn)展早期形成含有泛素聚集體的大自噬體。研究者為了研究這種反應(yīng)是保護(hù)性的還是有害的，在小鼠體內(nèi)通過(guò)敲除Atg7(關(guān)鍵的自噬基因)，即Atg7cKO小鼠，發(fā)現(xiàn)敲除后的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)肌肉連接的結(jié)構(gòu)與功能缺陷。通過(guò)將Atg7cKO小鼠與mtSOD1小鼠模型雜交，發(fā)現(xiàn)自噬抑制加速了脛前肌早期神經(jīng)肌肉失神經(jīng)和后肢震顫的發(fā)生。然而，也發(fā)現(xiàn)Atg7cKO SOD1G93A雙突變小鼠的壽命延長(zhǎng)了。自噬抑制并不能阻止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，但它能減輕脊髓神經(jīng)間質(zhì)的膠質(zhì)炎癥，阻斷應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的激活。因此運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元自噬在疾病早期維持神經(jīng)肌肉的神經(jīng)支配，但最終以非細(xì)胞自主的方式促進(jìn)疾病的進(jìn)展〔16〕。

2.2TDP-43 TDP-43是一種核RNA結(jié)合蛋白，參與RNA加工的幾個(gè)方面，主動(dòng)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭工作〔17,18〕。在ALS與額顳葉癡呆(FTD)中，TDP-43被排除在細(xì)胞核之外，但這種細(xì)胞質(zhì)錯(cuò)誤定位在神經(jīng)元損傷或應(yīng)激中很常見(jiàn)〔19,20〕，TDP-43陽(yáng)性包涵體可能是諸如AD等神經(jīng)退行性病變的繼發(fā)病理特征〔21〕。Barmada等〔22〕開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種單細(xì)胞光學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)致病突變可縮短TDP-43的半衰期。刺激自噬可改善TDP-43清除和定位，并可提高攜帶TDP-43突變的小鼠原代神經(jīng)元、人類干細(xì)胞衍生神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。其次，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)TDP-43的水平和定位能決定神經(jīng)毒性，并表明自噬誘導(dǎo)通過(guò)直接作用于TDP-43清除來(lái)減輕神經(jīng)變性〔22〕。Wang等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素(一種依賴mTOR的自噬激活劑)在TDP-43陽(yáng)性泛素化包涵體(UBIs)為特征的FTLD-U小鼠模型的早期病理階段給藥，可挽救學(xué)習(xí)記憶障礙、腦缺血再灌注損傷及小鼠的運(yùn)動(dòng)功能異常，同樣伴隨著caspase-3水平降低和小鼠前額神經(jīng)元丟失減少。此外，病理后期的自噬激活也能改善運(yùn)動(dòng)功能，并伴有TDP-43陽(yáng)性UBIs的降低。該研究為自噬激活劑治療神經(jīng)退行性疾病奠定了基礎(chǔ)。

2.3FUS/TLS 有5%～10%ALS病例是家族性的，而SOD1、TDP-43、FUS突變占家族性ALS的30%左右〔24〕。FUS是一種廣泛表達(dá)的526氨基酸組成蛋白，由15個(gè)外顯子編碼，屬于多功能DNA/RNA結(jié)合蛋白的FET/TET家族，最初被發(fā)現(xiàn)作為人類癌癥融合癌基因的組成部分〔25,26〕。ALS與核RNA結(jié)合蛋白(RBP)的聚集相關(guān)，包括FUS。如何在健康的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中預(yù)防FUS聚集和神經(jīng)變性仍是無(wú)法回答的問(wèn)題。有研究通過(guò)使用ALS患者尸檢組織和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞衍生神經(jīng)元的組合來(lái)研究FUS突變對(duì)RBP穩(wěn)態(tài)的影響，結(jié)果顯示FUS的聚集傾向通常通過(guò)相互作用的RBP緩解，但當(dāng)FUS由于ALS突變而錯(cuò)誤定位于細(xì)胞質(zhì)時(shí)，這種緩沖會(huì)消失〔27〕。細(xì)胞質(zhì)中存在易聚集的FUS導(dǎo)致RBP穩(wěn)態(tài)失衡，加劇神經(jīng)變性。然而，使用小分子增強(qiáng)自噬減少細(xì)胞質(zhì)FUS，可恢復(fù)RBP穩(wěn)態(tài)并在體內(nèi)挽救神經(jīng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能。因此RBP穩(wěn)態(tài)的破壞在FUS-ALS中起關(guān)鍵作用，并可通過(guò)刺激自噬來(lái)治療。

2.4C9orf72 C9orf72中的GGGGCC(G4C2)重復(fù)擴(kuò)增是ALS和FTD常見(jiàn)的遺傳原因〔28,29〕。C9orf72 的核苷酸重復(fù)擴(kuò)增(NRE)導(dǎo)致這些疾病的致病機(jī)制包括C9orf72功能的喪失和由NRE編碼的毒性RNA和蛋白質(zhì)驅(qū)動(dòng)的C9orf72功能機(jī)制的獲得。這些機(jī)制與在患者和動(dòng)物模型中觀察到的幾種細(xì)胞缺陷(包括核質(zhì)運(yùn)輸缺陷和核應(yīng)激)有關(guān)〔30〕。Liu等〔31〕研究發(fā)現(xiàn)C9orf72是溶酶體靶向和降解CARM1所必需的，而精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(CARM)1是巨自噬/自噬和脂質(zhì)代謝的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子。在C9orf72缺乏的細(xì)胞中，包括來(lái)自ALS-FTD患者的細(xì)胞，CARM1異常積累，特別是在糖剝奪應(yīng)激下，可導(dǎo)致自噬和脂質(zhì)代謝失調(diào)。這些結(jié)果表明，C9orf72是營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激反應(yīng)中負(fù)反饋調(diào)控自噬溶酶體途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。有研究表明在C9orf72突變的 ALS/ FTD患者中，發(fā)現(xiàn)了p62在小腦、海馬和新皮質(zhì)中積聚，表明自噬受損〔32,33〕。p62與C9orf72相互作用，在C9orf72突變的患者衍生的成纖維細(xì)胞中檢測(cè)到p62水平升高。此外，在神經(jīng)元中C9orf72敲低后，自噬受損并且p62和TDP-43在聚集體中累積〔34,35〕。

2.5VAPB VAP蛋白是具有氨基末端主要精子蛋白(MSP)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的同源蛋白。其中VAPB是一種多功能蛋白，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體之間的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)肌肉接頭發(fā)育及神經(jīng)元軸突延伸。其中，VAPB突變可致家族性ALS。Lin等〔36〕、Wu等〔37〕研究表明VAPB的敲除誘導(dǎo)自噬蛋白Beclin1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3轉(zhuǎn)化和LC3斑片形成，而VAPB的過(guò)表達(dá)抑制了這些過(guò)程。VAPB對(duì)Beclin1的調(diào)控處于轉(zhuǎn)錄水平。此外，敲除VAPB可增加自噬通量，并促進(jìn)自噬底物p62和神經(jīng)退行性疾病蛋白的降解。Sentürk等〔38〕發(fā)現(xiàn)自噬-溶酶體降解需要有如VAPB等引起ALS的蛋白，VAP蛋白的喪失會(huì)導(dǎo)致酸度異常的溶酶體積累。其中VAP33突變體顯示出自噬小泡，尤其是自噬溶酶體的大量積累。由于VAP蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體系膜，并直接與脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白相互作用。這種束縛促進(jìn)高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的4-磷脂酰肌醇4-磷酸(PtdIns4P)的轉(zhuǎn)移，因此，VAP的丟失導(dǎo)致高爾基體中PtdIns4P的積累，從而強(qiáng)烈促進(jìn)自噬體的產(chǎn)生，這些自噬體沒(méi)有被適當(dāng)?shù)厮峄蔀楣δ苄匀苊阁w，從而損害了自身溶酶體的降解能力。

3 總 結(jié)

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是哺乳動(dòng)物最極化的細(xì)胞，其細(xì)胞活性高度依賴于有效的能量供應(yīng)、軸突小泡長(zhǎng)距離逆行運(yùn)輸及受損細(xì)胞器和異常蛋白聚集體的適當(dāng)清除等的協(xié)作。而在導(dǎo)致ALS及其相關(guān)疾病如FTD中的近40個(gè)遺傳因素中，包含了幾個(gè)基因編碼與自噬有關(guān)的蛋白質(zhì)，包括TBK1、泛素結(jié)合蛋白(SQSTM)1/p62、視神經(jīng)蛋白(OPTN)、泛醌蛋白(UBQLN)2、VCP和C9orf72的突變〔39〕。自噬過(guò)程無(wú)疑是中樞系統(tǒng)調(diào)節(jié)分解代謝及循環(huán)過(guò)程的重要機(jī)制之一。大量研究已經(jīng)證明了異常蛋白積聚于神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)程，因此，對(duì)于自噬的研究也成為治療ALS等相關(guān)疾病重要靶點(diǎn)。

目前，針對(duì)ALS的自噬研究機(jī)制表明，在實(shí)驗(yàn)性ALS背景下，由于干預(yù)措施及所采用的動(dòng)物模型不同，自噬水平的藥理學(xué)和遺傳學(xué)調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致與小鼠存活和疾病進(jìn)展不同甚至相反的后果。如利用雷帕霉素或觸發(fā)mTOR獨(dú)立自噬的藥物(即亞精胺和卡馬西平)治療TDP-43突變小鼠可防止疾病發(fā)展〔23,39〕。而在有些研究中表明對(duì)突變的SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠施用雷帕霉素會(huì)因細(xì)胞凋亡增強(qiáng)而加劇疾病進(jìn)展，或可能根本沒(méi)有影響〔40,41〕。通過(guò)給予海藻糖(該途徑的mTOR非依賴性誘導(dǎo)物)激活自噬可防止SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病〔42～44〕。在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性Atg7條件敲除小鼠(Atg7cKO)中，Atg7的丟失不足以引起這些小鼠的神經(jīng)變性。然而，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的靶向自噬導(dǎo)致影響選擇性肌肉連接的自發(fā)表型。Atg7cKO小鼠出現(xiàn)了與脛骨前肌早期ALS退化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配的神經(jīng)肌肉連接形態(tài)紊亂相關(guān)的電生理改變，這些結(jié)果揭示了自噬和蛋白質(zhì)穩(wěn)定連接在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元肌肉維持中的生理作用〔16,39〕。同時(shí)，已有研究報(bào)道了通過(guò)使用Atg7單倍體不足小鼠對(duì)重要自噬調(diào)節(jié)因子Becn1/Beclin1基因進(jìn)行基因消融，盡管會(huì)增加蛋白質(zhì)積聚，但仍能延長(zhǎng)ALS小鼠的壽命〔45〕。而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)果，與對(duì)照組相比，SOD1G127X和SOD1G93A小鼠的Becn1雜合子，發(fā)展出更具攻擊性的表型〔46〕。盡管出現(xiàn)了神經(jīng)肌肉連接受損，但上述的兩種實(shí)驗(yàn)小鼠均發(fā)現(xiàn)比相應(yīng)單倍體不足小鼠壽命有所延長(zhǎng)。在分子水平上發(fā)現(xiàn)，Atg7cKO SOD1 G93A小鼠顯示出預(yù)期的電生理和肌肉連接改變〔16〕，證實(shí)自噬是維持神經(jīng)肌肉連接完整性的關(guān)鍵過(guò)程。該研究證明，早期自噬是維持脆弱運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元肌肉連接的生理機(jī)制。相反，在晚期，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元自噬作為一種有害的機(jī)制發(fā)揮作用，可能通過(guò)細(xì)胞非自主機(jī)制加速ALS的進(jìn)展。表明在一定程度上與所用動(dòng)物模型的差異、受試藥物的非特異性、治療開(kāi)始的疾病進(jìn)展階段及該途徑在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中可能的不同作用有關(guān)。提示自噬活性可能影響ALS的進(jìn)展及靶向通路的特異性效應(yīng)應(yīng)該以一種時(shí)間和細(xì)胞特異性的方式進(jìn)行更詳細(xì)的研究，并盡可能與多種疾病參數(shù)進(jìn)行比較。

綜上，包括SOD1、TDP-43、FUS、C9orf72及VAPB等在內(nèi)的相關(guān)基因及蛋白均在一定程度上與自噬產(chǎn)生相互促進(jìn)或抑制作用，而ALS中自噬激活與抑制會(huì)因疾病不同階段甚至所屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同而產(chǎn)生不同作用。因此，在某些特定條件下研究促進(jìn)或抑制自噬或許會(huì)減緩疾病進(jìn)展，對(duì)ALS患者是一個(gè)較有效的保守治療方案。但目前自噬在ALS中的相關(guān)機(jī)制尚未完全明了，應(yīng)深入研究。