干眼寒燥證大鼠模型建立與驗(yàn)證

陳立浩，陳雄，彭清華，姚小磊，彭俊，湯鈺

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.河北省眼科醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054001；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；4.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；5.湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護(hù)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208

干眼是由多因素導(dǎo)致的眼表疾病，其特征在于淚膜穩(wěn)態(tài)喪失，并伴有眼部干澀、異物感、燒灼感、視疲勞及視力波動(dòng)等癥狀，部分患者會(huì)出現(xiàn)眼睛局部疼痛，影響視覺(jué)功能及生活質(zhì)量。淚膜的不穩(wěn)定性、高滲性、眼表炎癥和損害及神經(jīng)感覺(jué)異常是其主要病因[1]。干眼患病率較高，不同地區(qū)發(fā)病率有一定差異。日本一項(xiàng)研究表明，超過(guò)半數(shù)眼科門診患者患有干眼[2]，其中，女性和高齡人群是干眼發(fā)生的高危人群，與體內(nèi)激素水平下降有關(guān)[3-5]。

干眼與環(huán)境有關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為干燥環(huán)境能使眼表淚液蒸發(fā)過(guò)快，從而導(dǎo)致干眼發(fā)生。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“燥勝則干”。燥分內(nèi)外，其中外燥包含寒燥、熱燥，熱燥傷津所致干眼肺陰不足證較常見(jiàn)，常采用滋陰潤(rùn)燥法治療。寒能生燥，即寒冷干燥環(huán)境能誘發(fā)、加重干眼。目前，國(guó)內(nèi)有學(xué)者從病因角度構(gòu)建了燥證模型[6]，但未檢測(cè)模型動(dòng)物眼部指標(biāo)，不能確定是否對(duì)眼表淚液分泌、淚膜破裂時(shí)間，以及動(dòng)物瞼板腺狀態(tài)、角膜狀態(tài)有所影響。本實(shí)驗(yàn)建立干眼寒燥證大鼠模型，并通過(guò)以方測(cè)證驗(yàn)證模型是否成功，為建立穩(wěn)定可靠的干眼寒燥證模型提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康7～8周齡SD大鼠36只，雌性，體質(zhì)量（200±20）g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)430727211100971767。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審批（LLBH-202105070002）。

1.2 藥物

增液湯合四味大發(fā)散（玄參15 g， 生地黃10 g，麥冬10 g，麻黃5 g，藁本5 g，蔓荊子5 g，細(xì)辛3 g，生姜5 g），飲片購(gòu)于湖南衡岳中藥飲片有限公司，所有飲片混合后加水煎煮，過(guò)濾，濃縮至原藥材濃度為0.29 g/mL，冷藏保存。艾條，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL試劑盒，貨號(hào)C1088，上海碧云天生物；淚液檢測(cè)濾紙條，批號(hào)20100040，天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；超敏發(fā)光液，貨號(hào)RJ239676，美國(guó)賽默飛；蘇木素染液，貨號(hào)ZLI-9610，北京中杉金橋；伊紅染液，貨號(hào)G1100，北京索萊寶。低溫低濕小動(dòng)物逆境實(shí)驗(yàn)箱（型號(hào)NJYW-518D，寧波江南儀器廠），裂隙燈顯微鏡（型號(hào)SL-D8Z，日本日立），手持裂隙燈（型號(hào)KJ5S1，中國(guó)康捷），熒光顯微鏡（型號(hào)CKX53，日本Olympus），切片機(jī)（型號(hào)2235，德國(guó)Leica）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，使用淚液檢測(cè)濾紙條檢測(cè)淚液分泌量，剔除極端低值大鼠12只，剩余24只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、中藥組和灸法組，每組6只。

空白組在正常溫度、濕度下以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余3組進(jìn)行造模：設(shè)置低溫低濕小動(dòng)物逆境實(shí)驗(yàn)箱溫度12℃、濕度20%，每日將大鼠置于實(shí)驗(yàn)箱中10 h以上，連續(xù)21 d，造模過(guò)程中及時(shí)更換墊料。大鼠可出現(xiàn)畏寒、蜷縮體態(tài)，飲水量、尿量增加，毛發(fā)枯黃，尾靜脈發(fā)紫等情況。

2.2 干預(yù)

第22日開(kāi)始干預(yù)，中藥組以增液湯合四味大發(fā)散5.89 g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)7 d；灸法組懸灸大鼠上下眼瞼，隔日1次，每次10 min，共4次；空白組和模型組不干預(yù)。干預(yù)過(guò)程中，除空白組外，其余各組參照造模方法繼續(xù)在低溫低濕環(huán)境中飼養(yǎng)。

2.3 眼表體征采集

分別于第1、7、21、28日檢測(cè)各組大鼠淚液分泌量及淚膜破裂時(shí)間；觀察大鼠造模前后角膜熒光素染色、特征性舌象。

2.3.1 淚液分泌量

腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，將淚液檢測(cè)濾紙條底端置于大鼠右下眼瞼1/3結(jié)膜囊處，5 min后取出，迅速測(cè)量試紙濕長(zhǎng)。

2.3.2 淚膜破裂時(shí)間

大鼠麻醉后，將熒光素鈉溶液滴至大鼠右下眼瞼內(nèi)，對(duì)大鼠進(jìn)行瞬目輔助操作2～3次。通過(guò)裂隙燈鈷藍(lán)光記錄淚膜破裂時(shí)間（以角膜出現(xiàn)第1個(gè)黑色干燥斑點(diǎn)的時(shí)間為準(zhǔn)）。

2.3.3 角膜熒光素染色

將熒光素鈉溶液滴至大鼠右眼結(jié)膜囊內(nèi)進(jìn)行角膜熒光素染色，用裂隙燈顯微鏡在鈷藍(lán)光下觀察角膜變化。角膜損傷部位可見(jiàn)嫩綠色著色。

2.4 舌象記錄

采用裂隙燈顯微鏡自帶相機(jī)記錄大鼠造模前后舌象。

2.5 HE染色

干預(yù)結(jié)束后，頸椎脫臼法處死大鼠，分離淚腺組織，剝離瞼板腺，置于4%多聚甲醛中固定。取出組織，流水沖洗，70%、80%、90%乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。石蠟切片烤片，脫蠟，水化，蘇木素染液染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，水洗，返藍(lán)液返藍(lán)15 s，流水沖洗，伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

2.6 TUNEL染色

石蠟切片放入65℃烤箱中烤2 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各放置10 min脫蠟，梯度乙醇水化，滴加蛋白酶K工作液，37℃反應(yīng)30 min；PBS洗滌3次，每次5 min，滴加TUNEL染色液，42℃避光孵育1 h；PBS洗去多余染色液，滴加DAPI避光孵育3 min染核，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)，組間比較方差齊用單因素方差分析，方差不齊用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 淚液分泌量檢測(cè)結(jié)果

造模第7、21日，與空白組同一時(shí)點(diǎn)比較，模型組、中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）；造模第21日，與本組第1日比較，模型組、中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）。與空白組同一時(shí)點(diǎn)比較，模型組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）；與模型組同一時(shí)點(diǎn)比較，中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量增加（P＜0.05）；與本組第21日比較，中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量增加（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠淚液分泌量比較（±s，mm）

表1 各組大鼠淚液分泌量比較（±s，mm）

注：與空白組同一時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05；與本組第1日比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組同一時(shí)點(diǎn)比較，#P＜0.05；與本組第21日比較，☆P＜0.05

組別空白組模型組中藥組灸法組只數(shù)6 6 6 6第1日11.83±2.79 11.17±3.43 14.00±3.58 10.83±2.78第7日12.17±2.04 7.33±1.21*7.50±2.07*△△7.00±1.41*△第21日11.50±2.59 4.33±1.63*△4.00±1.55*△△3.50±5.83*△△第28日10.67±2.42 2.67±1.03*8.50±1.52#☆9.00±2.83#☆

4.2 淚膜破裂時(shí)間檢測(cè)結(jié)果

造模第21日，與空白組同一時(shí)點(diǎn)比較，模型組、中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）；與本組第1日比較，模型組、中藥組和灸法組大鼠淚液分泌量減少（P＜0.05）。干預(yù)7 d后（第28日），中藥組和灸法組大鼠淚膜破裂時(shí)間較模型組及本組第21日有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠淚膜破裂時(shí)間比較（±s，s）

表2 各組大鼠淚膜破裂時(shí)間比較（±s，s）

注：與空白組同一時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05；與本組第1日比較，△P＜0.05

組別空白組模型組中藥組灸法組只數(shù)6 6 6 6第1日7.33±1.63 6.50±1.87 8.17±1.72 7.00±2.10第7日7.67±1.63 4.83±2.23*4.67±2.73 5.00±1.67第21日7.50±0.84 4.00±2.37*△3.33±1.21*△2.67±1.03*△第28日8.00±1.79 3.17±1.72*4.67±1.63 4.33±1.51

4.3 角膜熒光素染色結(jié)果

造模前大鼠角膜清澈，未見(jiàn)損傷；造模后大鼠角膜混濁，出現(xiàn)不同程度的點(diǎn)狀、片狀侵損。見(jiàn)圖1。

圖1 造模前后大鼠角膜熒光素染色

4.4 舌象觀察結(jié)果

造模前大鼠舌淡紅，苔薄白；造模后大鼠舌象發(fā)生一定變化，主要表現(xiàn)為舌苔由濕潤(rùn)變干燥和舌體萎縮，尤其是舌體前1/3處凹陷。見(jiàn)圖2。

圖2 造模前后大鼠舌象

4.5 HE染色結(jié)果

空白組大鼠瞼板腺腺泡呈細(xì)長(zhǎng)或球形，腺泡周圍可見(jiàn)毛細(xì)血管；模型組大鼠瞼板腺腺泡紊亂，部分細(xì)胞核丟失，大量間充質(zhì)細(xì)胞聚集；中藥組和灸法組大鼠瞼板腺腺泡紊亂情況有所改善。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠瞼板腺形態(tài)（HE染色）

空白組大鼠淚腺組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠淚腺組織有大量炎性細(xì)胞聚集；中藥組和灸法組大鼠淚腺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠瞼板腺和淚腺形態(tài)（HE染色）

4.6 TUNEL染色結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠瞼板腺和淚腺組織細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和灸法組大鼠瞼板腺和淚腺組織細(xì)胞凋亡率顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 各組大鼠瞼板腺和淚腺組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，每組6只）

圖7 各組大鼠淚腺組織細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)（TUNEL染色，×400）

圖6 各組大鼠瞼板腺組織細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)（TUNEL染色，×400）

5 討論

干眼與眨眼、瞼板腺、睡眠、白內(nèi)障、屈光矯治、眼瞼整形、藥物、環(huán)境等因素有關(guān)，治療方法包括替代與對(duì)癥支持、免疫抑制等，但效果并不理想。干眼屬中醫(yī)學(xué)“白澀”“神水將枯”“干澀昏花”等范疇。常見(jiàn)證型包括肺陰不足證、肝經(jīng)郁熱證、氣陰兩虛證、邪熱留戀證[7]。隨著社會(huì)發(fā)展，人們工作和生活習(xí)慣發(fā)生改變，長(zhǎng)時(shí)間使用電子設(shè)備使眼睛長(zhǎng)期暴露于干燥環(huán)境中，出現(xiàn)干眼[8-9]。按照《中國(guó)干眼專家共識(shí)：定義和分類（2020年）》中的發(fā)病原因和危險(xiǎn)因素分類，屬于環(huán)境因素性干眼[10]。中醫(yī)認(rèn)為，寒燥與熱燥有所區(qū)別，夏季空調(diào)冷氣環(huán)境或北方寒冷干燥的冬季氣候?qū)儆诤锃h(huán)境，可從寒燥論治[11]。

淚膜是覆蓋于眼球表面的一層液體，屬中醫(yī)津液。干眼患者或脂質(zhì)層受損致淚液蒸發(fā)過(guò)快，或水液層缺乏導(dǎo)致淚液不足，或黏蛋白層遭到破壞使淚膜不穩(wěn)。故干眼可看作津液異常所致，屬中醫(yī)津液病范疇。影響津液的病理因素眾多，其中以燥邪最為直接。久處空調(diào)冷氣環(huán)境，易感受風(fēng)、寒、燥邪，三邪相持，發(fā)為干眼?！霸镆讉颉?，風(fēng)燥灼耗上部（眼部）津液，導(dǎo)致眼淚生化無(wú)源?！端貑?wèn)病機(jī)氣宜保命集·病機(jī)論》有“寒能收斂，收斂則燥澀皴揭”，寒性收引凝結(jié)，風(fēng)寒襲肺，使津液運(yùn)行停滯，無(wú)法正常發(fā)揮滋潤(rùn)濡養(yǎng)功能，也會(huì)出現(xiàn)“干燥”的外在表現(xiàn)，即“寒能生燥”。由寒燥環(huán)境誘發(fā)或加重的干眼，病機(jī)當(dāng)屬外感寒燥，治以滋陰潤(rùn)燥聯(lián)合解表，以宣通眼部玄府。此法既能潤(rùn)燥，又能發(fā)散風(fēng)寒邪氣。若久病陰陽(yáng)兩虛，需在此基礎(chǔ)上聯(lián)合溫陽(yáng)，陰陽(yáng)并補(bǔ)。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院眼科鄒菊生教授在滋陰生津基礎(chǔ)上采用宣通玄府治療干眼[12]。其自擬方寒溫并用，除熟地黃、黃精、沙參、麥冬等滋陰之品外，還使用西河柳、浮萍、紫蘇葉、石菖蒲通竅發(fā)汗利水，巴戟天溫陽(yáng)行氣。張殷建教授繼承鄒菊生教授學(xué)術(shù)思想，擅于運(yùn)用發(fā)汗解表法治療干眼，獲得良效[12]。

常見(jiàn)干眼動(dòng)物模型包括轉(zhuǎn)基因干眼動(dòng)物模型，如干燥綜合征NOD小鼠、OPN轉(zhuǎn)基因小鼠模型、人源化SS小鼠模型、缺乏結(jié)膜杯狀細(xì)胞Spdef-/-小鼠的黏蛋白缺乏型干眼模型[13]。破壞特定部位可進(jìn)行干眼造模，如燒灼瞼板腺引起瞼板腺功能障礙，從而形成蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼[14]；摘除淚腺可致淚液缺乏型干眼[15]；局部滴用含防腐劑苯扎氯銨的滴眼液可損傷角膜上皮細(xì)胞制備干眼模型[16]；利用去勢(shì)方式可以制備激素缺乏所致干眼模型[17]；采用藥物誘導(dǎo)，如東莨菪堿競(jìng)爭(zhēng)性抑制淚腺M(fèi)受體，抑制淚液分泌[18]；肉毒桿菌毒素抑制突觸前膜與神經(jīng)遞質(zhì)囊泡的融合，阻斷汗腺、淚腺神經(jīng)肌肉和膽堿能神經(jīng)連接[19]；使用雄激素受體或拮抗劑灌胃可制備雄激素缺乏型干眼模型[20]。

利用環(huán)境因素也可制備干眼模型。Barabino等[21]將小鼠暴露于相對(duì)濕度18.5%±5.1%、溫度21～23℃、氣流15 L/min環(huán)境，建立了由低濕度環(huán)境誘導(dǎo)的干眼模型。Seo等[22]將小鼠置于濕度為15%的環(huán)境中，聯(lián)合皮下注射氫溴酸東莨菪堿（5 mg/mL）誘導(dǎo)干眼模型。

相較而言，使用轉(zhuǎn)基因干眼動(dòng)物模型簡(jiǎn)單方便，但費(fèi)用昂貴，經(jīng)濟(jì)性較差。藥物誘導(dǎo)、環(huán)境因素誘導(dǎo)等方式兼具方便性和經(jīng)濟(jì)性?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的造模方式。

本實(shí)驗(yàn)將寒燥與干眼創(chuàng)新性結(jié)合，建立干眼寒燥證大鼠模型。利用低溫低濕小動(dòng)物逆境實(shí)驗(yàn)箱配合干燥劑局部使用，能夠減少大鼠淚液分泌量和淚膜破裂時(shí)間，且出現(xiàn)眼表?yè)p傷。造模后大鼠舌象由濕潤(rùn)變干燥，出現(xiàn)舌體前1/3萎縮、凹陷，提示肺臟虛損。肺主行水，濡潤(rùn)雙目，肺虛則津液匱乏，目失所養(yǎng)，發(fā)為干眼。舌證相符。寒燥對(duì)應(yīng)中醫(yī)治法為溫潤(rùn)，增液湯合四味大發(fā)散治法可歸納為滋陰、解表、溫陽(yáng)。中藥干預(yù)后，大鼠淚液分泌量增加，淚膜破裂時(shí)間延長(zhǎng)，眼表體征改善，說(shuō)明方證對(duì)應(yīng)，干眼寒燥證模型構(gòu)建成功。灸法用于干眼治療效果突出，且優(yōu)于人工淚液[23]。本實(shí)驗(yàn)將灸法組作為陽(yáng)性對(duì)照組，結(jié)果顯示中藥組和灸法組在抑制淚腺、瞼板腺炎癥及細(xì)胞凋亡程度上作用相近。

本實(shí)驗(yàn)也存在諸多設(shè)計(jì)不足：在以方測(cè)證中未使用經(jīng)典名方或公認(rèn)方劑，結(jié)果說(shuō)服力不足。溫潤(rùn)法是參照上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院鄒菊生教授等對(duì)干眼的治法，但其自擬方中部分藥物臨床使用較少，增液湯合四味大發(fā)散是由經(jīng)典名方增液湯與眼科專方四味大發(fā)散化裁而成，臨床療效尚可，故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)選擇使用該方。另外，北方冬季氣候寒冷干燥，但室內(nèi)多屬熱燥，因此模型與實(shí)際不完全相符，而與夏季頻繁使用冷空調(diào)狀態(tài)更契合。今后，本課題組將從微觀層面進(jìn)一步探索干眼寒燥證模型的免疫、凋亡機(jī)制，研究不同濃度方藥對(duì)本病的療效。