熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的價值

胡琴琴，張金花，宋克玉，許 坦，肖圓圓，陳芳芳，施旭東

利福平(RFP)和異煙肼(INH)是治療結(jié)核病的一線藥物，然而近年來，結(jié)核分枝桿菌(MTB)對這些藥物的耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重[1]。因此，針對RFP和INH的耐藥性檢測已成為制定結(jié)核病臨床治療方案中不可或缺的依據(jù)。由于MTB生長緩慢，基于培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)的傳統(tǒng)耐藥性檢測方法至少需要6～8周才能得到結(jié)果，極易延誤診斷和病情。分子藥敏試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展克服了傳統(tǒng)表型藥敏試驗(yàn)耗時較長的缺點(diǎn)[2]。其中，熒光PCR熔解曲線法是通過監(jiān)測針對特定耐藥基因設(shè)計的熒光標(biāo)記探針在PCR擴(kuò)增完成后的熔解曲線分析過程中是否發(fā)生熔點(diǎn)變化來判斷探針覆蓋區(qū)域是否發(fā)生基因突變，是目前快速檢測MTB耐藥性的新型分子生物學(xué)方法之一[3]。本研究對2018年1月至2021年3月在南京市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心經(jīng)絕對濃度法藥敏試驗(yàn)和熒光PCR熔解曲線法兩種方法確診的結(jié)核病患者進(jìn)行分析，探討熒光PCR熔解曲線法檢測MTB對RFP和INH耐藥性的臨床價值，分析RFP和INH耐藥相關(guān)基因突變分布情況。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 本研究納入的780株結(jié)核分枝桿菌分離自2018年1月至2021年3月南京市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心就診的培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患者，收集其基本資料，其中男性543例，女性237例，年齡5～92歲，平均(48.0±19.1)歲。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本前處理 痰標(biāo)本用4% NaOH消化液處理，15 min后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)至40 mL并混勻，4 ℃離心20 min，棄上清液，沉淀物加入0.5 mL PBS振蕩重懸。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]吸取消化后的痰液約0.5 mL懸浮液加到MGIT培養(yǎng)管中，充分混勻后放入BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)，儀器報陽后取菌液進(jìn)行萋-尼抗酸染色，以確定是否為抗酸桿菌。TCH培養(yǎng)基上生長、PNB培養(yǎng)基上不生長確認(rèn)為初篩結(jié)核分枝桿菌。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》對結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行RFP、INH耐藥性檢測，用結(jié)核分枝桿菌H37 Rv作為敏感對照進(jìn)行質(zhì)量控制。以不含藥對照管生長，含藥高、低濃度管均不生長為敏感；低濃度管生長、高濃度管不生長為低度耐藥；高、低濃度管均生長為高度耐藥。本研究中“耐藥”包括低度和高度耐藥。RFP藥敏培養(yǎng)基的濃度為50 μg/mL(低濃度)和250 μg/mL(高濃度)，INH藥敏培養(yǎng)基的濃度為1 μg/mL(低濃度)和10 μg/mL(高濃度)。

1.2.4 熔解曲線法耐藥基因檢測 經(jīng)鑒定為MTB的菌株采用熒光PCR熔解曲線法進(jìn)行耐藥基因突變檢測。檢測RFP耐藥性決定區(qū)rpoB基因和INH耐藥相關(guān)基因katG315密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))、ahpC啟動子區(qū)(-44～-30以及-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子是否含有突變來確定耐藥性。檢測試劑盒由廈門致善生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。以絕對濃度法為標(biāo)準(zhǔn)，計算熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的靈敏度、特異度、符合率，并進(jìn)行一致性分析(Kappa檢驗(yàn))。Kappa值在0～0.20為極低一致，Kappa值在0.21～0.40為一般一致，Kappa值在0.41～0.60為中等一致，Kappa值在0.61～0.80為基本一致，Kappa值在0.81～1.00為幾乎完全一致。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)核分枝桿菌耐藥特征 780株結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株的表型耐藥結(jié)果為：耐藥菌株227株，總耐藥率29.10%(227/780)，其中RFP總耐藥率21.15%(165/780)，RFP單耐藥率2.82%(22/780)；INH總耐藥率26.28%(205/780)，INH單耐藥率7.95%(62/780)；耐多藥(利福平和異煙肼同時耐藥)結(jié)核菌143株，耐多藥率18.33%(143/780)；分子耐藥結(jié)果為：耐藥菌株235株，總耐藥率30.13%(235/780)，其中RFP總耐藥率24.49%(191/780)，RFP單耐藥率5.64%(44/780)；INH總耐藥率24.49%(191/780)，INH單耐藥率5.64%(44/780)；耐多藥結(jié)核菌147株，耐多藥率18.85%(147/780)，見表1。54株結(jié)核分枝桿菌的表型藥敏結(jié)果為RFP中度耐藥，其中3株RFP分子藥敏結(jié)果敏感；178株結(jié)核分枝桿菌的表型藥敏結(jié)果為INH中度耐藥，其中26株INH分子藥敏結(jié)果敏感。

表1 結(jié)核分枝桿菌的耐藥特征Tab.1 Resistance characteristics of Mycobacterium tuberculosis

2.2 熔解曲線法的檢測效能 以絕對濃度法藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，熔解曲線法檢測RFP耐藥性的敏感度、特異度和符合率分別為98.18%、95.28%和95.90%，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa=0.88)；檢測INH耐藥性的敏感度、特異度和符合率分別為85.85%、97.39%和94.36%，一致性分析為幾乎完全一致(Kappa=0.85)，見表2。

表2 熔解曲線法檢測MTB對INH、RFP耐藥性的效能Tab.2 Effectiveness of the melting curve method in detecting the resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isoniazid

靈敏度(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；符合率 (%)=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

2.3 結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變分布

2.3.1 RFP耐藥相關(guān)基因突變分布 191株RFP分子耐藥菌株中全部檢測出rpoB基因耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變，耐藥突變以單位點(diǎn)突變?yōu)橹?90.58%，173/191)，其中rpoB529～533位點(diǎn)為最常見的突變(63.87%，122/191)，其次是rpoB507～512位點(diǎn)(10.47，20/191)；rpoB基因雙位點(diǎn)突變出現(xiàn)的頻率為9.42(18/191)。單位點(diǎn)突變的173株菌株中有144株表型耐藥，其中突變位點(diǎn)為rpoB507～512的20株菌株中只有7株表型耐藥，rpoB基因雙位點(diǎn)突變的18株菌株全部表型耐藥，見表3。

表3 RFP耐藥相關(guān)基因突變分布情況Tab.3 Distribution of RFP drug resistance associated gene mutations

2.3.2 INH耐藥相關(guān)基因突變分布 單位INH分子耐藥菌株中,以單位點(diǎn)突變?yōu)橹?96.34%，184/191)，其中katG315位點(diǎn)為最常見的突變(66.49%，127/191)，其次是inhA啟動子區(qū)(17.80%，34/191)；雙位點(diǎn)突變出現(xiàn)的頻率為3.66%(7/191)。單位點(diǎn)突變的184株菌株中有171株(92.93%)表型耐藥，雙位點(diǎn)突變的7株菌株中有6株表型耐藥，見表4。

表4 INH耐藥相關(guān)基因突變分布情況Tab.4 Distribution of INH drug resistance associated gene mutations

2.3.3 兩種方法檢測耐藥性不一致的結(jié)果分析 在780株結(jié)核分枝桿菌中，32例藥敏試驗(yàn)與熔解曲線法檢測MTB對利福平的耐藥性結(jié)果不一致。其中29例藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為敏感而熔解曲線法檢測到突變，具體為rpoB507～512位密碼子突變13例，rpoB513～520位密碼子突變1例，rpoB521～528位密碼子突變3例，rpoB529～533位密碼子突變12例；3例藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為耐藥而熔解曲線法檢測結(jié)果為敏感。在780株結(jié)核分枝桿菌中，44例藥敏試驗(yàn)與熔解曲線法檢測INH對利福平的耐藥性結(jié)果不一致。其中15例藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為敏感而熔解曲線法檢測到突變，具體為katG缺失1例，katG315突變1例，inhA啟動子區(qū)突變8例，ahpC啟動子區(qū)突變4例，inhA啟動子區(qū)和ahpC啟動子區(qū)均突變1例；29例藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為耐藥而熔解曲線法檢測結(jié)果為敏感。

3 討 論

目前，耐藥結(jié)核病仍然是全球結(jié)核病控制工作所面臨的嚴(yán)峻問題，我國也是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[5]?；谂囵B(yǎng)和藥敏試驗(yàn)的傳統(tǒng)耐藥性檢測方法，周期往往達(dá)到6～8周，不利于結(jié)核病的早期治療和防控；熒光PCR熔解曲線法作為一種分子藥敏試驗(yàn)技術(shù)，能夠同時檢測4種一線抗結(jié)核藥物(包括利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素)的耐藥情況，并具有靈敏度高、特異度強(qiáng)、簡便快速、閉管檢測等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于臨床結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測[6-9]。

本研究數(shù)據(jù)顯示，結(jié)核的RFP耐藥率(21.15%)、INH耐藥率(26.28%)和耐多藥率(18.33%)均低于2013(29%、35%和19%)和2014年(38%、28%和20%)本市水平[10-11]，但遠(yuǎn)高于全國調(diào)查水平(9.63%、18.96%、6.85%)[12]。這些數(shù)據(jù)表明，隨著抗結(jié)核治療的日趨規(guī)范，結(jié)核病的耐藥情況有所好轉(zhuǎn)，但耐藥形勢依然嚴(yán)峻，仍需要重視用藥前的耐藥性檢測，合理選擇治療方案。本研究中，結(jié)核病患者的年齡分布以中老年為主，男性多于女性，且更容易發(fā)生耐藥，這可能與男性接觸肺結(jié)核患者的機(jī)會更多，配合治療的依從性差有關(guān)[13]。

以絕對濃度法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對RFP耐藥性的靈敏度為98.18%，特異度為95.28%；檢測結(jié)核分枝桿菌對INH耐藥性的靈敏度為85.85%，特異度為97.39%；熔解曲線法與絕對濃度法藥敏試驗(yàn)具有極好的一致性(Kappa值>0.81)。劉艷等[14]報道該方法檢測結(jié)核分枝桿菌對RFP耐藥性的靈敏度為95.83%，特異度為95.50，其靈敏度低于本研究，特異度與本研究結(jié)果相近，劉艷等研究只有135例標(biāo)本納入耐藥性檢測，敏感度的差異可能與樣本量等因素有關(guān)；吳慧娜等[6]報道該方法檢測結(jié)核分枝桿菌對INH耐藥性的靈敏度為85.4%，特異度為96.4%，與本研究結(jié)果較為一致。

MTB耐藥的主要機(jī)制是基因突變。本研究在191株RFP分子耐藥的菌株中全部檢測到了rpoB基因突變，表明rpoB基因突變是RFP耐藥的主要機(jī)制，與以往的研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)RFP耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變主要發(fā)生在rpoB529～533(63.87%)[15]。rpoB基因突變位點(diǎn)與RFP耐藥的強(qiáng)弱程度有關(guān)，有研究報道rpoB基因513、526和531位點(diǎn)發(fā)生突變可以引起RFP高度耐藥，而其他位點(diǎn)的突變僅導(dǎo)致低度耐藥[16]。本研究發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)為rpoB507～512的20株菌株中只有7株表型耐藥，推測藥敏試驗(yàn)敏感的某些菌株可能已經(jīng)出現(xiàn)了RFP低度耐藥，由此可以解釋藥敏試驗(yàn)敏感而熔解曲線法耐藥的情況，熔解曲線法檢測rpoB507～512位點(diǎn)突變可以發(fā)現(xiàn)此類菌株，彌補(bǔ)藥敏試驗(yàn)的局限性；另外本研究發(fā)現(xiàn)，rpoB基因雙位點(diǎn)突變18株菌株全部表型耐藥。與RFP耐藥機(jī)制相比，INH的耐藥機(jī)制更為復(fù)雜，涉及多個基因，katG315密碼子、inhA啟動子區(qū)及ahpC啟動子區(qū)的突變可覆蓋90%以上的INH耐藥菌株。本研究katG315的突變率為66.49%，與Zhang等[17]針對華東5省的研究結(jié)果相似(64.4%)，而與王希江等[18]針對新疆地區(qū)的研究結(jié)果相差很大(81.37%)，提示katG315突變可能存在地域上的差異。本研究中2株katG315突變或缺失菌株表型敏感，提示表型藥敏試驗(yàn)雖然是當(dāng)前耐藥性檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在局限性，對于一些低水平耐藥的菌株存在漏檢的情況。有研究表明katG315突變和katG缺失與較高濃度的INH耐藥相關(guān)[19]，由于本地區(qū)INH耐藥主要由katG基因突變導(dǎo)致，因此對于INH耐藥的患者不建議采用高劑量的INH治療方案。某些標(biāo)本表型藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為耐藥，而分子藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為敏感，可能是由于標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌含量較低導(dǎo)致核酸擴(kuò)增及檢測失敗，導(dǎo)致將標(biāo)本判定為敏感。

本研究尚存在一些不足之處，本研究檢測表型藥敏的方法為絕對濃度法藥敏試驗(yàn)，將耐藥結(jié)果分為高度耐藥和低度耐藥，但是其低濃度耐藥的藥物濃度較其他標(biāo)型藥敏方法稍高[9]，對低水平耐藥的菌株存在漏檢，導(dǎo)致RFP表型耐藥菌株低于分子耐藥菌株。對于藥敏試驗(yàn)?zāi)退幎劢馇€法敏感的樣本沒有進(jìn)行測序，無法進(jìn)一步證實(shí)是否存在檢測范圍外的基因突變，是否存在基因突變外的耐藥機(jī)制，尚需要進(jìn)一步的研究來解決這些未知的基因突變和耐藥機(jī)制。因此對于兩種方法檢測結(jié)果不一致的患者，任一方法提示對RFP和INH耐藥，均要給予足夠重視，結(jié)合臨床進(jìn)行綜合判斷。

綜上所述，熒光PCR熔解曲線法作為一種簡便快速的分子藥敏試驗(yàn)技術(shù)，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)具有極好的一致性，彌補(bǔ)了藥敏試驗(yàn)對于低度耐藥突變檢測的局限性。耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)的檢測對于結(jié)核病的及時診斷，規(guī)范的實(shí)施個體化治療，以及控制結(jié)核的流行具有很大的意義。

利益沖突：無