基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥機(jī)制

桂越蓉，王爍，董軍，周彤，王丹丹，侯煒

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053

全球癌癥統(tǒng)計(jì)最新數(shù)據(jù)顯示，2020年乳腺癌新發(fā)病例230萬例（11.7%），已超過肺癌成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤；死亡68.5萬例，為全球第五大癌癥死亡原因[1]。2020年我國(guó)乳腺癌新發(fā)病例約42萬例，發(fā)病率居全球第一，死亡約11.7萬例，居女性惡性腫瘤死亡首位[2]。70%～80%乳腺癌患者表達(dá)雌激素受體（estrogen receptors，ER），內(nèi)分泌治療（endocrine therapy，ET）已成為ER陽性乳腺癌患者主要且有效的治療方式[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在晚期ER陽性乳腺癌患者中，僅有20%～40%對(duì)一線ET方案有效，其中約50%在治療8～14個(gè)月后因ET耐藥而發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[4]。因此，逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET后繼發(fā)耐藥，提高乳腺癌對(duì)ET的敏感性，繼而防止耐藥后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，是臨床亟待解決的難題。

近年來，中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面顯示出一定的優(yōu)勢(shì)，已有研究顯示，中醫(yī)藥能逆轉(zhuǎn)順鉑、阿霉素（ADR）等化療耐藥，提高其抗腫瘤活性[5-6]。乳腺癌患者在ET期間，由于藥物干預(yù)雌激素功能發(fā)揮，出現(xiàn)類更年期癥狀，本院林洪生教授認(rèn)為該階段的中醫(yī)病機(jī)以腎虛為本，患者還表現(xiàn)出烘熱汗出、煩躁易怒、頭暈耳鳴、心悸失眠、筋急骨痛等癥狀，為肝火內(nèi)擾之象，故確立了乳腺癌ET期間以益腎清肝為主的治療大法。益腎清肝方是林洪生教授以丹梔逍遙散為主加減治療乳腺癌ET耐藥的臨床經(jīng)驗(yàn)方，結(jié)合既往研究成果組方而成，藥用白芍、丹參、柴胡、牡丹皮、當(dāng)歸、苦參、山萸肉、澤瀉、熟地黃、梔子，臨床實(shí)踐顯示該方有不同程度的抑制腫瘤生長(zhǎng)、延緩耐藥、提高機(jī)體免疫功能等功效，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探索益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥的潛在靶點(diǎn)與可能機(jī)制，為該方的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 益腎清肝方活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[7]分別檢索益腎清肝方組方藥物白芍、丹參、柴胡、牡丹皮、當(dāng)歸、苦參、山茱萸、澤瀉、熟地黃、梔子的化學(xué)成分，時(shí)間截至2021年7月24日。根據(jù)TCMSP的ADME參數(shù)[8-9]，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選具有較高活性的化合物。在相關(guān)靶點(diǎn)（related targets）搜索欄過濾出活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白，借助UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）[10]查詢靶蛋白所對(duì)應(yīng)的人類基因名稱。

1.2 乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥相關(guān)靶點(diǎn)檢索

以“Breast cancer resistance to endocrine therapy”為關(guān)鍵詞，檢索GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），獲得乳腺癌ET耐藥的原始基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)（GSE67916）[11]。該數(shù)據(jù)包括4個(gè)對(duì)他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞系（TamR MCF7/S0.5）TamR1、TamR4、TamR7、TamR8及1個(gè)對(duì)他莫昔芬敏感的乳腺癌細(xì)胞系MCF7/S0.5，分析了2種細(xì)胞系的差異基因表達(dá)譜（基因芯片平臺(tái)GPL570）。將耐藥株設(shè)置為試驗(yàn)組，敏感株設(shè)置為對(duì)照組，進(jìn)行GEO2R分析。導(dǎo)出全部分析結(jié)果，以P＜0.05、logFC＞1或logFC＜-1為篩選閾值，獲得乳腺癌ET耐藥相關(guān)差異表達(dá)基因。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將篩選得到的藥物靶點(diǎn)與疾病差異基因分別去重，然后取交集得到共同靶點(diǎn)，為益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥的潛在作用靶點(diǎn)。登錄STRING11.5數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）[12]，選擇“multiple protein”模式，上傳活性成分與疾病的交集靶點(diǎn)，物種選擇“Homo sapience”，設(shè)置最低相互作用閾值“medium confidence（0.400）”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中的游離節(jié)點(diǎn)，下載tsv文件，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值篩選益腎清肝方逆轉(zhuǎn)ET耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO和KEGG通路富集分析

將藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape基因功能注釋分析工具（https://metascape.org/）[13]，進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。物種輸入選擇“Homo sapience”，設(shè)定富集的統(tǒng)計(jì)顯著性“P Value Cutoff=0.01”，獲得益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥潛在靶點(diǎn)的主要基因功能及參與的信號(hào)通路。將富集結(jié)果按P值升序排列，分別對(duì)GO富集的前10位條目和KEGG富集的前20位條目進(jìn)行可視化展示。將KEGG富集的前20條通路所包含的靶點(diǎn)及活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.8.2構(gòu)建靶點(diǎn)-活性成分-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.5 分子對(duì)接

將益腎清肝方逆轉(zhuǎn)ET耐藥的主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，以驗(yàn)證成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。檢索蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫PDB和PubChem，得到靶點(diǎn)與活性成分的三維及化學(xué)結(jié)構(gòu)，使用PyMOL軟件對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行去水、去磷酸根等操作，利用AutoDock Tools 1.5.6將化合物與靶點(diǎn)蛋白pdb格式轉(zhuǎn)為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后運(yùn)行AutoDock Vina 1.2.0進(jìn)行對(duì)接。一般認(rèn)為，結(jié)合能＜-4.25 kcal/mol表示配體小分子與受體蛋白之間有一定的結(jié)合活性，結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表示二者之間有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol表示成分與靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[14]。

2 結(jié)果

2.1 益腎清肝方活性成分、靶點(diǎn)及乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得益腎清肝方中藥物1 375個(gè)化學(xué)成分（白芍85個(gè)，丹參202個(gè)，柴胡349個(gè)，牡丹皮55個(gè)，當(dāng)歸125個(gè)，苦參113個(gè)，山茱萸226個(gè)，澤瀉46個(gè)，梔子98個(gè)、熟地黃76個(gè)），按OB≥30%、DL≥0.18標(biāo)準(zhǔn)共篩選出活性化合物176個(gè)，包括白芍13個(gè)，丹參65個(gè)，柴胡17個(gè)，牡丹皮11個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，苦參45個(gè)，山茱萸20個(gè)，澤瀉10個(gè)，梔子15個(gè)，熟地黃2個(gè)，26個(gè)為共有成分。176個(gè)候選化合物中，124個(gè)可以在TCMSP數(shù)據(jù)庫中匹配到共2 615個(gè)人類靶點(diǎn)，去重后最終得到254個(gè)。通過在GEO數(shù)據(jù)庫中對(duì)MCF7耐藥株和敏感株的差異基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，共獲得差異表達(dá)基因1 857個(gè)（見圖1），去除重復(fù)后獲得1 467個(gè)乳腺癌ET耐藥相關(guān)靶基因。

圖1 乳腺癌ET耐藥差異表達(dá)基因火山圖

2.2 交集靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將藥物靶點(diǎn)和ET耐藥相關(guān)靶點(diǎn)取交集共得到30個(gè)共同作用靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)生成PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape3.8.2進(jìn)行可視化（見圖2）。該網(wǎng)絡(luò)包含28個(gè)節(jié)點(diǎn)、158條邊。其中度值、介數(shù)大的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)是益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)，前8位關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)見表1。

圖2 益腎清肝方與乳腺癌ET耐藥交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

2.3 GO和KEGG富集分析結(jié)果

將益腎清肝方逆轉(zhuǎn)ET耐藥的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析得到生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）各418、33、39條。取P值排名前10位的條目，進(jìn)行可視化分析（見圖3）。其中生物過程主要包括細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of cellular）、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育（reproductive structure development）、生殖系統(tǒng)發(fā)育（reproductive system development）、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)（response to cytokine）、對(duì) 荷 爾 蒙 的 反 應(yīng)（response to hormone）等。

圖3 益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥靶點(diǎn)GO富集分析

KEGG富集分析共得到114條信號(hào)通路，對(duì)前20條信號(hào)通路進(jìn)行可視化展示（見圖4）。益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥涉及多條信號(hào)通路，主要包括FoxO信號(hào)通路（FoxO signaling pathway）、P53信號(hào)通路（P53 signaling pathway）、雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

圖4 益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.4 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

將KEGG富集的前20條通路所涉及的活性成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建靶點(diǎn)-活性成分-通路網(wǎng)絡(luò)（見圖5）。該網(wǎng)絡(luò)共有56個(gè)節(jié)點(diǎn)、193條連線，包含靶點(diǎn)25個(gè)、益腎清肝方活性成分11個(gè)。按度值降序排列，活性成分的拓?fù)鋮?shù)見表2。

圖5 益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

表2 益腎清肝方核心活性成分拓?fù)鋮?shù)

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

將益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥的前8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)分別與主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果顯示結(jié)合能均小于0，表明益腎清肝方活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間均存在結(jié)合活性，且所有活性成分分別與MAPK1、PGR、MAPK8關(guān)鍵靶點(diǎn)之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，結(jié)合能均小于-7.0 kcal/mol，其中PGR與活性成分之間的結(jié)合活性最佳（見圖6）。

圖6 益腎清肝方核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接熱圖

3 討論

益腎清肝方中牡丹皮、梔子、當(dāng)歸、白芍、柴胡取丹梔逍遙散之意，養(yǎng)血柔肝、滋肝陰、瀉肝火。有研究顯示，丹梔逍遙散能有效改善乳腺癌患者ET后類更年期綜合征，且不影響性激素水平[15-16]。方中熟地黃、山萸肉滋腎益肝，澤瀉、牡丹皮利濕泄熱，四藥合用，一補(bǔ)一瀉，取六味地黃丸之意，肝腎陰并補(bǔ)，以滋腎陰為主，契合乳腺癌ET期間的病機(jī)；丹參一味功同“四物”，生血活血，行血而不傷正，以通為補(bǔ)，能間接起到補(bǔ)益作用。研究表明，隱丹參酮能抑制細(xì)胞膜上乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）寡聚物的形成，從而阻斷藥物流出，使乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療敏感[17]。課題組既往研究表明，苦參提取物氧化苦參堿能抑制MCF7細(xì)胞的體外成球能力，體內(nèi)能抑制乳腺癌腫瘤干細(xì)胞（BCSCs）荷瘤裸鼠的成瘤能力，而BCSCs是導(dǎo)致乳腺癌耐藥的主要原因之一[18]。以上均奠定了益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥的基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，益腎清肝方逆轉(zhuǎn)ET耐藥的主要活性成分為β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、槲皮素、豆甾醇、苦參堿、隱丹參酮、兒茶素等，可能在乳腺癌ET耐藥中發(fā)揮重要作用。β-谷甾醇是一種廣泛存在于植物種子和果實(shí)中的天然植物固醇，其在體外能對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用[19]。Awad等[20]研究顯示，β-谷甾醇與他莫昔芬聯(lián)合使用能在體外顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與β-谷甾醇刺激絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性，從而增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)和神經(jīng)酰胺（CER）促進(jìn)的凋亡信號(hào)相關(guān)。BCSCs自我更新與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在乳腺癌ET耐藥及耐藥后的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[21]。有研究顯示，木犀草素可能通過下調(diào)乳腺癌細(xì)胞β-catenin的表達(dá)、抑制BCSCs的自我更新，進(jìn)而抑制EMT過程，降低人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和BT549細(xì)胞的侵襲和遷移能力[22]。腺苷三磷酸結(jié)合（ABC）亞家族蛋白成員是目前已知在腫瘤化療耐藥中發(fā)揮重要作用的蛋白家族成員[23-24]。有研究顯示，山柰酚與ADR聯(lián)合用藥后，可以降低ADR在MCF7耐ADR細(xì)胞（MCF7/ADR）中的IC50值，誘導(dǎo)MCF7/ADR細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與山柰酚降低ABC亞家族蛋白成員ABCB1蛋白表達(dá)有關(guān)[25-26]。槲皮素是一種天然存在的具有良好生物活性的植物化學(xué)物質(zhì)，對(duì)多種癌細(xì)胞系具有殺傷活性[27]。有研究顯示，在槲皮素作用下，他莫昔芬對(duì)耐藥細(xì)胞的增殖抑制和凋亡效應(yīng)呈劑量遞增趨勢(shì)，提示槲皮素可能具有逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)ET的耐藥性[28]。但由于槲皮素水溶性差、體內(nèi)代謝快、半衰期短，導(dǎo)致生物利用度低，從而限制其在醫(yī)藥上的應(yīng)用[27]。苦參堿是從苦參中提取的一種活性堿，能通過降低AKT的磷酸化，調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)，逆轉(zhuǎn)乳腺癌的多藥耐藥[29]。隱丹參酮是從丹參中提取的一種脂溶性蒽醌類衍生物，有良好的抗炎、抗氧化及抗腫瘤活性[30]。Ni等[17]研究顯示，隱丹參酮能以ERα依耐性和非依耐性的方式抑制BCRP活性，增加乳腺癌對(duì)化療的敏感性。兒茶素是一種黃烷醇類化合物，具有明顯的抗癌活性。研究顯示，兒茶素及其衍生物能通過抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、ABCB1介導(dǎo)的藥物外排，將細(xì)胞內(nèi)藥物濃度恢復(fù)至細(xì)胞毒水平，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[31]。以上均說明益腎清肝方的主要活性成分可能通過下調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)、抑制BCSCs自我更新、抑制PI3K-Akt等信號(hào)通路等機(jī)制發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥作用。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)對(duì)益腎清肝方的核心靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示ESR1、TP53、STAT3、MAPK1、PGR等可能是益腎清肝方治療乳腺癌ET耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。雌激素受體α基因（ESR1）突變是導(dǎo)致乳腺癌ET耐藥最常見的原因，ESR1突變將引起ER活性提高和ER表達(dá)上調(diào)，甚至產(chǎn)生不依賴雌激素的自發(fā)活性[32]。研究顯示，接受內(nèi)分泌治療后，15%～30%的乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)ESR1配體結(jié)合區(qū)域的突變，ESR1突變將縮短后續(xù)使用芳香化酶抑制劑類藥物治療患者的無進(jìn)展生存期，從而產(chǎn)生ET耐藥[33]。TP53是一種重要的抑癌基因，大約30%的乳腺癌患者含有TP53基因的體細(xì)胞突變，超過80%的三陰性乳腺癌患者存在TP53點(diǎn)突變或缺失[34-35]。TP53突變可導(dǎo)致化療耐藥，與乳腺癌患者治療反應(yīng)差和生存率下降有關(guān)[36-37]。腫瘤干細(xì)胞（CSCs）自我更新是癌癥進(jìn)展和化療耐藥性的重要機(jī)制之一。Wang等[38]研究顯示，STAT3能通過上調(diào)BCSCs中肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1B（CPT1B）等編碼脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶（FAO）表達(dá)，促進(jìn)BCSCs自我更新和乳腺癌化療耐藥，而抑制STAT3可下調(diào)CPT1B基因表達(dá)，阻斷BCSCs自我更新，恢復(fù)乳腺癌對(duì)化療的敏感性。MAPK1，也稱為ERK2，是Ras/Raf/ERK通路的主要成員，該通路在腫瘤細(xì)胞中過度激活，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化，在某些腫瘤中，該通路的表達(dá)會(huì)通過調(diào)節(jié)藥物泵和抗凋亡分子參與腫瘤化療抵抗[39]。如Raf異常表達(dá)會(huì)使乳腺癌細(xì)胞中MDR-1藥物泵和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平升高，參與乳腺癌耐藥[40]。孕激素受體（PGR）在臨床上被用作ER轉(zhuǎn)錄活性的生物標(biāo)志物，是內(nèi)分泌反應(yīng)的有效調(diào)節(jié)劑。有研究顯示，當(dāng)PGR在N末端氨基酸殘基Ser294上磷酸化時(shí)，會(huì)增強(qiáng)Her2信號(hào)通路、胚胎和CSCs生物學(xué)行為，增強(qiáng)乳腺癌內(nèi)分泌抵抗[41-42]。

核心靶點(diǎn)GO富集分析顯示，生物過程主要涉及細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、對(duì)荷爾蒙的反應(yīng)等。其中，對(duì)荷爾蒙的反應(yīng)可能是參與ET耐藥的主要生物過程，而細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)則在耐藥后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。KEGG通路富集分析顯示，益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥與多條信號(hào)通路有關(guān)，主要包括FoxO信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。FoxO轉(zhuǎn)錄因子是腫瘤抑制因子，其活性抑制在許多腫瘤的惡性行為中發(fā)揮中重要作用。有證據(jù)顯示，抑制FoxO通路將促進(jìn)激素非依耐性乳腺癌生長(zhǎng)的許多特征，包括ER功能的改變，并且FoxO信號(hào)通路與雌激素信號(hào)通路之間的串?dāng)_能降低ERα陽性乳腺癌細(xì)胞的惡性行為（侵襲性、遷移性和激素非依耐性生長(zhǎng)），增加內(nèi)分泌治療的敏感性[43]。P53蛋白由TP53基因編碼，是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，P53異常表達(dá)與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)。研究表明P53也可影響抗雌激素治療的反應(yīng)，如Fernandez-Cuesta等[44]發(fā)現(xiàn)P53突變的細(xì)胞比野生型P53細(xì)胞更能抵抗4-羥基他莫昔芬（OHT）的細(xì)胞毒作用，并且P53功能缺失會(huì)增加ER與EGFR/HER2通路之間的交叉反應(yīng)，從而促進(jìn)乳腺癌對(duì)OHT的抵抗作用。腫瘤耐藥性和轉(zhuǎn)移的發(fā)生是腫瘤細(xì)胞重新編程其代謝，以適應(yīng)灌注不良、短暫的營(yíng)養(yǎng)缺失及酸度增加的過程。有研究顯示，雌激素信號(hào)通路能和幾個(gè)關(guān)鍵代謝調(diào)節(jié)酶之間串?dāng)_，改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的代謝，使腫瘤細(xì)胞能夠重新連接其代謝，以適應(yīng)灌注不良、短暫營(yíng)養(yǎng)缺乏和酸度增加，從而導(dǎo)致耐藥和轉(zhuǎn)移[45]。PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、蛋白質(zhì)合成和葡萄糖代謝至關(guān)重要。研究認(rèn)為抑制PI3K-Akt信號(hào)通路可導(dǎo)致ER活性增加，促進(jìn)耐藥，此外，PI3K-Akt信號(hào)通路還可與雌激素信號(hào)通路相互串?dāng)_，導(dǎo)致乳腺癌ET耐藥的發(fā)生[46]。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥的主要活性成分及其靶點(diǎn)，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，獲得益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥關(guān)鍵靶點(diǎn)的主要基因功能和參與的信號(hào)通路。結(jié)果顯示益腎清肝方的主要活性成分β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、槲皮素、苦參堿、隱丹參酮及兒茶素等可能通過作用于ESR1、TP53、STAT3、MAPK1、PGR等多個(gè)靶點(diǎn)，從而影響FoxO、P53、雌激素、PI3K-Akt等多條信號(hào)通路發(fā)揮作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示益腎清肝方主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接活性良好，可為后續(xù)進(jìn)一步深入探索益腎清肝方逆轉(zhuǎn)乳腺癌ET耐藥的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究的不足在于藥物活性成分均來源于數(shù)據(jù)庫，且數(shù)據(jù)庫的更新存在延遲，存在藥物成分錄入不全的情況。此外，本研究?jī)H通過網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)，未考慮不同產(chǎn)地、劑量、炮制方法對(duì)藥物活性成分的影響，亦未考慮方中藥物在煎煮后成分變化的影響，因此研究結(jié)果尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。