SFTSV Gn關(guān)鍵氨基酸突變對細(xì)胞自噬與病毒增殖的影響

陳夢婷，邱 玲，杜蒙育，徐小瑩，韋雪敏，崇小文，溫紅玲

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)是發(fā)熱伴血小板減少綜合征(sever fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)的病原體，SFTS病死率可達(dá)30%[1]，被列為世界衛(wèi)生組織建議優(yōu)先緊急研究的十大傳染病之一[2]。SFTS一旦暴發(fā)會給人類生命健康帶來極大危害，是中國和其他流行國家的一個重要公共衛(wèi)生問題。2021年該病毒被國際病毒分類委員會重新命名為大別班達(dá)病毒(Dabie bandavirus)[3]。

SFTSV是單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個片段組成[4]，其中M片段編碼的囊膜糖蛋白前體經(jīng)宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白酶修飾后形成N端糖蛋白(glycoprotein n, Gn)和C端糖蛋白(glycoprotein c, Gc)[5]。Gn在病毒的組裝、病毒顆粒的形成和吸附新的宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]，可與細(xì)胞表面蛋白的非肌球蛋白重鏈ⅡA結(jié)合，從而提高病毒早期感染效率[7]。糖蛋白介導(dǎo)了病毒結(jié)合并進(jìn)入宿主細(xì)胞的復(fù)制周期的第一步，是中和抗體的主要靶點[8-9]。

三維結(jié)構(gòu)建模分析表明，SFTSV Gn頭域折疊成一個三角形結(jié)構(gòu)，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個子域構(gòu)成，子域Ⅰ和Ⅱ支撐著在頂部突出的子域Ⅲ[10]。所有可被識別的B細(xì)胞表位(B cell epitopes, BCEs)都位于SFTSV Gn的表面，確定的5個BCEs中有3個位于SFTSV Gn頭域中的子結(jié)構(gòu)域Ⅱ[11]。本課題組前期研究結(jié)果表明SFTSV分離株JS2011-013-1感染Vero細(xì)胞無明顯細(xì)胞病變，經(jīng)多次傳代后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，比對兩毒株基因序列發(fā)現(xiàn)Gn只有第323位氨基酸發(fā)生突變(I323V)[12]，且該氨基酸位于子結(jié)構(gòu)域Ⅱ，推測該位點可能是影響病毒毒力的重要氨基酸位點。

研究發(fā)現(xiàn)SFTSV可引起細(xì)胞自噬并利用自噬通路進(jìn)行病毒的組裝和釋放[13]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein Ⅰ light chain 3, LC3)是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)志物[14]，SQSTM1(Sequestosome 1, p62)是自噬降解的指標(biāo)[15]。因此，本研究檢測SFTSV Gn及其關(guān)鍵氨基酸突變(I323V)引起細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62及LC3表達(dá)水平的變化情況，以確定其對細(xì)胞自噬的影響。

本研究通過實現(xiàn)Gn和Gn(I323V)的真核表達(dá)，進(jìn)而檢測其對細(xì)胞活性、病毒復(fù)制和細(xì)胞自噬的影響以及兩者之間的差異，結(jié)合預(yù)測的蛋白三級結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究SFTSV Gn的結(jié)構(gòu)與功能以及發(fā)現(xiàn)抗病毒藥物靶點提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞、毒株、載體和抗體 SFTSV毒株JS2011-013-1由江蘇省疾病預(yù)防控制中心惠贈；Vero細(xì)胞為本實驗室傳代保存；BSR-T7/5細(xì)胞(金黃倉鼠腎細(xì)胞)由武漢病毒所彭珂教授課題組惠贈；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購自武漢淼靈公司；人源SFTSV Gn蛋白單克隆抗體由武漢大學(xué)于學(xué)杰教授課題組惠贈[11]；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體購自美國Proteintech公司；鼠抗p62抗體購自abcam公司；鼠抗LC3B抗體購自CST公司；鼠抗β-actin抗體、羊抗鼠抗體購自中杉金橋公司。

1.1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒(E.Z.N.Z.TMViral RNA Ki)購自美國OMEGA公司； Evo M-MLV Plus cDNA合成試劑盒、OK Clon DNA連接試劑盒購自艾科瑞公司；高保真酶(KOD-Plus-)購自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上海昂羽公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自Thermo公司；qRT-PCR一步法熒光定量專用預(yù)混液購自諾唯贊公司。

1.2 SFTSV Gn蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 以突變后的SFTSV Gn蛋白序列為模板，在SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線網(wǎng)址上進(jìn)行同源建模，并將輸出的模型在PyMOL軟件中進(jìn)行分析。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)SFTSV毒株和質(zhì)粒pcDNA3.1(+)序列，利用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)同源重組克隆及重疊延伸PCR原理設(shè)計引物，序列見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.7 建議與意見 問卷學(xué)生認(rèn)為，目前學(xué)校開展的課外活動，形式單一，激發(fā)不了大家的積極性。他們希望學(xué)校多組織開展有意義、有趣味、有吸引力、貼近生活、不刻板形式化、能培養(yǎng)創(chuàng)新能力的課外活動，如：三觀教育、實踐活動、戶外運動等；學(xué)生希望擴大課外活動的參與面，而不總是固定的那幾個學(xué)生參加活動；學(xué)生周末空閑時間較多，有希望學(xué)校周末開放體育館、提供鍛煉場地的訴求。學(xué)生還反映在校生學(xué)風(fēng)不夠好，“低頭族”群體大，部分學(xué)生素質(zhì)較低、生活習(xí)慣較差等。有的學(xué)生也提出對學(xué)校沒有門禁、存在安全隱患的擔(dān)心。

表1 擴增目的片段引物信息Tab.1 Primer information for amplification of the target fragment

1.4 SFTSV Gn基因的擴增和鑒定 提取SFTSV總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以Gn F和Gn R為引物合成Gn；以Gn F和Gn(I323V) R為引物合成Gn1，以Gn(I323V) F和Gn R為引物合成Gn2，再以Gn1和Gn2為模板合成Gn(I323V)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)一步測序分析。

1.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物以及經(jīng)Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒通過膠回收進(jìn)行純化，無縫克隆法連接質(zhì)粒和目的片段。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板后挑取單個菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將雙酶切鑒定正確且測序結(jié)果一致的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞及相關(guān)檢測

1.6.1 瞬時轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞 將BSR-T7/5細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞長至70%～80%時，PBS清洗3次，每孔加入1 mL Opti-MEM。分別將50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基與1.5 μL轉(zhuǎn)染試劑和1 μg重組質(zhì)粒充分混勻，同時稀釋空載體pcDNA3.1(+)設(shè)置為對照組；將上述兩管預(yù)混液輕輕混勻后在室溫孵育10～15 min后加入孔板，培養(yǎng)5 h后將培養(yǎng)液換成含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6.2 間接免疫熒光檢測 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，用預(yù)冷的80%丙酮-20 ℃固定12 h以上，PBS洗滌3次后加入1∶750稀釋的人源SFTSV Gn蛋白單克隆抗體，37 ℃孵育1 h。回收一抗后PBS洗3次，加入1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的二抗，37 ℃避光孵育1 h，棄去二抗。加入適量DAPI染液室溫孵育5 min，PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察。

1.6.3 Western Blot檢測 提取轉(zhuǎn)染48 h后的BSR-T7/5總蛋白，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液100 ℃沸水浴10 min使蛋白變性。電泳后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜，0.5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜3次；加入一抗孵育過夜，TBST洗膜3次；加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，搖床孵育1 h，TBST洗膜3次?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)情況，之后在Image J(https://ij.imjoy.io/)在線網(wǎng)址對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6.4 CCK-8檢測 將BSR-T7/5細(xì)胞接種到96孔板中，共分為空白組、轉(zhuǎn)染空載體組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h，棄去原培養(yǎng)液，避光加入含10% CCK-8試劑的維持液，37 ℃孵育1 h。用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定各孔吸光度(A)。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=[A(實驗)-A(空白)]/[A(對照)-A(空白)]×100%計算各組細(xì)胞存活率。

1.6.5 qRT-PCR檢測 將BSR-T7/5細(xì)胞接種到24孔板中，分組同1.6.4，每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，按MOI=1的劑量接種SFTSV，分別在接毒后的0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融3次后提取病毒RNA，利用qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量檢測病毒核酸載量并繪制病毒復(fù)制曲線。

2 結(jié) 果

2.1 SFTSV Gn三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測 將SFTSV Gn氨基酸序列導(dǎo)入SWISS-MODEL后，平臺自動匹配以5y11.1A[9]晶體結(jié)構(gòu)為模板對SFTSV Gn進(jìn)行同源建模,序列相似性為99.69%。拉氏圖(圖1B)顯示93.6%的殘基位于允許區(qū)域，5.6%的殘基位于額外允許區(qū)域，表明該模型合理性較好，確定了模型的可靠性。將輸出的模型在PyMOL軟件上進(jìn)行分析，分別將Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ子結(jié)構(gòu)域用紅色、黃色和綠色表示，并用藍(lán)色箭頭標(biāo)示發(fā)生突變的第323位氨基酸(圖1A)。

A：Gn頭域三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型B：預(yù)測模型拉氏圖圖1 Gn頭域三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型及其拉氏圖Fig.1 Tertiary structure prediction model of Gn head domains and Ramachandran plot

2.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別可在約1.0 kb、0.8 kb(圖2A)及1.7 kb(圖2B)處見單一條帶，與預(yù)期目的片段大小一致。目的基因與載體pcDNA3.1(+)無縫克隆連接后構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒用Hind Ⅲ/XbaⅠ雙酶切后在凝膠電泳約1.7 kb和5.3 kb的位置各有一條帶(圖2C)，且測序結(jié)果經(jīng)比對與預(yù)期完全一致，證明質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)構(gòu)建成功。

注：A為擴增Gn(I323V)的上下游片段，1為上游片段Gn1，2為下游片段Gn2；B為擴增的目的片段，1為Gn，2為Gn(I323V)；C為重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖，1為 pcDNA3.1(+)-Gn，2為 pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)。圖2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定Fig.2 Construction and identification of eukaryotic expression vectors

2.3 檢測SFTSV Gn在BSR-T7/5細(xì)胞中的表達(dá) 重組質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞48 h后間接免疫熒光(圖3A)及Western Blot(圖3B)檢測結(jié)果如圖所示。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)的BSR-T7/5細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見特異性綠色熒光，對照組和轉(zhuǎn)染空載體組均未檢測到熒光。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組在約61 kDa處均有特異性條帶，與預(yù)期的Gn蛋白大小一致，而細(xì)胞對照組和轉(zhuǎn)染空載體組未見此條帶，認(rèn)為SFTSV Gn在BSR-T7/5細(xì)胞中成功表達(dá)。

放大倍數(shù)：200×(比例尺50 μm)A：間接免疫熒光檢測結(jié)果 B：Western Blot檢測結(jié)果圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of BSR-T7/5 transfected with recombinant plasmids

2.4 CCK-8檢測表達(dá)SFTSV Gn對BSR-T7/5細(xì)胞活性的影響 根據(jù)吸光度計算的各組細(xì)胞存活率如圖4，轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Gn組和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組的細(xì)胞存活率低于轉(zhuǎn)染空載體組(t1=2.80,P<0.05;t2=7.47,P<0.01)，且兩組之間的細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.60，P<0.01)。

注：① P<0.05，② P<0.01，③ P<0.001。圖4 BSR-T7/5細(xì)胞表達(dá)Gn后細(xì)胞活性檢測Fig.4 Cell activity detection in BSR-T7/5 cells expressing Gn

2.5 qRT-PCR檢測過表達(dá)SFTSV Gn對病毒復(fù)制的影響 利用qRT-PCR測定表達(dá)Gn及Gn(I323V)后不同時間點病毒RNA含量并繪制病毒復(fù)制曲線，結(jié)果如圖5，空白組的病毒增殖速率最快，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn組的病毒復(fù)制動力學(xué)特征相似，無明顯差異；而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組的病毒增殖速率明顯低于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn組。

圖5 病毒復(fù)制曲線Fig.5 Proliferation curve of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus

2.6 Western Blot檢測SFTSV Gn對細(xì)胞自噬的影響 重組質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞48 h后，Western Blot檢測結(jié)果如圖6，與空白對照組相比，p62與LC3 Ⅱ表達(dá)量均增多(t1=5.460，t2=22.10，t3=7.94，t4=28.08，t5=16.44，t6=20.59，均P<0.05)；與轉(zhuǎn)染空載體組相比，除轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組的LC3 Ⅱ外，p62與LC3 Ⅱ表達(dá)量均增多(t7=18.07，t8=7.60，t9=6.85，均P<0.05)；表達(dá)Gn組的p62與LC3 Ⅱ表達(dá)量均多于表達(dá)Gn(I323V)組(t10=7.35，t11=5.79，均P<0.05)。

A：自噬相關(guān)蛋白Western Blot圖，B：p62蛋白相對表達(dá)量，C：LC3B Ⅱ蛋白相對表達(dá)量注：①P<0.05，②P<0.01，③P>0.05。圖6 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig.6 Expression of autophagy related proteins

3 討 論

SFTSV是引起SFTS的病原體，該病可引起發(fā)熱、血小板減少、胃腸道及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等。自2009年被發(fā)現(xiàn)以來，我國25個省份相繼報道了SFTS病例，且每年呈上升趨勢[16]。然而該病目前尚無公認(rèn)的特異性治療方法和藥物，更無批準(zhǔn)的人和動物的有效疫苗，且發(fā)病機制以及SFTSV與宿主細(xì)胞的相互作用機制尚不清楚。因此，構(gòu)建表達(dá)Gn及Gn(I323V)的真核表達(dá)載體從而研究其與細(xì)胞的相互作用機制和對病毒復(fù)制的影響，進(jìn)一步確定該氨基酸突變的生物學(xué)意義，為研究SFTSV Gn的結(jié)構(gòu)和功能以及抗病毒藥物有效靶點的篩選奠定基礎(chǔ)。

既往研究結(jié)果表明，Gn和Gc可能是SFTSV誘導(dǎo)保護(hù)性免疫最有效的抗原[17]。Wu等[10]提出的在SFTSV表面的錨定模型證實Gn是理想的疫苗靶點。且將表達(dá)SFTSV各蛋白的質(zhì)粒接種于干擾素受體敲除小鼠后，Gn相比于Gc可誘導(dǎo)較高的中和抗體水平且對SFTSV感染有更好的保護(hù)作用[18]。BSR-T7/5細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶[19]，進(jìn)而保證Gn蛋白的高效表達(dá)。同源重組克隆技術(shù)無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點可定向克隆至任意載體的任意位點，不依賴于連接酶和磷酸酶，具有省時、高效的優(yōu)點[20]。

本研究采用同源建模的方法預(yù)測SFTSV Gn的蛋白結(jié)構(gòu)，確定了突變氨基酸位點的位置，成功構(gòu)建并在BSR-T7/5細(xì)胞中表達(dá)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)，對關(guān)鍵氨基酸位點進(jìn)行功能驗證。qRT-PCR結(jié)果顯示過表達(dá)Gn對病毒復(fù)制無明顯影響，但表達(dá)Gn(I323V)后細(xì)胞增殖速率降低。CCK-8及Western Blot結(jié)果表明表達(dá)Gn和Gn(I323V)可不同程度地降低BSR-T7/5細(xì)胞存活率，且除轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)組的LC3 Ⅱ外，p62與LC3 Ⅱ表達(dá)量均不同程度增多。表明SFTSV Gn可能是通過調(diào)控自噬通量來影響細(xì)胞活性且第323位氨基酸突變(I323V)對宿主細(xì)胞和病毒復(fù)制有影響。p62是一種多功能結(jié)合蛋白，已被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬、細(xì)胞存活、細(xì)胞死亡、氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)和炎癥等多種細(xì)胞過程[21-24]，提示SFTSV Gn可能還與氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)和炎癥等通路相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

對同屬布尼亞病毒科的漢坦病毒(hantann virus, HTNV)研究結(jié)果表明，HTNV的糖蛋白可通過控制自噬通量來抑制宿主細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)并且可能抑制病毒的復(fù)制[25]。本研究結(jié)果表明過表達(dá)Gn并不影響病毒的復(fù)制，但發(fā)現(xiàn)表達(dá)SFTSV Gn后細(xì)胞自噬流明顯被抑制且細(xì)胞存活率降低，與其研究結(jié)果一致，提示可進(jìn)一步加入自噬調(diào)控的誘導(dǎo)劑和抑制劑，從而提供更堅實的實驗依據(jù)。

反向遺傳技術(shù)是研究RNA病毒分子生物學(xué)、發(fā)病機制、疫苗和抗病毒藥物的有效工具，可拯救出含有定點突變的毒株進(jìn)而研究突變所引起的病毒生物學(xué)功能的改變。目前已有研究成功構(gòu)建SFTSV反向遺傳系統(tǒng)[26-28]，但本課題組多次嘗試未能成功構(gòu)建SFTSV反向遺傳系統(tǒng)，因此未能從病毒水平上研究Gn第323位氨基酸突變對SFTSV糖蛋白功能的影響。

綜上所述，SFTSV Gn可能是通過抑制自噬流從而影響細(xì)胞活性且第323位氨基酸突變對宿主細(xì)胞和病毒復(fù)制有影響，為進(jìn)一步研究SFTSV Gn的結(jié)構(gòu)與功能以及抗病毒藥物提供新的理論依據(jù)。

利益沖突：無