應(yīng)用種子形態(tài)及DNA條形碼技術(shù)鑒定黃芪及混偽品種子

李 軍，張召雷，王曉敏，劉立軒，冷曉紅

應(yīng)用種子形態(tài)及DNA條形碼技術(shù)鑒定黃芪及混偽品種子

李 軍1*，張召雷2，王曉敏3，劉立軒1，冷曉紅1

1. 寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院 寧夏中藥材開(kāi)發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021 2. 承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000 3. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021

采用傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法結(jié)合DNA條形碼分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)黃芪及混偽品種子進(jìn)行鑒定。收集黃芪及混偽品種子、市售黃芪種子樣品共58份，利用體視顯微鏡和游標(biāo)卡尺進(jìn)行種子外觀形態(tài)特征的觀察和記錄，測(cè)定千粒重；提取單粒種子的基因組DNA，PCR擴(kuò)增、雙向測(cè)序獲得ITS2及psbA-trnH序列。使用鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，kimura二參數(shù)（kimura two-parameter，K2P）模型計(jì)算遺傳距離，進(jìn)行物種鑒定分析。黃芪及混偽品種子在顏色、形狀、長(zhǎng)、寬、厚度及千粒重等方面存在細(xì)微差別；ITS2的測(cè)序成功率為100%，黃芪種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)最大遺傳距離；ITS2序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將蒙古黃芪var.聚為獨(dú)立一支，并將蒙古黃芪、紫花苜蓿、錦雞兒、蜀葵及黃芪屬其他物種分開(kāi)，可進(jìn)行黃芪及其混偽品種子的鑒定。基于外觀形態(tài)和ITS2條形碼序列鑒定發(fā)現(xiàn)12份市售黃芪種子中有1份為斜莖黃芪?；诜N子形態(tài)鑒定和ITS2條形碼相結(jié)合的方法可以準(zhǔn)確鑒定黃芪及混偽品種子，為規(guī)范黃芪種源及種植生產(chǎn)，進(jìn)而保障黃芪藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

黃芪；種子；蒙古黃芪；扁莖黃芪；斜莖黃芪；紫云英；外觀形態(tài)；ITS2；DNA條形碼；系統(tǒng)發(fā)育分析

黃芪原名黃耆，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，宋代《圖經(jīng)本草》載：“今出原州（寧夏固原）及華原（陜西耀縣）者也佳?！盵2]?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge.的干燥根作為黃芪入藥[3]。黃芪的主要有效成分皂苷、黃酮等，有抗炎、降壓、抗心肌缺血損傷、抗衰老、抗慢性腎病、調(diào)節(jié)免疫、保肝和清除自由基等作用[4]。由于黃芪具有優(yōu)良的補(bǔ)氣固表、斂瘡生肌等功效，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)黃芪的需求極大，進(jìn)而導(dǎo)致野生黃芪資源逐漸匱乏，目前市場(chǎng)上商品黃芪大多為栽培品種[5-6]，主要分布在山西、寧夏、內(nèi)蒙古、陜西省毗鄰的干旱少雨沙生草原區(qū)[7]，種植規(guī)模不斷擴(kuò)大。但存在種源混亂、種質(zhì)混雜等現(xiàn)象，黃芪種子作為中藥材種植的源頭，質(zhì)量參差不齊，鑒定錯(cuò)誤的種子不僅會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也會(huì)給臨床用藥帶來(lái)極大的安全隱患。

黃芪及混偽品種子如斜莖黃芪、扁莖黃芪和紫云英外觀形態(tài)相似，傳統(tǒng)方法易受鑒定人員經(jīng)驗(yàn)、種子成熟度和外部環(huán)境的影響，難以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[8-9]。因此需要一種更加客觀、準(zhǔn)確的鑒定方法對(duì)傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行補(bǔ)充。DNA條形碼技術(shù)具有通用性、客觀性、準(zhǔn)確性等特點(diǎn)[10-11]，已是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的輔助手段和有效補(bǔ)充，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物物種的準(zhǔn)確、快速鑒別[12-13]。目前，DNA條形碼鑒定技術(shù)已經(jīng)在黃芩、木通、鉤藤和北蒼術(shù)等種子鑒定中取得了良好的效果[14-18]，成為近年來(lái)種子鑒定研究的重點(diǎn)和亮點(diǎn)。當(dāng)前，黃芪種植及需求量越來(lái)越多，種源鑒定困難，關(guān)于黃芪種子的分子鑒定較少且未進(jìn)行系統(tǒng)研究[19]。因此，本研究擬利用外觀形態(tài)和DNA條形碼技術(shù)系統(tǒng)地對(duì)黃芪及其混偽品種子進(jìn)行鑒定研究，以期建立一種客觀、準(zhǔn)確、高效的黃芪種子鑒定方法，以保障其種子的物種準(zhǔn)確，為市場(chǎng)流通黃芪種子的規(guī)范化管理提供技術(shù)支持，為從源頭解決黃芪藥材質(zhì)量問(wèn)題提供科學(xué)依據(jù)，并為中藥黃芪的臨床用藥安全提供保障。

1 材料與儀器

1.1 材料

本研究共收集黃芪及其混偽品種子樣本58份，分別來(lái)自寧夏、山西、內(nèi)蒙古、甘肅和江蘇等多個(gè)省份，其中來(lái)源于黃芪及其混偽品原植物的種子樣品46份，原植物標(biāo)本經(jīng)寧夏農(nóng)業(yè)科學(xué)院李明研究員及寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院郭鴻雁教授鑒定分別為蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao、扁莖黃芪R. ex Bge.、斜莖黃芪Jacquin及紫云英L.，市售待檢樣品12份。所有樣品均保存于寧夏中藥材開(kāi)發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心。樣品采集信息見(jiàn)表1。

同時(shí)本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載條形碼序列[19]，共整理黃芪與錦雞兒、蜀葵、紫云英、白花草木樨等混偽品的37條有效條形碼序列（表2）。

1.2 試劑

DL2000 Marker、RNase酶、植物基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；psbA-trnH、ITS2序列引物由上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest Agarose公司；2×Taq plus Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；GelRed染料購(gòu)自美國(guó)Biotium公司。

1.3 儀器

M205FA型高級(jí)研究級(jí)體視顯微鏡（德國(guó)萊卡有限公司）；MyCycler PCR儀、Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)、Powerpac Basic型瓊脂糖凝膠電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)有限公司）；MiniSpin plus型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Geno 2010型高通量組織研磨機(jī)（美國(guó)SPEX SamplePrep公司）；Nanodrop ONE型超微量分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop公司）；YXQ-LS-50S型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊儀器有限公司）；Mini型離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；SZ-1型渦旋混合器（常州國(guó)宇儀器制造有限公司）；HHSY21-Ni4-C型恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

表1 蒙古黃芪及混偽品種子樣品信息

表2 GenBank的DNA條形碼序列登錄號(hào)

2 方法

2.1 種子外觀形態(tài)特征觀察

從每份種子樣品中隨機(jī)選取20粒進(jìn)行觀察，用體視顯微鏡觀察種子的形狀、顏色、表面紋理等外觀形態(tài)特征，并拍照記錄；用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量供試種子的長(zhǎng)度、寬度和厚度；從充分混勻的凈種子樣品中隨機(jī)選取做3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子稱定質(zhì)量，取平均值并估算其千粒重。

2.2 DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

取單粒種子樣品，用75%乙醇擦拭表面，自然揮干，放入2.0 mL離心管，加入鋼珠2枚，?80 ℃冰箱冷凍2 h，用高通量組織球磨儀研磨8 min（4000 r/min），采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，詳細(xì)操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)[20]。并使用Nanodrop ONE型超微量分光光度計(jì)檢測(cè)種子DNA的濃度和質(zhì)量。

2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

本研究選用國(guó)際通用序列ITS2及psbA-trnH2條DNA條形碼候選序列。2對(duì)引物序列及PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表3。PCR體系為25 μL，包含2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL[21]。取4 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠（含GelRed染料）電泳，在凝膠成像儀中觀察并拍照保存。并將PCR產(chǎn)物送至中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所進(jìn)行雙向測(cè)序。

表3 所用引物序列及相應(yīng)PCR反應(yīng)條件

2.4 序列分析及物種鑒定

利用序列拼接軟件CodonCode Aligner 10.0.2對(duì)測(cè)序峰圖文件進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)；ITS2去除2端5.8S和28S區(qū)，僅保存中間ITS2片段，psbA-trnH序列去除2端和的基因序列，僅保留基因間隔區(qū)[22]；使用MEGA 7.0對(duì)拼接后序列進(jìn)行比對(duì)分析，比較不同序列的比對(duì)后長(zhǎng)度、變異位點(diǎn)和遺傳距離，分析序列的堿基組成，對(duì)各個(gè)候選序列進(jìn)行種間種內(nèi)變異分析[23]，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行1000次自展，以kimura二參數(shù)模型（kimura two-parameter，K2P）模型計(jì)算遺傳距離，采用鄰接法（neighbor joining，NJ）建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，考察ITS2和psbA-trnH鑒定黃芪及其混偽品種子的能力，并對(duì)市售黃芪種子進(jìn)行鑒定。

2.5 市售黃芪種子物種鑒定

收集12份市售商品名標(biāo)注為黃芪的種子，樣本分別來(lái)自內(nèi)蒙古、甘肅、陜西、江蘇等產(chǎn)地。利用外觀形態(tài)和優(yōu)選的DNA條形碼序列進(jìn)行黃芪種子物種鑒別研究，考察其種子鑒定準(zhǔn)確性。

3 結(jié)果

3.1 種子外觀形態(tài)特征

通過(guò)體視顯微鏡的觀察和游標(biāo)卡尺的測(cè)量，黃芪及混偽品種子在外觀形態(tài)上有細(xì)微差異。從表4中的觀察結(jié)果來(lái)看，蒙古黃芪種子寬卵狀腎形，略扁，長(zhǎng)2.0～4.5 mm，寬1.9～3.5 mm，厚0.5～1.5 mm，表面光滑，為暗棕色或黃褐色，種臍位于腹中部凹陷處，千粒重約6.65 g。扁莖黃芪種子相對(duì)較小，褐綠色或青色，呈球狀腎形，略扁，表面光滑，種皮基本無(wú)斑，種臍位于腹中部凹陷處，千粒重約2.64 g。斜莖黃芪種子最小，呈腎形，褐綠色，表面光滑，種皮有黑褐色斑點(diǎn)和細(xì)密網(wǎng)狀紋，種臍位于腹中上部凹陷處，千粒重約1.63 g。紫云英種子較蒙古黃芪略小，呈長(zhǎng)腎形，棕色或者褐色，種皮無(wú)斑，腹中部凹陷較深，種臍位于凹陷處，千粒重約3.76 g。

上述種子的典型形態(tài)特征可以作為鑒別黃芪種子的依據(jù)，種子形態(tài)特征研究表明（圖1），黃芪及其混偽品扁莖黃芪、斜莖黃芪和紫云英的種子形態(tài)特征有一定細(xì)微差異，如顏色、形狀、斑點(diǎn)等，由于種子均比較細(xì)小，在無(wú)專業(yè)設(shè)備輔助下鑒定易出現(xiàn)偏差。

取不同采集地經(jīng)過(guò)鑒定的蒙古黃芪種子于體視顯微鏡下進(jìn)行觀察，圖2結(jié)果表明不同采集地黃芪種子，受氣候環(huán)境及成熟度的影響形態(tài)特征存在顯著差異，單從形態(tài)鑒定黃芪種子存在一定的局限性。

表4 蒙古黃芪及混偽品種子外觀形態(tài)特征

圖1 黃芪屬種子的形態(tài)特征

圖2 不同產(chǎn)地蒙古黃芪種子的形態(tài)特征

3.2 黃芪種子ITS2序列特征及物種鑒定能力考察

PCR擴(kuò)增的ITS2經(jīng)電泳凝膠成像檢測(cè)，其在500 bp呈現(xiàn)單一明亮、清晰的條帶，PCR擴(kuò)增率均為100%。經(jīng)測(cè)序，46個(gè)來(lái)源于原植物的種子樣品中ITS2序列均獲得高質(zhì)量雙向測(cè)序峰圖，ITS2測(cè)序成功率為100%。另從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載8個(gè)物種的19條ITS2序列，共計(jì)獲得65條黃芪及混偽品種子ITS2參考序列，比對(duì)后長(zhǎng)度226 bp，GC%含量50.5%，共有68個(gè)變異位點(diǎn)。蒙古黃芪種內(nèi)平均遺傳距離0.002，種內(nèi)最大遺傳距離0.005，與黃芪混偽品的種間最小遺傳距離0.080，故黃芪及其混偽品種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離?；邳S芪及其混偽品種子的ITS2序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明（圖3），混偽品中紫花苜蓿、蜀葵、錦雞兒、白花草木樨和黃芪屬其他物種分別單獨(dú)聚類，說(shuō)明其與黃芪屬物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，較易區(qū)分。蒙古黃芪可形成獨(dú)立的一大枝，可以與扁莖黃芪、斜莖黃芪和紫云英明顯區(qū)分，ITS2序列可作為黃芪及其混偽品種子鑒定的序列。

3.3 黃芪種子psbA-trnH序列特征及物種鑒定能力考察

psbA-trnH序列經(jīng)電泳檢測(cè)，其在600 bp左右呈現(xiàn)明亮、清晰的條帶。對(duì)收集的46個(gè)種子樣品PCR產(chǎn)物測(cè)序，psbA-trnH序列由于存在polyT結(jié)構(gòu)，影響其測(cè)序質(zhì)量，psbA-trnH序列測(cè)序成功率為93.5%。另從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載6個(gè)物種的18條psbA-trnH序列，共獲得61條黃芪及混偽品種子psbA-trnH序列。比對(duì)后長(zhǎng)度636 bp，GC%含量21.1%，共160個(gè)變異位點(diǎn)。蒙古黃芪種內(nèi)平均遺傳距離0.006，種內(nèi)最大遺傳距離0.038，與混偽品斜莖黃芪、扁莖黃芪、紫花苜蓿、錦雞兒、蜀葵和白香草木樨的種間最小遺傳距離分別為0.028、0.118、0.263、0.232、0.486和0.252。故蒙古黃芪與斜莖黃芪種間最小遺傳距離小于種內(nèi)最大遺傳距離，蒙古黃芪與其他混偽品種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)最大遺傳距離?；邳S芪及其混偽品種子的psbA-trnH序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，圖4結(jié)果表明混偽品中紫花苜蓿、蜀葵、錦雞兒、白花草木樨和黃芪屬其他物種分別單獨(dú)聚類，說(shuō)明其與黃芪屬物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，較易區(qū)分。黃芪屬物種聚為一大枝，但蒙古黃芪與扁莖黃芪、斜莖黃芪分成小枝，可以進(jìn)行區(qū)分。psbA-trnH序列可作為黃芪及其混偽品種子鑒定的補(bǔ)充序列。

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的蒙古黃芪及混偽品種子NJ樹(shù)

3.4 基于外觀形態(tài)及ITS2條形碼序列的市售黃芪種子物種鑒定

根據(jù)上述結(jié)果，收集12份市售商品名標(biāo)注為黃芪的種子來(lái)進(jìn)行真?zhèn)舞b別研究。樣本分別來(lái)自內(nèi)蒙古、甘肅、陜西、江蘇等產(chǎn)地。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)ZG1I種子外觀與蒙古黃芪樣品有一定差異。隨后以ITS2序列物種鑒定，每份樣品取單粒種子進(jìn)行DNA提取，結(jié)果如表5所示，DNA質(zhì)量濃度48.35～109.80 mg/L，吸光度（）比值260/280處于1.724～1.994。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果在500 bp有1條清晰明亮的條帶，雙向測(cè)序和注釋獲得ITS2序列，經(jīng)BLAST鑒定，12份市售黃芪種子中有1份為斜莖黃芪，符合外觀形態(tài)特征。

圖4 基于psbA-trnH序列構(gòu)建的蒙古黃芪及混偽品種子NJ樹(shù)

4 討論

4.1 黃芪及混偽品種子總DNA的提取及測(cè)序

關(guān)于樣品用量方面，按照DNA提取試劑盒要求的取樣量干燥組織20 mg，應(yīng)該取多粒種子作為樣品，但由于種子個(gè)體間易存在基因雜合現(xiàn)象，測(cè)序峰圖容易存在雜峰，進(jìn)而影響測(cè)序質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)選取黃芪及混偽品單粒種子1.5～8.0 mg進(jìn)行DNA提取試驗(yàn)，DNA質(zhì)量濃度48.35～109.80 μg/mL，且260/280為1.724～1.994。采用ITS2和psbA-trnH 通用引物均可以獲得明亮、清晰的條帶，表明黃芪和混偽品單粒種子提取的DNA完全可以滿足試驗(yàn)要求。故后續(xù)采用單粒種子樣品進(jìn)行總DNA的提取。另外，為了提高提取的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)采用?80 ℃冰箱冷凍降低溫度后[24]，用組織研磨儀快速研磨后，新型植物DNA提取試劑盒快速提取，提高總DNA的質(zhì)量。試驗(yàn)樣品的ITS2和psbA-trnH序列PCR擴(kuò)增成功率均為100%。ITS2的測(cè)序成功率為100%，而psbA-trnH序列由于存在polyA/T結(jié)構(gòu)，影響其測(cè)序質(zhì)量及拼接，測(cè)序成功率為93.5%。測(cè)序未成功的樣本均經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，仍不能成功測(cè)序。

表5 市售黃芪種子樣品信息及鑒定

4.2 黃芪及混偽品種子形態(tài)和DNA條形碼鑒定

中藥材種子鑒定主要通過(guò)借助顯微鏡的形態(tài)學(xué)觀察來(lái)完成，但其形態(tài)特征和顯微特征易受環(huán)境和種子成熟度等因素影響，相同物種的種子往往也存在形態(tài)差異，均會(huì)影響物種鑒定的準(zhǔn)確性[25]。作為傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法的補(bǔ)充，DNA條形碼技術(shù)依靠植物的遺傳信息進(jìn)行鑒定，不受環(huán)境和植物生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響[24]。

目前關(guān)于黃芪DNA條形碼鑒定的研究較多，其中鄭司浩等[26]利用特異性分子標(biāo)記鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪，高婷等[27]利用ITS2條形碼序列鑒定了黃芪屬藥用植物。劉亞令等[11]基于ITS2序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定了黃芪藥材及其混偽品。這些研究主要是針對(duì)黃芪藥材及其植物的分子鑒定研究。而種子作為繁殖材料在DNA條形碼鑒定實(shí)踐中有一定特殊性，內(nèi)含物豐富，多數(shù)個(gè)體較小，DNA提取困難，且含有PCR抑制物[28]。其中張改霞[19]采用形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS2條形碼技術(shù)對(duì)10批次黃芪種子樣品進(jìn)行鑒定。本研究從25個(gè)不同產(chǎn)地收集了黃芪及混偽品種子46份，通過(guò)外觀形態(tài)及ITS2和psbA-trnH條形碼序列分析，不僅在形態(tài)學(xué)方面揭示了黃芪種子及其混偽品的差異，而且在ITS2條形碼鑒定的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充了psbA-trnH條形碼鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITS2序列能將蒙古黃芪聚為一大枝，黃芪屬其他物種聚為小枝，可以明顯區(qū)分黃芪及其混偽品種子。研究結(jié)果表明，ITS2序列作為黃芪及其混偽品種子鑒定的優(yōu)選序列，psbA-trnH作為補(bǔ)充序列。系統(tǒng)完善地對(duì)黃芪及其混偽品種子鑒定進(jìn)行了研究。同時(shí)，本研究通過(guò)外觀形態(tài)和ITS2條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)12份市售黃芪種子中有1份為斜莖黃芪。說(shuō)明市售黃芪存在一定的種源混雜問(wèn)題，可通過(guò)DNA條形碼技術(shù)對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，避免由于種子混亂給臨床用藥帶來(lái)了的安全隱患。

4.3 DNA條形碼鑒定黃芪及混偽品種子的意義

黃芪作為大宗藥材，應(yīng)用廣泛，除《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定的蒙古黃芪和膜莢黃芪之外，其混偽品斜莖黃芪、扁莖黃芪、紫云英、紫花苜蓿、錦雞兒和蜀葵等[10]也時(shí)有出現(xiàn)，導(dǎo)致市場(chǎng)上種子種苗比較混亂。嚴(yán)重影響了黃芪藥材的質(zhì)量穩(wěn)定和臨床用藥安全，所以從藥材源頭著手，準(zhǔn)確鑒定黃芪種子基原，保證黃芪種子的質(zhì)量至關(guān)重要。DNA條形碼技術(shù)可鑒定單粒種子，解決混種、種子混雜問(wèn)題，彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒別方法的不足，在中藥鑒定領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[29-30]。

目前尚缺少完善的法律法規(guī)規(guī)范黃芪種子種苗的生產(chǎn)和銷售。2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種業(yè)管理司印發(fā)了《2019年推進(jìn)現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展工作要點(diǎn)》，指出《中藥材種子管理辦法》的起草任務(wù)迫在眉睫[31]。與黃芪藥材和飲片的鑒定方法相比，由于黃芪種子尚未建立系統(tǒng)的物種鑒定方法，采用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒定成本低、準(zhǔn)確率高、實(shí)踐性強(qiáng)[32]。因此，利用DNA條形碼技術(shù)，加快推進(jìn)黃芪種子標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，不僅能為我國(guó)黃芪種子種苗鑒定規(guī)范化建設(shè)提供有力技術(shù)保障，也是中藥現(xiàn)代化建設(shè)的重要建設(shè)內(nèi)容[14]。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 黃海波, 黃柏超. 《本草綱目·釋名》“黃耆”諸名解讀 [J]. 中醫(yī)藥文化, 2016, 11(4): 46-49.

[2] 詹志來(lái), 鄧愛(ài)平, 彭華勝, 等. 基于歷代本草產(chǎn)地變遷的藥材道地性探討: 以黃芪、丹參為例 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2016, 41(17): 3202-3208.

[3] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2020: 323.

[4] 孟祥善, 代曉華, 劉萍, 等. 基于ITS序列的銀柴胡種質(zhì)資源遺傳多樣性研究 [J]. 中藥材, 2018, 41(1): 55-59.

[5] 孫淑英, 陳貴林. 內(nèi)蒙古黃芪產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀、問(wèn)題及對(duì)策建議 [J]. 分子植物育種, 2018, 16(15): 5126-5133.

[6] Li D, Liu Y T, Qin X M. Rapid quantitative analysis of 12 chemical constituents in wild-simulated and cultivatedbased on UHPLC-MS [J]., 2022, 14(3): 464-469.

[7] 彭露茜, 郭彥龍. 中國(guó)黃芪地理分布和未來(lái)適生區(qū)預(yù)測(cè) [J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 35(1): 60-68.

[8] 閆沖, 劉紅菊, 趙麗麗. 黃芪及其混淆品種子的種皮組織結(jié)構(gòu)鑒別 [J]. 海峽藥學(xué), 2007, 19(4): 55-56.

[9] 閆沖, 聶鳳禔. 黃芪及其偽品的種子快速鑒別方法 [J]. 中國(guó)藥業(yè), 2005, 14(7): 69-70.

[10] Chen S L, Yao H, Han J P,. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species [J]., 2010, 5(1): e8613.

[11] 劉亞令, 耿雅萍, 王芳, 等. 基于ITS2序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)藥用黃芪及混偽品的鑒別研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 55(3): 522-529.

[12] 穆威杉, 謝紅波, 趙晴, 等. 基于ITS2序列的市售木通藥材及其混偽品的分子鑒定[J]. 中草藥, 2022, 53(7): 2108-2114.

[13] Zhang G X, Liu J X, Gao M,. Tracing the edible and medicinal plantand its products in the marketplace yields sub species level distinction using DNA barcoding and DNA metabarcoding [J]., 2020, 11: 336.

[14] 穆威杉, 于娟, 趙晴, 等. 基于DNA條形碼技術(shù)的中藥材木通種子鑒定研究 [J]. 世界中醫(yī)藥, 2020, 15(9): 1271-1274.

[15] 劉金欣, 魏妙潔, 李耿, 等. 黃芩ITS2條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建及其種子的DNA條形碼鑒定方法建立 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2018, 24(9): 37-45.

[16] 謝紅波, 趙晴, 穆威杉, 等. 北蒼術(shù)種子DNA條形碼研究及序列特征分析 [J]. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2022, 39(1): 13-18.

[17] 陳士林, 姚輝, 韓建萍, 等. 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(2): 141-148.

[18] 蔡一鳴, 代江鵬, 鄭雨欣, 等. 鉤藤屬植物分子鑒定的DNA條形碼篩選[J]. 中草藥, 2022, 53(6): 1828-1837.

[19] 張改霞. 幾種傳統(tǒng)大宗中藥材種子DNA條形碼鑒定 [D]. 濟(jì)南: 山東中醫(yī)藥大學(xué), 2016.

[20] 李軍, 張燃, 于淑萍, 等. 中藥材銀柴胡及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 54(5): 937-943.

[21] 陳士林. 中藥DNA條形碼分子鑒定 [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2012: 14.

[22] Keller A, Schleicher T, Schultz J,. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation [J]., 2009, 430(1/2): 50-57.

[23] Kumar S, Stecher G, Li M,. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms [J]., 2018, 35(6): 1547-1549.

[24] 戚文濤, 李劍超, 王晨, 等. 應(yīng)用ITS2條形碼及種子形態(tài)鑒定柴胡屬種子 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2020, 26(11): 170-177.

[25] 肖娟. 不同生境白簕種子形態(tài)、品質(zhì)特征和種子萌發(fā)特性的研究 [J]. 中藥材, 2014, 37(5): 731-736.

[26] 鄭司浩, 尚興樸, 曾燕, 等. 蒙古黃芪與膜莢黃芪特異性分子標(biāo)記鑒別研究 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2019, 21(3): 307-311.

[27] 高婷, 姚輝, 馬新業(yè), 等. 中國(guó)黃芪屬藥用植物DNA條形碼(ITS2) 鑒定 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2010, 12(2): 222-227.

[28] 趙晴, 謝紅波, 趙紅玲, 等. 中藥材種子DNA條形碼鑒定研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2019, 50(14): 3471-3476.

[29] 辛天怡, 雷美艷, 宋經(jīng)元. 中藥材DNA條形碼鑒定研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2015, 17(2): 170-176.

[30] Shi L C, Chen H M, Jiang M,. CPGAVAS2, an integrated plastome sequence annotator and analyzer [J]., 2019, 47(W1): W65-W73.

[31] 鄧明瑞. 中藥材種生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)管理探討: 種子管理機(jī)構(gòu)在貫徹實(shí)施新《種子法》中遇到的困難與挑戰(zhàn) [J]. 中國(guó)種業(yè), 2019(5): 34-37.

[32] 張尚智, 張建軍, 劉玲玲. 我國(guó)中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布狀況及分析 [J]. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2019, 38(1): 49-54.

Identification ofseeds and its adulterants by morphology and DNA barcoding technique

LI Jun1, ZHANG Zhao-lei2, WANG Xiao-min3, LIU Li-xuan1, LENG Xiao-hong1

1. Ningxia Research Center for Development and Utilization of Chinese Medicinal Materials, Ningxia Polytechnic, Yinchuan 750021, China 2. Hebei Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine, Chengde Medical University, Chengde 067000, China 3. School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China

Using the traditional morphological identification method in combination with DNA barcoding technique,seedsand the adulterantswere authenticated.A total of 58 samples including cultivated, marketedseeds and the adulterants were collected. Seeds morphological characters were determined using stereomicroscope and vernier caliper observations, along with calculation of their 1000-grain weights. Genomic DNA was extracted from the single seed. PCR and bidirectional sequencing yielded the ITS2 andsequences. Species identification were emoloyed, using kimura two-parameter model (K2P) genetic distance method and neighbor joining (NJ) phylogenetic analysis.Slight differences in color, shape, length, width, thinkness and 1000-grain weight amongseeds samples and the adulterants could be observed. The ITS2 sequencing success rate was100%. The minimum genetic distance between species ofwas greater than the maximum genetic distance within species. The NJ dendrogram of ITS2 sequences indicated that all thevar.seedscould form independent branches, which could be distinguished from,and other species ofin the collected samples, thus possessing the ability to authenticateseeds from the adulterants. Based on seed morphology and ITS2 barcoding identification strategy, onesample was identified from the 12 marketedseeds samples.Based on the combination of seed morphology and ITS2 sequence barcoding identification, theseeds and the adulterants can be accurately identified, which provides scientific bases for standardizing the source and cultivation of, ensuring the quality of Chinese medicinal materials.

Bunge; seed;(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao;R. Ex Bge.;Jacquin;L.; morphology; ITS2; DNA barcoding technique; phylogenetic analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2022)24 - 7871 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.024

2022-09-13

寧夏回族自治區(qū)教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目資助（NGY2020132）

李 軍（1982—），男，山西渾源人，碩士，副教授，主要從事中藥資源及開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail: lijunamy@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]