基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別及多成分定量的蒲公英質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

孟 然，吳 哲，馮 薇，吳晨曦，王秀萍*，李趙嘉*

基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別及多成分定量的蒲公英質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

孟 然1, 2，吳 哲1, 2，馮 薇1, 2，吳晨曦3，王秀萍1, 2*，李趙嘉1, 2*

1. 河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 唐山 063299 2. 唐山市蒲公英工程技術(shù)研發(fā)中心，河北 唐山 063299 3. 華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210

建立蒲公英的HPLC指紋圖譜及多成分含量測(cè)定方法，優(yōu)化指紋圖譜測(cè)定條件，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法對(duì)不同產(chǎn)地蒲公英進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為蒲公英質(zhì)量控制提供參考。采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化蒲公英主要有效成分的制備工藝。采用Mars ODS-AQ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.2%磷酸水溶液（35∶65）為流動(dòng)相，等梯度洗脫；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)時(shí)間為12 min；對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地的30批蒲公英建立HPLC指紋圖譜，并對(duì)5個(gè)成分含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)、聚類分析及主成分分析對(duì)蒲公英質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。蒲公英主要有效成分的最佳制備工藝為料液比1∶55、甲醇體積分?jǐn)?shù)72%、超聲溫度80 ℃、超聲時(shí)間79 min，在此條件下OD值為0.93。建立了蒲公英HPLC指紋圖譜，30批蒲公英的相似度在0.647～0.980，標(biāo)定6個(gè)共有峰，指認(rèn)出5個(gè)色譜峰。單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、菊苣酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.426%～1.856%、0.007%～0.117%、0.023%～0.101%、0.003%～0.025%、0.311%～1.412%。聚類分析將10個(gè)產(chǎn)地的蒲公英分為4類，主成分分析結(jié)果表明哈爾濱和沈陽(yáng)產(chǎn)地的質(zhì)量較優(yōu)，并確定單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸可作為蒲公英質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。確定了蒲公英主要有效成分最佳制備工藝，提取率遠(yuǎn)高于藥典方法。建立的蒲公英指紋圖譜結(jié)合多成分含量測(cè)定及化學(xué)模式識(shí)別法準(zhǔn)確、高效、全面地評(píng)價(jià)蒲公英質(zhì)量，為蒲公英的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

蒲公英；指紋圖譜；單咖啡酰酒石酸；綠原酸；咖啡酸；阿魏酸；菊苣酸；化學(xué)模式識(shí)別；質(zhì)量評(píng)價(jià)

蒲公英是菊科植物蒲公英Hand. -Mazz.、堿地蒲公英Kitam.或同屬數(shù)種植物的干燥全草，主要分布于我國(guó)河北、陜西、遼寧和黑龍江等地，臨床上具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋的作用，常用于治療疔瘡腫毒、乳癰、咽痛、腸癰、濕熱黃疸、熱淋澀痛等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英具有抗氧化、抗炎、抗癌和降血糖等作用[2-3]，其中酚酸類化合物是蒲公英的主要有效成分，是發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前從蒲公英中分離得到的酚酸類化合物有32種（表1）[4-7]，《中國(guó)藥典》2020年版以菊苣酸的含量作為蒲公英質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，僅靠單個(gè)主效成分不足以全面、綜合地反映蒲公英整體質(zhì)量。此外，由于蒲公英同屬植物多種類、多產(chǎn)地、多成分及相互作用復(fù)雜等因素影響，造成不同產(chǎn)地蒲公英質(zhì)量的差異性。已有文獻(xiàn)報(bào)道蒲公英飲片、栓劑、配方湯劑等質(zhì)量研究[8-10]，但仍存在研究不系統(tǒng)、分析方法單一的問(wèn)題，未能較直觀地反映出不同批次蒲公英的差異標(biāo)志物。因此，蒲公英質(zhì)量綜合性評(píng)價(jià)顯得尤為重要。

中藥指紋圖譜與化學(xué)模式識(shí)別相結(jié)合，能真實(shí)、形象地反映中藥質(zhì)量差異，揭示復(fù)雜化合物之間的規(guī)律，已成為目前最常用最有效的控制天然藥材質(zhì)量的手段[11-12]。本研究建立了蒲公英高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，同時(shí)高效測(cè)定單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸5個(gè)成分含量，利用響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英主效成分的最佳制備方法，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、相關(guān)性分析、聚類分析、主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別法對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地30批蒲公英進(jìn)行質(zhì)量分析研究，明確造成產(chǎn)地差異的標(biāo)記性成分，旨在為蒲公英質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

表1 蒲公英酚酸類化合物

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；DHY-300型超微粉碎機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司）；AP124W型電子天平（日本島津公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦儀器科技有限公司）；JT-1027HTD型機(jī)械超聲波清洗機(jī)（深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

單咖啡酰酒石酸（批號(hào)SC5580，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、綠原酸（批號(hào)SC8210，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；咖啡酸（批號(hào)YZ-110885，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.7%）、阿魏酸（批號(hào)YZ-110773，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.4%）、菊苣酸（批號(hào)YZ-111752，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；磷酸、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher Chemical公司）；無(wú)水甲醇（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。本實(shí)驗(yàn)收集了10個(gè)產(chǎn)地30批蒲公英，經(jīng)河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所王秀萍研究員鑒定均為菊科植物蒲公英Hand. -Mazz，樣品信息見表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Mars ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-流動(dòng)相0.2%磷酸水溶液（B）（35∶65），等梯度洗脫，體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，檢測(cè)時(shí)間12 min。

表2 蒲公英藥材信息

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取蒲公英樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）0.50 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm的針式過(guò)濾器濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、菊苣酸對(duì)照品適量，分別置10 mL量瓶中，加80%甲醇溶液，超聲溶解，定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.975、0.260、0.156、0.126、1.125 mg/mL的對(duì)照品貯備液。然后分別精密量取各對(duì)照品貯備液2.00 mL，置同一10 mL量瓶中，加80%甲醇定容，搖勻，制得單咖啡酰酒石酸為0.195 mg/mL、綠原酸為0.052 mg/mL、咖啡酸為0.031 mg/mL、阿魏酸為0.025 mg/mL、菊苣酸為0.225 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置10 mL量瓶中，加80%甲醇溶液至刻度，搖勻，作為系列對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，以各組分峰面積為縱坐標(biāo)（），以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表3。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下方法制備的蒲公英供試品（S7）20 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以單咖啡酰酒石酸（1號(hào)峰）為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果表明各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于1.54%，表明儀器精密度良好。

表3 蒲公英中主效成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批蒲公英供試品（S7）6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，以單咖啡酰酒石酸（1號(hào)峰）為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果表明各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于2.06%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批蒲公英供試品（S7），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在 0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以單咖啡酰酒石酸（1號(hào)峰）為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果表明各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于2.17%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 蒲公英指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.4.1 蒲公英指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 將30批蒲公英樣品按“2.2.1”項(xiàng)下優(yōu)化的提取工藝條件制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄色譜圖。將所得的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版本）”軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，設(shè)定S10樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)法結(jié)合多點(diǎn)校正，進(jìn)行色譜峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜。選擇蒲公英中的主要成分且分離較好的色譜峰作為共有峰，共標(biāo)定了6個(gè)共有峰。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出其中5個(gè)色譜峰，分別為單咖啡酰酒石酸（峰1）、綠原酸（峰2）、咖啡酸（峰3）、阿魏酸（峰4）和菊苣酸（峰5）。30批蒲公英HPLC指紋圖譜見圖1，蒲公英對(duì)照指紋圖譜見圖2。

2.4.2 蒲公英指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 將30批蒲公英指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，相似度結(jié)果如表4所示，30批蒲公英指紋圖譜的相似度在0.647～0.980，相似度在0.9以上的蒲公英占70.00%；30批蒲公英各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.02%，相對(duì)峰面積的RSD為7.69%～67.75%，相差較大，表明各批次間這6個(gè)共有峰所代表化合物的含量存在較大差異，不同產(chǎn)地間蒲公英質(zhì)量參差不齊。

2.5 蒲公英提取工藝優(yōu)化

由蒲公英的指紋圖譜可知檢測(cè)的蒲公英色譜峰的峰面積較小，所采用的制備方法提取率不高。因此，本研究對(duì)指紋圖譜中指認(rèn)的單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、菊苣酸5個(gè)主要有效成分的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步對(duì)30批不同產(chǎn)地蒲公英進(jìn)行含量測(cè)定。

圖1 30批蒲公英的HPLC指紋圖譜

1-單咖啡酰酒石酸 2-綠原酸 3-咖啡酸 4-阿魏酸 5-菊苣酸

表4 30批蒲公英相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 采用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)蒲公英提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化。為將5個(gè)指標(biāo)成分的效應(yīng)值綜合成一個(gè)可以反映總體效應(yīng)結(jié)果的數(shù)值，數(shù)據(jù)處理采用“總評(píng)歸一化法”[13]，對(duì)于綜合數(shù)值越大越好的因素，總評(píng)歸一值（overall desirability，OD）計(jì)算公式如下：

d=(Y?min)/(max?min)

OD＝(1×2……×)1/n

為考察指標(biāo)總數(shù)，d為各指標(biāo)值。

以料液比（A）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）作為自變量，以單咖啡酰酒石酸（1）、綠原酸（2）、咖啡酸（3）、阿魏酸（4）和菊苣酸（5）含量的OD值為因變量，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，因素水平設(shè)定見表5。

蒲公英主效成分含量＝(×10?6××)/×100。

為提取液各成分的質(zhì)量濃度；為粗提液體積；為稀釋倍數(shù)；為原料質(zhì)量。

表5 因素水平設(shè)定

根據(jù)因素水平設(shè)定表，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸的含量。Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 應(yīng)用Design-Expert進(jìn)行回歸擬合分析，可得到OD值對(duì)料液比（A）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）二次多項(xiàng)回歸方程：OD值＝0.99＋0.25 A＋0.11 B＋0.18 C?0.051 D＋0.19 AB＋0.18 AC＋0.028 AD＋0.13 BC?0.095 BD＋0.084 CD?0.35 A2?0.30 B2?0.17 C2?0.33 D2；方差分析結(jié)果見表7，模擬項(xiàng)＜0.01，極顯著，表明本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性；失擬項(xiàng)＝0.091 7，不顯著，說(shuō)明建立模型不存在失擬因素，擬合程度好[14]；R＝0.854 1，2adj＝0.806 6，表明此模型擬合度較好。因此，該模型能夠預(yù)測(cè)各因素對(duì)蒲公英提取含量的影響。因素A、A2、B2、D2達(dá)到極顯著水平（＜0.01），說(shuō)明對(duì)蒲公英主效成分含量有極顯著的影響。由值可知，4個(gè)因素對(duì)蒲公英主效成分提取含量的影響依次是A＞C＞B＞D。

響應(yīng)面曲線梯度反映各因素對(duì)主效成分提取含量的影響大小，響應(yīng)曲面越陡說(shuō)明該因素的影響越顯著[15]。根據(jù)圖3曲線上各因素的坡度變化及等高線疏密可知，料液比對(duì)主效成分提取含量的影響最大，且因素之間存在一定的交互作用，其中A、B2因素間交互作用顯著（＜0.05）。各因素對(duì)提取含量的影響由大到小的順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，這與方差分析結(jié)果一致。

表7 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

*表示差異顯著（＜0.05），**表示差異極顯著（＜0.01）

*indicates significant difference (< 0.05),**indicates extremely significant difference (< 0.01)

圖3 各因素交互作用對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖

2.5.3 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，得到超聲波輔助提取蒲公英主效成分的最佳制備工藝為：料液比1∶55.27、甲醇體積分?jǐn)?shù)71.63%、超聲溫度80.00 ℃、超聲時(shí)間79.49 min，此時(shí)OD值最大為0.93。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，將各因素進(jìn)行調(diào)整為：料液比1∶55、甲醇體積分?jǐn)?shù)72%、超聲溫度80 ℃、超聲時(shí)間79 min。為了檢驗(yàn)方法預(yù)測(cè)的結(jié)果，用試驗(yàn)中得到的最佳制備工藝條件重復(fù)試驗(yàn)，平行3份。結(jié)果表明，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，平均OD值為（0.928±0.005），與理論預(yù)測(cè)值誤差值小于0.689%，且經(jīng)檢驗(yàn)的結(jié)果差異不顯著（＞0.05），表明建立的工藝模型具有較好的預(yù)測(cè)性，可運(yùn)用此方法制備蒲公英主效成分。

2.5.4 蒲公英主效成分含量測(cè)定 取30批蒲公英樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下優(yōu)化的工藝條件制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種主效成分的含量，結(jié)果見表8，30批蒲公英中5個(gè)主效成分含量有所差異，單咖啡酰酒石酸含量為0.426%～1.856%，綠原酸含量為0.007%～0.117%，咖啡酸含量為0.023%～0.101%，阿魏酸0.003%～0.025%。S11單咖啡酰酒石酸、菊苣酸含量最高，S27中綠原酸、咖啡酸含量最高，S30中阿魏酸含量最高。

在上述5種蒲公英主效成分中，《中國(guó)藥典》2020年版只對(duì)菊苣酸進(jìn)行了限定，要求含量不得低于0.45%[1]，本研究也以此作為菊苣酸的限量標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)定結(jié)果顯示，30批蒲公英中菊苣酸的含量為0.311%～1.412%，各產(chǎn)地蒲公英的菊苣酸含量差異明顯，絕大部分產(chǎn)地的蒲公英菊苣酸含量達(dá)標(biāo)，其中黑龍江哈爾濱、河北唐山產(chǎn)地的蒲公英菊苣酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出藥典規(guī)定。

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 相關(guān)性分析 蒲公英成分指標(biāo)間存在相互依存和制約的關(guān)系，多樣本2指標(biāo)之間系數(shù)絕對(duì)值越大，則這兩指標(biāo)之間的聯(lián)系越緊密[16]。利用SPSS 26.0軟件雙變量Pearson相關(guān)分析法對(duì)5個(gè)主效成分之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，由表9可知，除酒石酸與綠原酸之間相關(guān)性不顯著（＞0.05）、酒石酸與阿魏酸呈顯著正相關(guān)（＜0.05）之外，其他成分指標(biāo)之間均呈現(xiàn)兩兩極顯著正相關(guān)。酒石酸與咖啡酸、菊苣酸均呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），與阿魏酸呈顯著正相關(guān)（＜0.05），其中酒石酸與菊苣酸之間相關(guān)性較高，相關(guān)系數(shù)為0.687；綠原酸與咖啡酸、阿魏酸、菊苣酸均呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），其中綠原酸與咖啡酸之間相關(guān)系數(shù)達(dá)0.699，說(shuō)明兩者間關(guān)系緊密；咖啡酸與阿魏酸、菊苣酸呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）；阿魏酸與菊苣酸呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）；結(jié)果表明酒石酸與綠原酸之間相互影響不顯著，其他主效成分含量之間相互顯著影響，進(jìn)而影響蒲公英的質(zhì)量。

表8 30批蒲公英5種主效成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

表9 30批蒲公英5種主效成分的相關(guān)性分析

*表示水平上（雙側(cè)）顯著相關(guān)（＜0.05），**表示水平上（雙側(cè)）極顯著相關(guān)（＜0.01）

*indicates a significant correlation (< 0.05) on the level (two-sided), **indicates a extremely significant correlation (< 0.01) on the level (two-sided)

2.6.2 聚類分析 利用SPSS 26.0軟件，以30批蒲公英中的酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量為變量，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以平方歐式距離為樣品間距離進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹系圖（圖4），將樣本劃分為不同類群進(jìn)行評(píng)價(jià)。由圖可知，各批次蒲公英樣本主要分為2大類、4小類：S10～S15聚為一大類（II），其他樣本聚為一大類（I）。在平方歐式距離8處，S1～S9、S16～S21、S25～S30聚為一小類（Ia），S22～S24聚為一小類（Ib）；S10、S11聚為一小類（IIa），S12～S15聚為一小類（IIb）。從總體數(shù)據(jù)來(lái)看，不同產(chǎn)地蒲公英質(zhì)量具有一定差異，其中第II類與其他樣本差異較大，距離為25時(shí)就可以歸為不同的類型，這說(shuō)明黑龍江哈爾濱和遼寧沈陽(yáng)產(chǎn)區(qū)的蒲公英與其他產(chǎn)地蒲公英具有明顯的差異；在距離為1時(shí)所有樣本完全分離，說(shuō)明雖然30批蒲公英樣本來(lái)自于不同產(chǎn)地，但仍具有較強(qiáng)相似性。

圖4 30批蒲公英聚類分析樹狀圖

2.6.3 主成分分析 為了進(jìn)一步比較不同產(chǎn)地蒲公英樣品的質(zhì)量差異，以30批蒲公英中的酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量為變量，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行主成分分析，得出主成分的特征值、貢獻(xiàn)率、主成分載荷矩陣及特征向量矩陣等。選取其中特征值大于1的前2個(gè)因子作為主成分1與主成分2，貢獻(xiàn)率分別為59.558%和21.596%，累積貢獻(xiàn)率為81.155%（表10），故2個(gè)主成分可以基本反映本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的所有成分指標(biāo)的信息。載荷值反映了各品質(zhì)指標(biāo)對(duì)主成分矩陣中的權(quán)重，數(shù)值絕對(duì)值的大小反映了原始變量對(duì)于因子影響的強(qiáng)度，正負(fù)反映了方向[17]。表11顯示了主成分分析載荷值的分布，酒石酸、綠原酸、阿魏酸和咖啡酸在第1主成分上載荷較大，表明與PC1相關(guān)系數(shù)較高，且均成正相關(guān)，第1主成分主要反映了這些元素的信息；菊苣酸在第2主成分上載荷較大，即與PC2相關(guān)系數(shù)較高，表明第2主成分主要反映了菊苣酸的信息。

表10 特征值和累積方差貢獻(xiàn)率

表11 主成分載荷矩陣

根據(jù)公式＝×計(jì)算各主成分值，其中原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化得標(biāo)準(zhǔn)化矩陣，為標(biāo)準(zhǔn)化的正交特征向量矩陣。根據(jù)各主成分的貢獻(xiàn)率，計(jì)算出綜合得分，其公式為綜=0.595 6×F＋0.216 0×F。各主成分值及綜合排序結(jié)果見表12，根據(jù)得分情況反映各產(chǎn)地蒲公英的質(zhì)量情況，總得分越高表明該地區(qū)蒲公英的綜合質(zhì)量越好，本研究中S10～S15綜合得分較高，說(shuō)明來(lái)自哈爾濱和沈陽(yáng)的蒲公英質(zhì)量相對(duì)較優(yōu)。分別以PC1與PC2建立坐標(biāo)系，得到主成分分析散點(diǎn)平圖（圖5），由圖可知，PC1和PC2可將樣品分為4類，第1類為S10、S11，第2類為S12～S15，第3類為S22～S24，其他歸為第4類。主成分分析與聚類分析結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了PC1和PC2可代表蒲公英的質(zhì)量用于分類。

表12 主成分綜合得分和排序

圖5 主成分分析散點(diǎn)圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用《中國(guó)藥典》2020年版[1]的提取方法，檢測(cè)得到蒲公英中單咖啡酰酒石酸含量為0.59%，綠原酸含量為0.12%，咖啡酸含量為0.15%，阿魏酸含量為0.08%，菊苣酸為0.363%，計(jì)算得OD值為0.09，表明藥典提供的方法檢測(cè)結(jié)果可能偏低。因此，本研究以液料比、甲醇濃度、超聲時(shí)間及溫度為因子，采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)指紋圖譜測(cè)定條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳制備方法為料液比1∶55、甲醇濃度72%、超聲溫度80.00 ℃、超聲時(shí)間79 min，此時(shí)OD值最大為0.93，大大提高了蒲公英主效成分的提取率。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[8,19-20]可知，采用高效液相色譜法檢測(cè)蒲公英菊苣酸等成分的檢測(cè)時(shí)間通常在26～35 min。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)色譜條件進(jìn)行了系統(tǒng)考察，包括不同流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液）、流動(dòng)相比例（50∶50、45∶55、35∶65）、不同體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）的考察，最終確定了蒲公英分析的最佳色譜條件。在此色譜條件下可將蒲公英中單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、菊苣酸5種主效成分在12 min內(nèi)檢出，從而大大降低了檢測(cè)時(shí)間成本。

產(chǎn)地是影響藥材質(zhì)量的主要原因之一，地形地貌、土壤、氣候等因素都可能造成不同產(chǎn)地間的成分差異，同一產(chǎn)地的藥材質(zhì)量也會(huì)受采收時(shí)間、種植方式等因素影響[18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立蒲公英HPLC指紋圖譜，對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地30批蒲公英指紋圖譜相似度分析，結(jié)果顯示21批蒲公英樣品相似度高于0.9，化學(xué)成分組成較為相似。有5批樣品相似度低于0.8，可能與生長(zhǎng)年限、地理環(huán)境條件及貯藏等因素有關(guān)，需進(jìn)一步分析。后續(xù)通過(guò)方法學(xué)考察確定多成分含量測(cè)定方法可行，進(jìn)一步對(duì)單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、菊苣酸5種有效成分的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量相對(duì)較高，不同產(chǎn)地間含量存在較大差異。

聚類分析中，在平方歐式距離25處，將黑龍江和遼寧的蒲公英聚為一類，而河北7個(gè)地區(qū)和山東的蒲公英聚為一類。當(dāng)距離刻度為8時(shí)，又將河北7個(gè)地區(qū)與山東的蒲公英區(qū)分開，說(shuō)明河北7個(gè)地區(qū)與山東的蒲公英藥材質(zhì)量具有相似性，有可能是因?yàn)楹颖迸c山東產(chǎn)地相鄰、生態(tài)環(huán)境相似而聚為一類，但也可能因?yàn)榈靥幯睾Ｅc內(nèi)陸的區(qū)別具有一定差異性；而不能將黑龍江和遼寧2產(chǎn)地的藥材清晰地分離出來(lái)，說(shuō)明東北2地的蒲公英藥材質(zhì)量較為接近，可能原因是兩個(gè)產(chǎn)區(qū)同屬于東北地區(qū)，藥材的化學(xué)成分很相似，因此造成這2類數(shù)據(jù)差異性小。

主成分分析結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)酒石酸、綠原酸、阿魏酸和咖啡酸最能代表第1主成分，但阿魏酸峰面積較??；菊苣酸最能代表第2主成分。同時(shí)，文獻(xiàn)表明，單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸為蒲公英主要活性成分—酚酸類物質(zhì)中重要成分[21]，選擇酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸作為藥材含量測(cè)定指標(biāo)可以更加全面反映蒲公英內(nèi)在品質(zhì)。主成分分析將30批蒲公英樣本分為4類，結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。根據(jù)綜合得分可知，來(lái)自哈爾濱和沈陽(yáng)產(chǎn)地的蒲公英質(zhì)量相對(duì)較優(yōu)。

綜上所述，相似度分析、聚類分析、主成分分析是中藥指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別手段應(yīng)用最普遍的分析方法，清晰地表明了不同產(chǎn)地蒲公英藥材的差異。本研究建立指紋圖譜與成分測(cè)定、化學(xué)模式識(shí)別法相結(jié)合，能較為科學(xué)、全面地反映藥材質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)建立的方法操作簡(jiǎn)便、高效穩(wěn)定，對(duì)蒲公英質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升具有重要意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of dandelion based on HPLC fingerprint combined with chemical pattern recognition and multi-component determination

MENG Ran1, 2, WU Zhe1, 2, FENG Wei1, 2, WU Chen-xi3, WANG Xiu-ping1, 2, LI Zhao-jia1, 2

1. Institute of Coastal Agricultural, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Tangshan 063299, China 2. Tangshan Dandelion Engineering Technology Research Center, Tangshan 063299, China 3. School of Traditional Chinese Medicine, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China

To establish the HPLC fingerprint and the determination method of multi-component content of dandelion, optimize the conditions of fingerprint determination, and combine the method of chemical pattern recognition to evaluate the quality of dandelion from different origins, so as to provide reference for the quality control of dandelion.The preparation process of main ingredients in dandelion were optimized by Box-Behnken response surface methodology. Mars ODS-AQ column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used; methanol-0.2% phosphoric acid aqueous solution (35∶65) was used as the mobile phase for gradient elution; the flow rate was 1 mL/min, the detection wavelength was 323 nm; the injection volume was 10 μL; the column temperature was 30 ℃; the detection time was 12 min. HPLC fingerprints were established for 30 batches of dandelion from 10 different origins, and the contents of five components were determined. The quality of dandelion was evaluated by similarity evaluation, cluster analysis and principal component analysis.The optimal preparation process of dandelion was as follows: solid-liquid ratio was 1∶55, methanol concentration was 72%, ultrasonic temperature was 80 ℃, ultrasonic time was 79 min, and the OD value under these conditions was 0.93. The HPLC fingerprint of dandelion was established, the similarity of 30 batches of dandelion was 0.699—0.980, six common peaks were calibrated, and five chromatographic peaks were identified. The mass fractions of caftaric acid, chlorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid and cichoric acid were 0.426%—1.856%, 0.007%—0.117%, 0.023%—0.101%, 0.003%—0.025% and 0.311%—1.412%, respectively. The dandelion from 10 origins were divided into four categories by cluster analysis. The results of principal component analysis showed that the quality of Harbin and Shenyang origins were better, and it was determined that caftaric acid, chlorogenic acid, caffeic acid and cichoric acid could be used as the main indicators for the quality evaluation of dandelion.The optimal preparation process for main ingredients of dandelion was determined, and the extraction rate was much higher than that of the pharmacopoeia method. The established dandelion fingerprint, combined with the determination of multi-component content and method of chemical pattern recognition, can evaluate the quality of dandelion accurately, efficiently and comprehensively, and provide a basis for the quality control of dandelion.

dandelion; fingerprint; caftaric acid; chlorogenic acid; caffeic acid; ferulic acid; cichoric acid; chemical pattern recognition; quality evaluation

R286.2

A

0253 - 2670(2022)24 - 7887 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.026

2022-06-09

河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（21326312D-8）；河北省農(nóng)林科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程課題資助（2022KJCXZX-BHS-4）；河北省農(nóng)林科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目資助（2021010101）

孟 然（1993—），女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹胁菟幑δ艹煞痔崛∨c分析。E-mail: yoki_meng@163.com

王秀萍，女，研究員，從事中藥材鑒定研究。E-mail: bhswxp@163.com

李趙嘉，男，助理研究員，從事中草藥高效利用研究。E-mail: tofriendzhaojia@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]