空心蓮子草內(nèi)生真菌多樣性研究

盧東升，任雨軒，周 營， 陳 陽

(1. 信陽師范學院 生命科學學院，河南 信陽 464000;2.信陽高級中學，河南 信陽 464000)

0 引言

空心蓮子草[Alternantheraphiloxeroides(Mart.)Griseb.]為莧科(Amaranthaceae)蓮子草屬(Alternanthera)多年生草本植物[1].其生態(tài)適應(yīng)性強，繁殖迅速，現(xiàn)已成為常見野生雜草，在我國華東、華中、華南及西南等20多個省、市、自治區(qū)均有分布.該種植物常形成單一的優(yōu)勢群落，陸生型排擠了本土植物的正常生長，危害當?shù)氐纳锒鄻有?，在農(nóng)田與農(nóng)作物爭奪陽光、水分、肥料以及生長空間，造成減產(chǎn)，影響農(nóng)田作業(yè)，同時，其群落內(nèi)部本土植物的生長空間受到限制.空心蓮子草在水生環(huán)境中生長迅速，覆蓋水域，堵塞水道，影響淡水養(yǎng)殖和農(nóng)田灌溉，成為世界公認的惡性雜草， 被列入國家環(huán)?？偩?003年公布的“中國第一批外來入侵生物名單”[2].人們對空心蓮子草的適應(yīng)性、入侵機制、對當?shù)刂参锶郝浣M成及植物多樣性的影響和對其種群擴散的防控等進行了大量研究[3,4].據(jù)何麗爛等[5]報道，鏈格孢菌(Alternariasp.)及尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為空心蓮子草的致病菌.周兵等[6]研究了鏈格孢菌(Alternariaalternata)不同菌株對空心蓮子草的致病性.結(jié)果，鏈格孢菌不同菌株的致病性有明顯不同.前人對紫莖澤蘭、豚草等入侵植物內(nèi)生真菌的生態(tài)功能進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)生真菌對宿主植物或入侵地其他植物的種子發(fā)芽有顯著影響.陳志誼等[7]以紫莖澤蘭不同菌屬的內(nèi)生真菌孢子液侵染不同植物的種子,觀察內(nèi)生真菌對植物種子發(fā)芽率的影響.實驗用炭疽菌(Colletotrichum)、鏈格孢菌屬(Alternaria)、炭角菌屬(Xylaria)、擬莖點霉屬(Phomopsis)等真菌菌株51個，測試的植物有紫莖澤蘭(Ageratinaadenophora)、土牛膝(Achyranthesaspera)、柳葉箬(Isachneglobosa)、鳳尾莧(Amaranthuscaudatus)、鈕子瓜(Zehneriamaysorensis)、何首烏(Polygonummultiflorum)、地桃花(Urena)、黃花稔(Sidaacuta)、黃葵(Abelmoschusmoschatus)等9種.結(jié)果，在所測試的9種植物中,鏈格孢菌能夠?qū)ζ渲械?種植物致病, 炭疽菌能夠?qū)?種植物致病,擬莖點霉可以使6種植物致病,炭角菌能夠?qū)?種植物致病.這說明，紫莖澤蘭內(nèi)生真菌中含有致病菌,當這些菌釋放出來時,能夠感染周邊部分植物并且降低了這些植物的種子發(fā)芽率,從而間接地增強了紫莖澤蘭的入侵力.TAN等[8]研究了豚草種子內(nèi)生真菌發(fā)酵液對豚草種子發(fā)芽的影響.結(jié)果顯示，供試的內(nèi)生真菌菌株的發(fā)酵液均不同程度地抑制豚草種子發(fā)芽.但內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理后的種子仍然保持較高程度的活力，不同內(nèi)生真菌發(fā)酵液處理后,有活力的種子維持在50%～87.5%之間,均高于(或等于)清水處理的種子,說明內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物只是抑制種子的發(fā)芽,但并不導致種子的腐爛和死亡.這些研究結(jié)果初步顯示種子攜帶的內(nèi)生真菌可能在豚草入侵生物學中發(fā)揮重要的作用.但未見有關(guān)空心蓮子草內(nèi)生真菌的報道.內(nèi)生真菌是存在于健康植物體內(nèi)的真菌種類，其對宿主植物的生長、發(fā)育、生理、生態(tài)以及對不良環(huán)境的抗性均有重要影響.因此，開展空心蓮子草內(nèi)生真菌的研究，有助于了解其入侵機制，對該草的防控及內(nèi)生真菌資源的利用具有重要意義.為此，于2017年7月至9月，對河南省信陽地區(qū)分布的空心蓮子草內(nèi)生真菌種類、分布及多樣性進行了研究.

1 材料與方法

1.1 標樣采集

在河南省信陽市選取5 個不同生境條件下的空心蓮子草樣地 (編號為 SY1、SY2、SY3、XYH、ZHL)，樣地情況見表1.選健康空心蓮子草植株，采集新鮮枝葉，裝入無菌紙塑料袋中，帶回實驗室備用，當天采集的材料當天完成植物組織的消毒及接種培養(yǎng).

表1 空心蓮子草5個樣地生境Tab. 1 The five sample plot habitats of Alternanthera philoxeroides

1.2 內(nèi)生真菌的分離與鑒定

參照文獻[9]對葉棲內(nèi)生真菌進行分離.

莖內(nèi)生真菌分離前，用自來水反復(fù)沖洗去除表面雜物，晾干表面水后將莖切成3 cm長的莖段，分別用75%乙醇、2%次氯酸鈉、75%乙醇消毒2、10、1 min，不同消毒劑消毒后均用無菌水沖洗3次，最后用無菌紙吸去表面水后將莖段切成 0.5 cm 短段.將莖段接入PSA平板培養(yǎng)基，放入28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d，當組織塊出現(xiàn)明顯菌落時，依據(jù)菌落形態(tài)特征挑取不同真菌頂端菌絲轉(zhuǎn)接至PSA 斜面培養(yǎng)基進行純化，25 ℃恒溫培養(yǎng).將純化后的真菌再次接入PSA平板培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，菌落滿皿后，誘導產(chǎn)孢.觀察記錄菌落、菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，參照文獻[10-12] 進行鑒定.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計內(nèi)生真菌在空心蓮子草組織內(nèi)的種數(shù)、不同組織中的定殖率、分離率，參照文獻[13]計算其多樣性指數(shù)、相似性系數(shù).聚類分析用SPSS19統(tǒng)計軟件，以不同組織及不同樣地內(nèi)生真菌種類組成、分離率、豐度、定殖率建立數(shù)據(jù)庫，經(jīng)系統(tǒng)聚類，按組間連接方法計算區(qū)間平方歐氏距離，構(gòu)建聚類樹形圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌種類及分布

本研究供試空心蓮子草健康組織774塊，經(jīng)培養(yǎng)，有632塊得到了內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌的得菌率為81.7%.對內(nèi)生真菌進行分離純化，共得到真菌菌株360個，經(jīng)鑒定有真菌16種.15種為半知菌.經(jīng)統(tǒng)計，不同真菌種類以及同種真菌在不同組織內(nèi)的分離率存在較大差異.其中，曲霉1(Aspergillussp. 1)、曲霉2(Aspergillussp. 2)、刺盤孢菌(Colletotrichumsp.)、大莖點霉(Macrophomasp.)、彎孢霉菌(Curvulariasp.)在供試的各種組織均有分布，且分離率較高，是空心蓮子草的優(yōu)勢內(nèi)生真菌，見表2.樣地不同，組織不同，其內(nèi)生真菌的定殖率不同.供試的5個樣地中，以樣地XYH內(nèi)生真菌的定殖率最高，達89.7%，樣地SY1內(nèi)生真菌的定殖率最低，為76.8%.供試的5種組織中，以老莖定殖率最高，達90.9%，嫩莖的定殖率最低，為70.2%，見表3.另外，各樣地間，空心蓮子草內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)也存在明顯差異.單端孢菌、鐮刀菌和小穴殼菌等3種菌僅分布于樣地SY2，殼梭孢菌僅分布于樣地ZHL，青霉2僅分布于樣地XYH.這說明，空心蓮子草體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境對其內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)有重要影響.

表2 空心蓮子草不同部位內(nèi)生真菌種類及分離率Tab. 2 The endophytic fungal species and the separation rate of different parts of Alternanthera philoxeroides

續(xù)表2

表3 空心蓮子草不同部位內(nèi)生真菌的定殖率Tab. 3 The endophytic fungi colonization rate in the different parts of Alternanthera philoxeroides

2.2 內(nèi)生真菌的多樣性及相似性

空心蓮子草內(nèi)生真菌有16種，種類較豐富.但樣地不同、組織不同，其內(nèi)生真菌的豐度有明顯不同.樣地SY1、SY2、SY3、XYH、ZHL的真菌種數(shù)依次為10種、10種、6種、9種和10種.其中，樣地SY1、SY2、ZHL真菌種數(shù)較多，樣地SY3真菌種數(shù)較少.嫩莖、老莖、葉尖、葉中、葉基組織內(nèi)的真菌種數(shù)依次為9種、10種、12種、9種、10種.以葉尖分離得到的真菌種類最多，老莖、葉基次之，嫩莖得到的真菌種類最少.對空心蓮子草不同樣地不同組織內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果，樣地不同、組織不同，其真菌多樣性指數(shù)也不同.其中，樣地ZHL最高，為2.13，樣地SY1最小，為1.87(表4).對不同樣地的空心蓮子草內(nèi)生真菌群落進行比較，樣地之間的相似系數(shù)區(qū)別明顯.其中，樣地SY1與樣地SY3之間相似系數(shù)最大，為0.900，樣地SY2與樣地XYH之間相似系最小，為0.667(表5).上述結(jié)果說明，空心蓮子草的生境及組織類型對空心蓮子草的真菌豐度、多樣性及相似性都有影響.

表4 空心蓮子草不同部位內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)Tab. 4 The endophytic fungi diversity index in the different parts of Alternanthera philoxeroides

表5 空心蓮子草不同樣地間內(nèi)生真菌的相似系數(shù)Tab. 5 The endophytic fungi similarity coefficient between sample plot habitats of Alternanthera philoxeroides

2.3 聚類分析

以空心蓮子草5種組織內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)、真菌種類及分離率為參數(shù)進行聚類分析，組織類型聚為2大類，老枝與嫩枝組織聚為一類，葉尖組織、葉中組織與葉基組織聚為一大類.葉器官3種組織中，葉尖與葉中聚為一小類，葉基為一小類(圖1).此結(jié)果說明，空心蓮子草組織類型越相似，其內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及真菌種類也越接近.以空心蓮子草5個樣地內(nèi)生真菌的定殖率及真菌豐度為參數(shù)進行聚類分析，樣地類型聚為3類，SY1、ZHL和SY2聚為一類，SY3和XYH各為一類(圖2).這說明，空心蓮子草生境對其內(nèi)生真菌的定殖率及豐度有重要影響.SY1、ZHL和SY2三個樣地環(huán)境相似，均為光照充足的空曠之地.樣地SY3與XYH均為樹蔭下，與上述三個樣地差異較大，但樣地XYH為濕地，樣地SY3為旱地，二者濕度有較大差異，這與聚類分析結(jié)果較相似.

圖2 空心蓮子草內(nèi)生真菌不同樣地聚類分析Fig. 2 The endophytic fungi cluster analysis of differentsample plots of Alternanthera philoxeroides

3 結(jié)論

空心蓮子草莖和葉棲居有內(nèi)生真菌，但器官、組織不同，內(nèi)生真菌種類不同，葉尖組織內(nèi)生真菌種類最多.空心蓮子草內(nèi)生真菌種類豐富，主要為半知菌.其中，曲霉1(Aspergillussp. 1)、曲霉2(Aspergillussp. 2)、刺盤孢菌(Colletotrichumsp.)、大莖點霉(Macrophomasp.)、彎孢霉菌(Curvulariasp.)是優(yōu)勢內(nèi)生真菌.生境及組織類型對空心蓮子草內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)及定殖率有重要影響.

本研究僅對空心蓮子草內(nèi)生真菌多樣性進行了初步觀測，有關(guān)這些內(nèi)生真菌生態(tài)功能以及他們在宿主植物入侵生物學中所具有的作用，均需要深入研究.