BCG感染樹突狀細胞的轉(zhuǎn)錄組測序和分析

孫巧玲，袁 欣，王 玉

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性傳染性疾病。根據(jù)2020年全球結(jié)核病報告顯示，結(jié)核病是全球十大死亡原因之一[1]，而耐藥結(jié)核病、艾滋病以及新冠肺炎的合并感染使得結(jié)核病更難防治[2]。樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)是重要的專職抗原提呈細胞，能夠激活幼稚T細胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3]。當(dāng)MTB感染時，DC通過吞噬、抗原提呈、細胞因子分泌等功能[4]，參與宿主炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[5]。

卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是牛結(jié)核分枝桿菌減毒活菌株[6]，是目前唯一公認的結(jié)核疫苗[7]。但BCG的免疫效果，尤其是對成人結(jié)核病的免疫保護效果并不理想[8-9]，這一原因可能與CD8+T細胞活性減弱和免疫記憶持續(xù)時間受限有關(guān)[10-11]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，BCG表面肽聚糖和阿拉伯半乳糖等病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)能與DC模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)結(jié)合，刺激DC活化和分泌細胞因子[8,12-15]。而BCG也能調(diào)控DC功能，如BCG Hip蛋白缺失可促進DC活化，進而增強小鼠肺內(nèi)細胞免疫應(yīng)答[16]。至今為止，BCG胞內(nèi)免疫機制仍未完全闡明。

因此，本實驗采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，以小鼠樹突狀細胞(DC2.4)為模型，研究BCG感染的樹突狀細胞內(nèi)基因表達變化，挖掘與BCG感染相關(guān)的基因，為深入解析BCG的固有免疫機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基以及胎牛血清購自美國Gibco公司；Tween-80購自重慶川江化學(xué)試劑廠；TRizol試劑、Middlebrook 7H9培養(yǎng)基以及OADC增菌液購自美國BD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；定量PCR試劑盒購自美國APE x BIO公司；引物由中國上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 實驗菌株及細胞 BCG以及DC2.4細胞均由本實驗室提供。

1.3 方 法

1.3.1 BCG培養(yǎng) 將BCG接種于含有0.2%Tween-80和10% OADC增菌液的Middlebrook 7H9培養(yǎng)液中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)3周，3 000 r/min離心10 min，PBS清洗2次后，用2 mL PBS重懸后，測定OD600，計算BCG濃度。

1.3.2 DC2.4培養(yǎng)以及BCG感染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，待細胞密度為80%左右時，對細胞進行消化、計數(shù)，以1×106個/mL密度接種于六孔板，次日更換新鮮培養(yǎng)基，加入BCG懸液(MOI=2)，3 h后換液，置于37 ℃孵箱培養(yǎng)24 h，以未感染的DC2.4細胞為對照組。

1.3.3 樣本制備 1×PBS洗2次后，每孔加入1 mL TRizol試劑，收集樣本，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測序 用TRizol提取BCG感染DC2.4細胞24 h后的總RNA，將樣本送至深圳華大基因生物科技有限公司進行測序和數(shù)據(jù)分析?；贒NBSEQ測序平臺，將測序所得的原始數(shù)據(jù)(Raw data)經(jīng)SOAPnuke軟件對其進行過濾獲得純凈序列(Clean reads)，然后用HISAT軟件將得到的Clean reads比對到參考基因組序列，使用Bowtie2將Clean reads比對到參考基因序列。以“FDR≤0.05和|log2Fold Change|≥1”作為閾值來判斷基因差異表達的顯著性。并使用 R 的基礎(chǔ)函數(shù) phyper(https://stat.ethz.ch/R-manual/R-devel/library/stats/html/Hypergeometric.html)計算 Pvalue。然后對 Pvalue 進行多重檢驗較正，校正軟件包為 qvalue(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/qvalue.html)。最后以 Qvalue(corrected Pvalue)≤ 0.05 為閾值，滿足此條件的GO term 定義為在候選基因中顯著富集的 GO term；KEGG Pathway富集分析與GO功能富集分析方法相同。

1.4 qRT-PCR實驗驗證及分析 為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，隨機挑選了5個與BCG感染樹突狀細胞相關(guān)的差異表達基因(Msr1、Ccl7、Cx3cr1、Cd86和Hmox1)并采用RT-qPCR實驗驗證。引物如表1。反應(yīng)體系為10 L，其中包括2× SYBR Green qPCR Master Mix 5 L, Forward Primer 0.5 L, Reverse Primer 0.5 L，cDNA 1 L, 50×ROX Reference Dye 0.2 L, DEPC水2.8 L。反應(yīng)程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)用2-ΔΔct法計算各個基因的相對表達量，以β-Actin為內(nèi)參基因。實驗設(shè)置3次重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物列表Tab.1 Primer sequences for real time quantitative PCR

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用2-ΔΔct法計算基因的相對表達量；采用GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行作圖。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析 對未感染組和感染組的細胞樣本進行RNA-Seq數(shù)據(jù)分析，共獲得27 235萬條讀段(reads)，總長度約40.86 G堿基。未感染組和感染組的Q20均大于97%，Q30均大于92%(表2)，表明原始數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Tab.2 Statistical table of sequencing data

2.2 差異表達基因分析 本實驗采用韋恩圖展示未感染組和感染組基因表達情況(圖1)：未感染組表達14 817個基因，感染組有14 951個基因。其中兩組共表達基因14 149個，可見BCG感染導(dǎo)致DC細胞基因表達發(fā)生了變化。再以FDR<0.05(FDR是對P-value的校正值)且差異倍數(shù)絕對值≥1(|Log2Fc|≥1)為條件進行篩選，由圖2所示，BCG感染后DCs內(nèi)共有27個差異基因，其中有26個基因表達上調(diào)，1個基因表達下調(diào)。

圖1 BCG感染DC2.4后差異表達基因的韋恩圖Fig.1 Differentially expressed gene VEEN map of DC2.4 cells infected with BCG

圖2 BCG感染DC2.4后差異表達基因的火山圖與散點圖Fig.2 Differentially expressed gene volcano diagram and scatter plot of DC2.4 cells infected with BCG

2.3 差異表達基因功能注釋和富集分析

2.3.1 差異表達基因GO功能注釋和富集分析 對BCG感染DC差異表達基因進行GO富集分析，包括生物學(xué)過程(biological process)，細胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)3類。結(jié)果如圖3，將GO富集分析結(jié)果以氣泡圖進行展示，氣泡顏色和大小分別代表P值大小和差異表達基因數(shù)量(圖4)。其中BCG感染DC差異表達基因主要富集在細胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、對刺激的反應(yīng)以及免疫系統(tǒng)過程等生物學(xué)過程；細胞組成富集結(jié)果表明差異基因主要分布在細胞器、細胞膜等細胞部位；分子功能的富集結(jié)果顯示，差異基因主要通過影響結(jié)合、催化活性、分子功能以及分子功能調(diào)節(jié)等功能來發(fā)揮作用。GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與免疫系統(tǒng)過程、炎癥反應(yīng)以及對細菌的應(yīng)答等功能。表明BCG感染能誘導(dǎo)DC產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。

圖3 BCG感染DC2.4后差異表達基因GO功能分類圖Fig.3 Differentially expressed gene GO function classification map of DC2.4 cells infected with BCG

圖4 BCG感染DC2.4后差異表達基因GO富集圖Fig.4 Differentially expressed gene GO enrichment map of DC2.4 cells infected with BCG

2.4 KEGG富集分析結(jié)果 對差異表達基因進行KEGG代謝通路富集分析，如圖5，差異基因主要參與了細胞生長與死亡、細胞免疫等生物過程；調(diào)節(jié)了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等環(huán)境信息處理過程。此外差異表達基因還主要參與了病毒、細菌感染性疾病、癌癥等人類疾病；與免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、發(fā)育與再生等生物系統(tǒng)相關(guān)。差異基因的KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與了TNF、細胞因子與細胞因子受體相互作用、IL-17等信號通路(圖6)。

圖5 BCG感染DC2.4后差異基因KEGG通路分類圖Fig.5 Differentially expressed gene KEGG pathway classification map of DC2.4 cells infected with BCG

圖6 BCG感染DC2.4后KEGG Pathway富集圖Fig.6 Differentially expressed gene KEGG pathway enrichment map of DC2.4 cells infected with BCG

2.5 qRT-PCR實驗驗證 為了證實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(表3)的可靠性，采用qRT-PCR技術(shù)驗證差異表達上調(diào)基因Ccl7、Hmox1，差異表達下調(diào)基因Cx3cr1、Msr1、和Cd86的表達情況。結(jié)果表明(圖7)，5個基因表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。其中，Msr1、Cd86和Hmox1基因表達相當(dāng)，基因Ccl7和Cx3cr1的qRT-PCR檢測結(jié)果分別是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的1.7和0.4倍。

表3 5個差異表達基因在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的信息Tab.3 Information on five differentially expressed genes in RNA-Seq

圖7 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的qRT-PCR驗證Fig.7 Results of RNA-Seq verification by qRT-PCR

3 討 論

DC是連接機體天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁細胞，在宿主抗感染免疫中起著非常重要的作用[5,17]。BCG感染時DC可通過吞噬、抗原呈遞、細胞因子分泌等功能，調(diào)控宿主炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程[5]。此外，BCG除了能誘導(dǎo)DC活化[3]，還可抑制細胞凋亡，促進DC存活[18]。但BCG的胞內(nèi)免疫機制仍未完全闡明。本研究對BCG感染DC進行轉(zhuǎn)錄組測序以及生物信息學(xué)分析，篩選出27個差異表達基因并通過生物信息學(xué)分析找到參與BCG感染的細胞信號通路，為深入揭示BCG的胞內(nèi)免疫機制提供方向。qRT-PCR驗證Msr1、Ccl7、Cx3cr1、Cd86和Hmox1基因的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。說明轉(zhuǎn)錄組能用于篩選差異基因。

巨噬細胞清道夫受體1(Macrophage scavenger receptor 1，Msr1)屬于A類清道夫受體[19]，作為模式識別受體參與了宿主炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。有研究發(fā)現(xiàn)，Msr1能促進單核細胞增生性李斯特菌的內(nèi)化作用[20]；在BCG以及MTB感染的巨噬細胞中，Msr1的表達增加[21]；而在本研究中，Msr1表達下降。據(jù)此推測Msr1在DC與巨噬細胞中的作用可能不同；此外，血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase 1,Hmox-1)和Cd86等基因也與免疫細胞吞噬、活化功能相關(guān)。Hmox-1在未成熟的DC中高表達，可限制其促炎作用[22-23]。而卡諾醇和姜黃素能上調(diào)Hmox-1來誘導(dǎo)DC成熟[24]。結(jié)合本研究中BCG感染導(dǎo)致Hmox-1表達上調(diào)，推測BCG可誘導(dǎo)DC活化。當(dāng)Toll受體(TLRs)激活時，Cd86表達增加，DC活化[25]。而本研究中Cd86基因表達下調(diào)，這些矛盾的結(jié)果提示BCG可能并不能很好地激活DC；這可能也與BCG的免疫保護效果會隨著時間的推移而減弱有關(guān)[26]。

趨化因子7(C-C motifchemokine 7，CCL7)和趨化因子受體1(CX3C chemokine receptor 1,Cx3cr1)基因與免疫細胞遷移和趨化相關(guān)。通常情況下，CCL7基因缺失或阻斷會減少固有免疫細胞的招募，限制炎癥反應(yīng)，使機體更易被感染[27]；相反地，腫瘤中CCL7過表達會招募更多的DC,限制腫瘤的生長[28-29]。分泌高水平小鼠單核細胞趨化蛋白3的牛分枝桿菌BCG(即BCG MCP-3)接種小鼠后，導(dǎo)致更多的淋巴細胞遷移，增強T細胞免疫應(yīng)答[29]。本研究進一步證實BCG可誘導(dǎo)DC產(chǎn)生CCL7，進而促進淋巴細胞遷移，激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。與CCL7不同，Cx3cr1主要與CSF-1R+髓系前體細胞向巨噬細胞/樹突狀細胞譜系分化有關(guān)[30]。本研究中Cx3cr1基因下調(diào)，提示BCG可能通過影響DC的分化來調(diào)控DC的免疫功能。由此可知，BCG感染調(diào)節(jié)了DC的活化、分化和遷移功能，進而影響T細胞免疫應(yīng)答。

另外，在本研究中，以“FDR≤0.05和|log2Fold Change|≥1”為條件只篩選出27個差異表達基因，這可能與BCG不能很好地刺激DC細胞活化，從而影響DC細胞的抗原提呈功能有關(guān)。

綜上，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析研究了BCG感染DC中基因表達的變化，并通過qRT-PCR證實轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，為深入探討B(tài)CG的胞內(nèi)免疫機制提供依據(jù)。

利益沖突：無