多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲的iTRAQ蛋白質(zhì)組學分析

李文卉，王建魁，張念章，曲自剛，劉垠鞠，賈萬忠，付寶權(quán)，3

多頭帶絳蟲(Taeniamulticeps)成蟲寄生于犬等動物的小腸，多頭帶絳蟲的中絳期幼蟲腦多頭蚴(Coenuruscerebralis)寄生于牛、羊等草食動物的大腦，引起一種中樞神經(jīng)性疾??；人也可作為中間宿主誤食多頭帶絳蟲蟲卵偶爾感染，可導(dǎo)致嚴重的病例狀況[1-5]。該病在世界范圍內(nèi)普遍流行[6-8]，在我國西北、華北、東北等廣大牧區(qū)最為多見[9]，該病感染動物后中晚期治愈率很低，致死率可達100%，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失，是一種重要的人獸共患寄生蟲病[10-11]。

多頭帶絳蟲是兩宿主的寄生蟲，寄生于犬腸道成蟲長度可達100 cm；而甚至有雞蛋大小的幼蟲期腦多頭蚴則是充滿囊液的半透明的包囊。顯然，多頭帶絳蟲的發(fā)育經(jīng)歷了兩種不同的宿主、不同的寄生環(huán)境，而且形態(tài)學和生理學是也完全不同，而且每個發(fā)育階段的生物學，包括發(fā)育調(diào)節(jié)、營養(yǎng)代謝和細胞周期仍不清楚。同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技術(shù)主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)的鑒定與定量分析，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析，該技術(shù)已成為目前蛋白質(zhì)組學研究的主要手段之一。本研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)分析多頭帶絳蟲成蟲及幼蟲發(fā)育階段差異蛋白，并用生物信息學方法對差異蛋白進行比較分析，從蛋白組學角度分析與發(fā)育有關(guān)的生物學過程和分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 多頭帶絳蟲成蟲與幼蟲的收集 從甘肅省景泰屠宰廠收集感染腦多頭蚴的綿羊，開顱腔摘取完整的腦多頭蚴包囊，分離原頭節(jié)液氮保存?zhèn)溆?。另將以上新鮮的原頭節(jié)50～80個飼喂給提前驅(qū)過蟲的2只比格犬，60 d后安樂處死犬，縱向剖腸取完整的多頭帶絳蟲成蟲，清洗干凈后再用PBS洗滌3次，每個凍存管分裝1條成蟲液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 超聲破碎法多頭帶絳蟲成蟲與幼蟲總蛋白制備和SDS電泳 稱取適量腦多頭蚴原頭節(jié)及多頭帶絳蟲成蟲樣品，用PBS洗脫離心2次后，加入裂解液(1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA)，置于冰上5 min后加入終濃度為10 mmol/L DTT，200 W冰浴超聲裂解15 min。25 000×g 離心 20 min，取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，56 ℃使用10 mmol/L DTT處理1h，還原打開二硫鍵，接著在暗室使用55 mmol/L IAM 暗室室景置 45 min，進行半胱氨酸的烷基化封閉，最后加入1 mL冷凍的丙酮，在-20 ℃放置過夜。次日25 000×g 離心20 min 棄去上清液，沉淀在300 μL 0.5 mol/L TEAB中200W超聲裂解15 min，25 000×g 離心20 min后上清液用于定量。Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度。每個樣品上樣量30 μg，蛋白標志物上樣量10 μg, 進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.3 iTRAQ標記 上述1.2制備的總蛋白用胰蛋白酶消化后，用真空離心泵抽干肽段，用0.5 mol/L TEAB復(fù)溶肽段，按照手冊進行iTRAQ標記，每一組肽段被不同的iTRAQ 標簽標記，室溫培養(yǎng)2 h；將標記后的各組肽段混合，用SCX 柱進行液相分離。

1.4 液相串聯(lián)質(zhì)譜LC-MS/MS分析及生物信息學分析 采用高分辨力和高精度的AB SCIEXTriple TOP5600 質(zhì)譜儀對分離后的肽段進行LC-MS/MS分析，配合在線微流高效液相色譜系統(tǒng)進行iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學分析。采用Mascot2.3.02蛋白質(zhì)鑒定軟件進行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索。并對差異蛋白進行GO 分類注釋及KEGG通路富集分析。

1.5 實時定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)驗證 TRIzol法提取多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲原頭蚴總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。將篩選的10個差異明顯的蛋白序列分別匹配到多頭帶絳蟲基因的CDS序列[12]，根據(jù)CDS序列應(yīng)用軟件Primer Premier 6.0 設(shè)計引物(表1)，選取β-tublin為內(nèi)參基因，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。選取的蛋白進行qRT-PCR 驗證。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR Green qPCR Master Mix(2×)10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、DNA模板2.0 μL、ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性7 s, 57 ℃退火10 s和延伸15 s，進行45個循環(huán)反應(yīng)。最后60 ℃～95 ℃制備熔解曲線。

表1 差異表達蛋白qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers for differentially expressed proteins

1.6 統(tǒng)計學分析 采用2-(ΔΔCt)法驗證熒光定量PCR檢測結(jié)果，實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6 軟件分析處理，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白質(zhì)濃度測定及SDS-PAGE電泳檢測：提取的多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲蛋白，經(jīng)Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度和總蛋白質(zhì)量(表2)，通過SDS-PAGE檢測蛋白，從圖1可以看出，提取的蛋白質(zhì)條帶清晰，符合下一步質(zhì)譜分析需求。

表2 多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲蛋白質(zhì)的濃度Tab.2 Concentrations of proteins from of T.multiceps adults and larvae

注：M:蛋白質(zhì)標記物；1—2成蟲； 3—4幼蟲。圖1 多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis profiles from T. multiceps adults and larvae

2.2 多頭帶絳蟲蛋白質(zhì)鑒定信息的質(zhì)譜分析 從多頭帶絳蟲成蟲和幼蟲共鑒定獲得684個蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量在20～60 kDa為 472個，占全部鑒定蛋白的69.00%；蛋白質(zhì)質(zhì)量在60～100 kDa為109個，占全部鑒定蛋白的15.93%。在相對定量時，如果同一蛋白質(zhì)的量在兩個樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當?shù)鞍椎牟町愗S度比即差差異倍數(shù)達到1.5倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗LSD-t=-1.15,P<0.05，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。對每個蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對數(shù)后作出分布圖如圖2。以此判定存在顯著差異的有130個蛋白。其中相對于幼蟲，成蟲期上調(diào)蛋白數(shù)量為69個，下調(diào)蛋白61個。上調(diào)蛋白為副肌球蛋白，果糖-1,6-二磷酸酶，亮氨酰肽酶，鈣結(jié)合蛋白，六鉤蚴蛋白Tso22c，熱休克蛋白70，8 kDa糖蛋白，肌球蛋白輕鏈，鈣調(diào)蛋白等；下調(diào)蛋白為抗原cC1，鈣蛋白酶，膜聯(lián)蛋白B3，皮層蛋白，糖脂轉(zhuǎn)移蛋白，微管相關(guān)蛋白，乳酸脫氫酶B，氨基?；福瑇pa-結(jié)合蛋白等。

注：該圖顯示可定量的所有蛋白質(zhì)的差異倍數(shù)的分布情況，其中橫坐標表示差異倍數(shù)經(jīng)過以2為底數(shù)的對數(shù)轉(zhuǎn)化后的值。大于0的為表達量上調(diào)，小于0的為表達量下調(diào)。其中差異倍數(shù)大于1.5的點用紅色和綠色標出(紅色為表達量上調(diào)，綠色為表達量下調(diào))。圖2 蛋白質(zhì)豐度比分布Fig.2 Protein ratio distribution

2.3 生物信息學分析及功能注釋 對鑒定出的所有蛋白進行GO功能注釋分析，通過protein2go針對3個本體：生物進程、細胞組成及分子功能中所涉及到各條目的分布情況，結(jié)果顯示生物進程中16.40%的蛋白涉及細胞過程、13.75%的蛋白參與代謝過程；細胞組成中參與細胞和細胞組分的蛋白各占27.39%，兩者占據(jù)了細胞組成中總蛋白數(shù)一半以上的比例；特別值得注意的是，分子功能中有一半以上(51.17%)是具有結(jié)合功能的蛋白，其次比例較高的34.27%的蛋白具有催化活性(圖3)。在25個 COG分類中，數(shù)量最多的是通用功能預(yù)測的蛋白，接下來依次是參與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生的蛋白。將差異表達的蛋白進行代謝路徑注釋，表3 列舉了數(shù)量較多的20個路徑，其中參與代謝途徑的差異蛋白數(shù)量最多(116，22.01%)。

表3 20個數(shù)量較多的差異表達蛋白質(zhì)途徑注釋Tab.3 Top 20 pathway annotations for differentially expressed proteins

2.4 篩選差異蛋白序列做qRT-PCR 將多頭帶成蟲和幼蟲差異蛋白配比到已知多頭帶絳蟲基因組序列上，得到對應(yīng)的CDS序列，依據(jù)其序列隨機選取5個上調(diào)蛋白(CL4425.Contig1/Tmu008054、CL4866.Contig1/Tmu01091、Unigene968/Tmu-000235、CL5675.Contig1/Tmu006666、Unigene5259/Tmu008659)，5個下調(diào)蛋白(Unigene1651/Tmu002472、Unigene687/Tmu002004、Unigene728/Tmu003244、Unigene1485/Tmu009112、Unigene913/Tmu004362)設(shè)計qRT-PCR引物(表1)，選擇β-tublin(CL1614.Contig2/Tmu007343)基因作為內(nèi)參基因，以幼蟲為對照，計算2-(ΔΔCt)值。結(jié)果表明，相對于幼蟲期，成蟲期上調(diào)表達蛋白及下調(diào)表達蛋白與蛋白組差異表達分析結(jié)果基本相似(圖4)。

(A)為生物學進程，(B)為細胞成分，(C)為分子功能圖3 利用基因本體(GO)對蛋白質(zhì)功能進行分類。蛋白質(zhì)分為生物學、細胞成分、分子功能3種本體論過程Fig.3 Classification of protein functions by Gene Ontology (GO). Proteins were classified into three ontologies: biological process, cellular component, and molecular function

①P<0.05，②P<0.01，③P<0.001。圖4 qRT-PCR驗證多頭帶絳蟲成蟲與幼蟲部分蛋白在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達Fig.4 qRT-PCR confirmed the expression of a part of proteins in adult/larva T.multiceps at gene transcription level

3 討 論

多頭帶絳蟲的生活史需要經(jīng)歷兩個宿主，成蟲寄生于犬、狼等終末宿主的小腸，當成熟孕節(jié)隨糞便排出體外后，被中間宿主羊吞食，蟲卵在腸道消化液的作用下，六鉤蚴逸出鉆入腸壁血管并隨血流到達腦和脊髓中，逐漸生長發(fā)育為腦多頭蚴包囊。當犬等吞食了含有腦多頭蚴的大腦后，原頭蚴附著在小腸壁上逐漸發(fā)育，經(jīng)41～73 d發(fā)育為成蟲。眾所周知，腦多頭蚴對中間宿主神經(jīng)系統(tǒng)大腦具有獨特的偏好性，顯然決定寄生蟲寄生去向的根本原因是其與宿主蛋白的復(fù)雜調(diào)控作用。Podesta 等[13]認為扁型動物門寄生蟲蛋白質(zhì)的合成在轉(zhuǎn)錄后受到控制，并且這些細胞內(nèi)調(diào)節(jié)機制被宿主免疫反應(yīng)的效應(yīng)器激活或抑制，顯然這種時相特異性蛋白對于寄生蟲適應(yīng)宿主尤為重要。

因寄生蟲在不同發(fā)育階段表達蟲體蛋白的差異和獨特的生活史，其對宿主的選擇性、致病性具有較大差異，將iTRAQ技術(shù)運用于寄生蟲蛋白質(zhì)組學研究，能有效找出不同階段寄生蟲表達的差異蛋白及感染后宿主表達的差異蛋白，并能對其進行高精度定量分析，這對進一步探索寄生蟲生活史、研究與宿主的互作機制提供了技術(shù)支撐，同時對寄生蟲病的快速診斷及治療，尋找新的藥物靶點等具有重要意義[14]。

前期我們研究小組通過雙相電泳結(jié)合質(zhì)譜分析初步鑒定了腦多頭蚴原頭節(jié)蛋白，鑒定的蛋白有抗氧化蛋白(蘋果酸脫氫酶和烯醇化酶)、分子伴侶蛋白(熱休克蛋白60和小熱休克蛋白)以及一些結(jié)構(gòu)蛋白(肌動蛋白、肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白和副肌球蛋白)，這些蛋白參與催化、結(jié)合、代謝、分子進程及應(yīng)急反應(yīng)[15]。本研究通過iTRAQ 技術(shù)比較分析了多頭帶絳蟲和幼蟲差異表達蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于幼蟲期，成蟲期69個上調(diào)表達的蛋白中，有35個六鉤蚴蛋白Tso22c肽段，24個熱休克蛋白60(Hsp60)肽段，20個副肌球蛋白肽段，12個8 kDa糖蛋白肽段，3個熱休克蛋白70(Hsp70)肽段，以上結(jié)果可以看出Hsp60、副肌球蛋白、Hsp70在成蟲期表達是富集的，且表達量是上調(diào)的，研究證實寄生蟲可通過產(chǎn)生Hsp70來減少溫度改變和氧化應(yīng)激等反應(yīng)對其造成的損傷，從而適應(yīng)新的寄生環(huán)境[16]，另外，最新研究發(fā)現(xiàn)副肌球蛋白可作為犬盤尾絲蟲病血清診斷的候選生物標志物[17]。而相對于幼蟲，61個成蟲期下調(diào)表達的蛋白中鈣蛋白酶的肽段數(shù)為20 個，抗原cC1和Ca2+轉(zhuǎn)運ATP酶質(zhì)膜各自分別鑒定出12個肽段。因為寄生在終末宿主腸道中的成蟲，不僅需要適應(yīng)復(fù)雜的腸道環(huán)境，還要快速生長發(fā)育，鈣依賴性的蛋白酶是一類在多種生物體內(nèi)廣泛表達的蛋白酶，且與多種生理功能和病理過程如局部腦缺血和神經(jīng)退行性疾病等相關(guān)。研究表明鈣蛋白酶在棘球絳蟲侵襲、遷移及免疫逃避中發(fā)揮重要作用，可能將是抗棘球蚴病藥物和疫苗研究的理想靶標分子[18]。因此，我們推測以上差異表達蛋白可能在多頭帶絳蟲具有相似的功能。

值得注意的是，本研究中鑒定的多頭帶絳蟲路徑注釋的差異蛋白中總計約30%的蛋白參與代謝途徑和次生代謝物的生物合成，我們發(fā)現(xiàn)差異蛋白注釋路徑與一些神經(jīng)系統(tǒng)退行性或神經(jīng)功能障礙的疾病如阿爾茨海默病、亨丁頓舞蹈癥、帕金森病有關(guān)，不同的是腦多頭蚴病是由感染寄生蟲引起的一種神經(jīng)系統(tǒng)寄生蟲病，盡管目前的研究無法解釋多頭帶絳蟲寄生偏好性，但是當前的研究無疑對多頭帶絳蟲不同階段生長發(fā)育關(guān)鍵蛋白的探索提供實驗依據(jù)和思路。

利益沖突：無