11 例原發(fā)性腎性糖尿患兒SLC5A2 基因變異分析

萬靈 陳朝英 涂娟 李華榮

首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院（北京 100020）

原發(fā)性腎性糖尿（primary renal glucosuria，PRG）是由于近段腎小管對葡萄糖的重吸收障礙引起的糖尿，臨床特點是血糖濃度正常，不伴有腎小管的其他功能異常，發(fā)病率為1/20000[1]。其又稱為家族性腎性糖尿（familial renal glucosuria，FRG），是一種常染色體不完全外顯的共顯性遺傳病。絕大多數的PRG患者與Na+-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2（sodium-glucose co-transporter 2，SGLT 2）的編碼基因SLC 5 A 2變異有關（OMIM 182381）[2-4]。為研究PRG 患兒SLC 5 A 2基因變異情況及基因型與表型的關系，本文對11例臨床符合腎性糖尿的患兒進行SLC5A2基因分析。

1 對象及方法

1.1 研究對象

收集2013—2021年確診于首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院的PRG患兒。納入標準：①發(fā)病年齡0～16歲；②臨床符合PRG診斷標準[2,5]；③有基因檢測結果。

本研究經首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 根據病歷資料收集PRG患兒的人口學信息、臨床資料及基因檢測結果。

1.2.2 診斷標準 PRG診斷參照文獻[2,5]：①24 h尿葡萄糖>0.3 g/1.73 m2；②葡萄糖代謝正常；③無其他腎臟病證據，血尿、蛋白尿、氨基酸尿或磷酸鹽尿等，腎功能正常。

糖尿定義：24h尿糖≥0.3 g/1.73m2，<10 g/1.73m2定義為輕度糖尿，≥10 g/1.73m2為重度糖尿。但由于小嬰幼兒留取24 h尿標本困難，故本研究將3次以上晨尿常規(guī)發(fā)現尿葡萄糖+～++者定義為輕度糖尿，尿葡萄糖+++～++++者定義為重度糖尿。

1.2.3 基因檢測 取患兒及其父母的外周靜脈血，提取基因組DNA，送金準基因公司進行高通量測序。測序結果與人類基因變異數據庫（Human Gene Mutaion Database，HGMD）、千人基因組數據庫、gnomAD 數據庫、本地人頻率數據庫對比，將在HGMD 數據庫中未查到，且千人基因組變異頻率<5%、本地人群頻率<2%的基因變異確定為新發(fā)現的變異。變異蛋白根據ACMG 指南進行變異蛋白的致病性預測，采用在線軟件SIFT、PolyPhen2和Mutation Taster 評估和分析錯義變異的致病性，Clustal X軟件進行同源序列比較，以區(qū)分保守序列和非保守序列，Human Splicing Finder軟件預測剪接變異意義，PyMOL軟件（http://www.pymol.org）生成SGLT2蛋白野生型及變異型的三維結構圖。

2 結果

2.1 一般情況

符合納入標準共11例患兒，其中男5例，女6例，男/女比例為1:1.2。診斷年齡為生后1 天～13 歲，中位年齡29 月齡，隨訪病程時長中位數為40 個月（5～105個月）。

11例患兒均無糖尿病家族史，5例有尿糖陽性家族史。2例因尿頻、2例因尿色渾濁黏稠起病就診，其余均為體檢或因其他疾病住院意外發(fā)現尿糖陽性。輕度糖尿2例，重度糖尿9例，均無多飲、多尿、消瘦、出汗、心悸等表現，生長發(fā)育無異常。除例8、例11尿鈣略高[分別為0.11mmol/(kg·d)、0.1mmol/(kg·d)]外，所有患兒血生化、糖化血紅蛋白、空腹及餐后2 h血糖、胰島素、C肽、尿電解質、泌尿系超聲等結果均正常，其他基線信息見表1。

2.2 SLC5A2基因測序結果

11 例患兒未發(fā)現純合變異，雜合變異比例為36%（4/11例），復合雜合變異比例為64%（7/11例），共發(fā)現14種變異，其中有10種錯義變異、1種缺失變異、3種剪接變異（表1）。ACMG指南進行變異蛋白的致病性預測，結果均為VVS（臨床意義未明）。見表2。

表1 11例PRG患兒臨床資料及SLC5A2基因變異分析

表2 ACMG指南進行變異蛋白的致病性預測

錯義變異中，c.655G>A（p.A219T）、c.736C>T（p.P246S）、c.1540C>T（p.P514S）為前期文獻已報道的致病變異，其余c.482C>T（p.S161F）、c.505G>A（p.A 169 T）、c.824 C>T（p.P 275 L）、c.934 G>C（p.A 312 P）、c.1093 G>A（p.A 365 T）、c.1229 A>G（p.Y 410 C）、c.1413 C>G（p.F 471 L）7 種均為新發(fā)現變異。3 種在線軟件SIFT、PolyPhen 2和Mutation Taster預測p.S161F、p.P275L、p.A312P、p.A365T、p.Y410C、p.F471L 6種變異均存在高度致病可能；PolyPhen2和Mutation Taster預測p.A169T為致病性變異，但SIFT軟件預測為良性變異。用Clustal X軟件對所有錯義變異位點進行不同物種同源序列分析，均顯示為高度保守序列（圖1）。用PyMOL軟件生成SGLT2蛋白野生型及變異型的三維結構圖（圖2），發(fā)現新發(fā)現的7種錯義變異均可破壞SGLT2蛋白的局部二級結構、影響蛋白的正常功能。

圖1 10 種SGLT2 錯義變異在8 種生物中的同源保守序列分析圖

圖2 SGLT2 蛋白野生型及7 種新發(fā)現的錯義變異型的三維結構圖（WT:野生型）

缺失變異c.1889_1891del為新發(fā)現的變異，該變異導致第631號氨基酸缺失（p.631del）。

剪接變異為IVS 1-16 C>A、c.1665+5 G>C、c.1449+1G>C。其中c.1665+5G>C為新發(fā)現的變異，生物信息分析軟件Human Splicing Finder預測可能會影響mRNA的正常剪接，該變異臨床意義未明；IVS1-16C>A、c.1449+1G>C為前期文獻報道變異，為致病性變異。

3 討論

腎性糖尿是由于血漿葡萄糖濃度超過腎糖閾值，導致尿中葡萄糖濃度增高所致的臨床綜合征。腎臟對葡萄糖代謝的調節(jié)作用主要包括糖異生、腎小球對葡萄糖濾過和近曲小管對葡萄糖重吸收。因此尿液中葡萄糖應為陰性。當血漿葡萄糖濃度達到近10 mmol/L時，將超過腎糖閾值，導致尿中可檢測到葡萄糖[6]。研究表明，主要有兩種鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白，即SGLT1和SGLT2，參與腎臟對葡萄糖的重吸收[7]。SGLT2特異性地表達于腎臟近曲小管的S 1 段，具有低親和力、高容量的特點，是腎臟近曲小管重吸收葡萄糖的關鍵，80%～90%的葡萄糖由SGLT2轉運蛋白重吸收，鈉離子與葡萄糖的偶聯(lián)比例為1:1[8]。SGLT1主要表達于腸黏膜上皮細胞的刷狀緣，在腎臟近髓質的近端小管S 3 段也有表達，具有高親和力、低容量的特點，未被SGLT 2 轉運的10%～20%的葡萄糖到達S3段被SGLT1重吸收，鈉離子與葡萄糖的偶聯(lián)比例為1:2。SGLT 1 和SGLT 2二者協(xié)同合作以完成原尿中葡萄糖的重吸收[2,4,9]。

2000 年，Santer 等[10]首次報道在PRG 患者中發(fā)現SGLT2蛋白的編碼基因SLC5A2變異，此后一系列研究證實SLC 5 A 2變異是導致FRG 的主要原因[3-4,7-8,11]。SLC5A2基因位于染色體16p11.2，全長7.7kb，包含14個外顯子，編碼672個氨基酸組成的肽鏈[12]。目前國內外報道的SLC5A2基因變異有90多種（人類基因變異數據庫，HGMD professional 2021），包括錯義變異、無義變異、剪接變異、小片段缺失/插入變異等，其中IVS 7+5G>A是熱點變異[13]。邵樂平課題組對7個中國FRG家系進行SLC5A2基因檢測，發(fā)現其中5個家系共11例患者均存在c.886（-10--31）del變異，等位基因變異頻率高達43%，據此推測SLC5A2基因c.886（-10--31）del變異可能是中國人群的高頻變異[14,15]。Yu等[8]對10個FRG家系研究，發(fā)現IVS1-16C>A和c.886（-10--31）del可能是高頻剪接位點變異，當在SLC5A2外顯子中找不到變異時可以優(yōu)先篩選。Dorum 等[11]對16例FRG 患者進行SLC 5 A 2基因檢測，發(fā)現最常見的變異為c.655G>A。

本研究發(fā)現的10種錯義變異中，p.A219T[16-17]、p.P246S[8,18]、p.P514S[8,18-21]為前期文獻報道的已知致病變異，p.S161F、p.A169T、p.P275L、p.A312P、p.A365T、p.Y410C、p.F471L共7種變異為新發(fā)現的變異。ACMG指南預測其變異臨床意義未明，但3種在線軟件SIFT、PolyPhen2和Mutation Taster對變異位點進行致病性預測，除SIFT軟件預測p.A169T為良性變異，其余均為致病性變異或可能致病性變異，ClustalX軟件進行不同物種同源序列分析，顯示所有錯義變異位點均為高度保守序列。利用PyMOL軟件生成SGLT 2 蛋白野生型及變異型的三維結構圖發(fā)現：①在野生型蛋白中，161位絲氨酸與165位苯丙氨酸、157 位纈氨酸之間存在極性相互作用，p.S 161 F 破壞了與纈氨酸之間的極性相互作用，并對周圍的G79、V82、V157及F453之間產生巨大的斥力；②p.A 169 T 可引起第169 位丙氨酸變異為蘇氨酸，破壞了其與165位苯丙氨酸的極性相互作用；③p.P275L可引起第275位脯氨酸變異為亮氨酸，可對周圍的P269、P277、Y528產生巨大斥力；④在野生型蛋白中，A312與T308、I315及L316之間存在極性作用，p.A312P可導致312位丙氨酸變異為脯氨酸，破壞與T308之間的極性，且P312與H309之間可產生一個新的相互作用，對周圍的T 308、H 309、K311之間產生巨大的斥力、破壞氨基酸的二級結構；⑤在野生型蛋白中，A 365 與S 336、Y 366、R 368 及L 369 之間存在極性相互作用，p.A 365 T 可引起365位丙氨酸變異為蘇氨酸，T 365 與Y 366 之間產生了新的極性相互作用，且T365與A89、S362之間產生斥力、破壞這些氨基酸所在的二級結構；⑥野生型蛋白中，Y410與F405、T406、R414及E421之間存在極性作用，p.Y410C可破壞與E421之間的極性作用，且變異后的C 410與T406 之間可產生排斥力、破壞二級結構；⑦p.F471L引起第471位苯丙氨酸變異為亮氨酸，對周圍的F113、Y117、S293及L475產生斥力，破壞了這些氨基酸所在的二級結構。故推測新發(fā)現的7種錯義變異均有致病性。缺失變異c.1889_1891del為新發(fā)變異，導致第631 號氨基酸缺失。剪接變異IVS1-16C>A[8,22]、c.1449+1G>C[18,22]為前期文獻報道的已知致病變異，c.1665+5G>C為新發(fā)變異，生物信息分析軟件Human Splicing Finder預測可能會影響mRNA的正常剪接。

多項研究表明，在PRG患者中，無論何種變異（如錯義變異、無義變異或剪接位點變異），雜合變異個體多表現為輕度糖尿，而純合變異或復合雜合變異患者通常表現為重度糖尿[23-24]。本研究中例1、2、8、11以及例3、4、5、9的父親和例10的母親均為雜合變異，其中僅例1、8表現為重度糖尿，其余均為輕度糖尿，而例3、4、5、6、7、9、10均攜帶復合雜合變異，都表現為重度糖尿，與前期文獻報道相符。這可能是由于雜合變異導致單倍劑量不足，腎小管上皮細胞正常表達的SGLT2數量減少，導致葡萄糖重吸收減少而呈現少量糖尿；而復合雜合變異可導致更嚴重的近端小管的重吸收障礙。

本研究中除例1的父母外，其余父母均進行基因檢測。例2、8、11基因變異均來源于父母其中一方，但攜帶相同變異的父親或母親多次尿檢葡萄糖均為陰性，說明SLC5A2相同的基因型可以有不同的表型。攜帶復合雜合變異的例3、4、5、6、7、9、10，其攜帶的2個變異位點均分別來源于父母，但僅例3、4、5、9的父親和例10的母親有輕度糖尿表現，其余攜帶雜合變異的父母多次尿檢均無尿糖，符合既往學者提出的SLC5A2基因存在不完全外顯的共顯性特征[24-25]。

此外，例1、11雖然都為雜合錯義變異，但例1表現為重度糖尿，例11為輕度糖尿。分析發(fā)現，例1攜帶的變異c.655G>A 為已報道的常見致病變異[11]，可引起第219 位氨基酸由丙氨酸變異為蘇氨酸，SIFT、PolyPhen2和Mutation Taster等3種軟件預測致病性均考慮高度致病。而例11攜帶的變異c.505G>A為新發(fā)現的變異，僅PolyPhen2和Mutation Taster軟件預測為致病性變異，SIFT軟件預測為良性變異，且蛋白質的三維結構圖顯示，變異引起第169位丙氨酸變異為蘇氨酸，僅可破壞與165位苯丙氨酸的極性作用，破壞范圍較小。由此說明，雖然變異類型相同，但不同位點的變異，表型可有明顯差異。

例2 為缺失變異，臨床表現為輕度糖尿，而其攜帶相同變異的父親則臨床無尿糖表現，分析發(fā)現c.1889_1891 del 可導致第631 號氨基酸缺失（p.631del），該位點位于氨基酸序列的末端，考慮可能對編碼的SGLT2蛋白功能影響較小，或者其正常的等位基因可代償一部分葡萄糖重吸收功能，故患兒與其父親表型不同。

本研究共發(fā)現了2 例患兒攜帶了文獻報道的高頻剪接位點變異IVS 1-16 C>A，1 例患兒攜帶c.655G>A，其余絕大多數變異仍然是某個PRG家族特有和專屬的，與既往研究一致[2,8,11]，未發(fā)現變異熱點IVS 7+5G>A和c.886（-10--31）del，考慮可能與本研究的病例數較少有關，需要后期擴大樣本量分析。前期國內外的研究大多數均基于成人PRG，發(fā)現其預后較好，一般無需特殊治療，只需適當增加碳水化合物的攝入量，而關于兒童期發(fā)病的PRG的研究極少。本研究對所有患兒進行了隨訪，最長隨訪時間為105個月，臨床均無糖尿病“三多一少”癥狀或全身乏力表現，生長發(fā)育正常，無嚴重并發(fā)癥。但也有文獻報道，PRG患者在妊娠期間出現尿糖增多，可出現滲透性利尿而導致多尿、脫水甚至意識喪失[26]，在極度饑餓時可出現酮癥[27]，因此仍需定期隨訪。