一起豬2型鏈球菌的分離鑒定及診療

黃中善 黃文炳 梁家綏

（1.南寧市賓陽縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530400；2. 廣西悅牧生物科技有限公司，廣西 南寧 530007）

鏈球菌（Streptococcus）是重要的人畜共患傳染病病原菌，可感染人以及豬、牛、羊等多種動(dòng)物，其主要傳播方式為經(jīng)口、呼吸道及破損的皮膚傷口感染，也可垂直傳播。［1］鏈球菌屬球菌科、鏈球菌屬、革蘭氏陽性兼性厭氧菌。豬鏈球菌（Streptococcus suis）對各種品種豬群、不同年齡及性別的豬均易感，可引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、多發(fā)性漿膜炎、肺炎和急性死亡等［2，3］，是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)最常見的細(xì)菌性疾病之一，危害著生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。更為重要的是，豬鏈球菌能夠通過傷口或豬產(chǎn)品感染人，引起人腦膜炎、敗血癥等重要的疾?。?］，對相關(guān)從業(yè)人員的身體健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

目前，根據(jù)鏈球菌莢膜多糖抗原的差異，可將其分為35個(gè)血清型，即1~34及1/2型。［5］對豬具有較強(qiáng)致病性的主要血清型有1型、2型、7型和9型，其中血清2型致病力最強(qiáng)［6］，危害最為突出。本試驗(yàn)采集廣西賓陽縣某規(guī)?；i場2021年6月發(fā)生的疑似豬鏈球菌的組織病料，通過細(xì)菌分離、生化鑒定、PCR診斷及藥敏試驗(yàn)，鑒定為血清2型豬鏈球菌，為2型豬鏈球菌的診斷與治療提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)病情況及病料采集

2021年5月18日廣西賓陽縣某規(guī)?；i場外購963頭體重15 kg左右的保育豬苗回來飼養(yǎng)，至5月31日起陸續(xù)出現(xiàn)豬只突然倒地、四肢劃水及急性死亡的病情，每天死亡2~3頭豬；用藥可以暫時(shí)控制病情，停藥后又出現(xiàn)反彈。6月11日解剖并采集了2頭病死豬的肺臟、脾臟、腎臟、腦組織及淋巴結(jié)等組織器官分別進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.1.2 主要試劑

普通營養(yǎng)肉湯，胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；DNA提取試劑盒以及PCR相關(guān)試劑、DNA Ladder Marker等均購自天根生化科技（北京）有限公司；微生物微量生化鑒定管和抗生素藥敏紙片均購自于杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染液試劑盒為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為分析純；相關(guān)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原分離純化

無菌操作采集的肺臟、脾臟、腎臟、腦和淋巴結(jié)等病料分別劃線接種于TSA平板（含5%的新生牛血清），置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察菌落生長形態(tài)特征，挑選形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及挑單菌落進(jìn)一步分離純化。

1.2.2 生化試驗(yàn)

按生化試驗(yàn)的說明書進(jìn)行操作，將分離純化的菌株分別接種于甘露醇、甘露糖、棉籽糖、山露醇、阿拉伯糖、山梨醇、水楊素、β半乳糖苷、馬尿酸鹽、松三糖、乳糖、核糖、七葉苷、精氨酸雙水解酶和精氨酸脫羥酶等細(xì)菌生化反應(yīng)管，依據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊對各生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定。［7］

1.2.3 血清型的PCR鑒定檢測

用分離純化的細(xì)菌提取的基因組DNA做為模板，參照文獻(xiàn)［8］根據(jù)豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖基因的特異性設(shè)計(jì)引物，分別用于豬鏈球菌血清1、2、7和9型的鑒定（表1）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)為25 μL體系，分別為2×PCR pre-Mix 12.5 μL、ddH2O 9.0 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2.5 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；最后4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并觀察記錄結(jié)果。

表1 豬鏈球菌血清1、2、7、9型鑒定的引物

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn)

選取紅霉素、氟苯尼考、阿莫西林、多黏菌素B、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、卡那霉素等28種常用藥物對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行。

1.3 綜合防治措施

根據(jù)豬場發(fā)病特征、實(shí)驗(yàn)室診斷的結(jié)果以及豬場用藥時(shí)能夠控制病情而停藥后出現(xiàn)反彈的實(shí)際情況，建議豬場主要用豬鏈球菌滅活疫苗進(jìn)行緊急免疫，同時(shí)再用敏感藥物進(jìn)行控制。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)特征

將組織病料接種的TSA平板置37℃溫箱，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)其中一頭病死豬的肺臟、淋巴結(jié)和腦組織接種的平板均有細(xì)菌生長；而另外一頭豬的肺、脾、腎和淋巴結(jié)也能培養(yǎng)出細(xì)菌，但腦組織沒分離出細(xì)菌，送檢病料樣品各器官細(xì)菌分離結(jié)果如表2所示。在TSA平板上均可觀察到形態(tài)一致，針尖大小、灰白透明、表面光滑的近圓形的菌落。

表2 送檢病料樣品各器官細(xì)菌分離結(jié)果

挑取單菌落涂片后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為G+菌，且以多個(gè)圓形或卵圓形組成的短鏈形式存在，符合豬鏈球菌的形態(tài)特征，具體鏡檢形態(tài)特征如圖1所示。

圖1 分離菌株革蘭氏染色鏡檢形態(tài)特征

2.2 生化特性的鑒定

取分離純化后菌株開展各種生化試驗(yàn)檢測。分離菌株的生理生化特征如表3所示，結(jié)果顯示，分離菌株糖、醇發(fā)酵能力以及各種生化試驗(yàn)的鑒定結(jié)果與豬鏈球菌的生化特性完全相符。

表3 分離菌株的生理生化特征

2.3 豬鏈球菌的分型鑒定

用豬鏈球菌的特異性分型引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR鑒定結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示，豬鏈球菌血清1、7和9型的特異性引物均未擴(kuò)出目的條帶，而豬鏈球菌血清2型的引物擴(kuò)增出450 bp的特異性目的條帶，表明該分離株為豬鏈球菌血清 2型。

圖2 豬鏈球菌血清1型、2型、7型、9型的PCR鑒定結(jié)果

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用常用28種抗生素對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測定，結(jié)果詳見表4。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該鏈球菌對頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢噻肟、米諾環(huán)素、萬古霉素、壯觀霉素6種藥物高度敏感；對頭孢西丁、頭孢拉定、頭孢呋辛、紅霉素、強(qiáng)力霉素、阿奇霉素、亞胺培南、氟苯尼考、阿莫西林、多黏菌素B、呋喃妥因11種藥物中度敏感；對鏈霉素、苯唑西林、氨曲南、左氟沙星、卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、青霉素、氧氟沙星、泰樂菌素11種藥物低度敏感或者耐藥。

表4 分離菌株的藥物敏感性結(jié)果 單位：mm

2.5 防控效果反饋

從5月31日豬場發(fā)生鏈球菌病例以來，至6月13日累計(jì)死亡28頭豬。6月14日采取豬鏈球菌滅活疫苗的緊急免疫，同時(shí)用敏感藥物進(jìn)行控制，隨后4天總共死亡3頭，第5天之后就沒有再出現(xiàn)鏈球菌病例，病情得到了完全控制。

3 討論

豬鏈球菌是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原菌之一，世界上幾乎所有養(yǎng)豬國家都廣泛存在該菌。豬鏈球菌血清型眾多，以血清2型危害最為嚴(yán)重。1990年在我國廣東省豬群中首次發(fā)現(xiàn)血清2型豬鏈球菌［9］，歷史上我國出現(xiàn)過2次由2型豬鏈球菌感染引起人死亡的事件。其一是1998年江蘇省豬場暴發(fā)的急性敗血型豬鏈球菌血清2型疫情，造成14人死亡［10］；其二是2005年夏天豬鏈球菌血清2型疫情在四川再次暴發(fā)，疫情殃及養(yǎng)豬從業(yè)者及生豬屠宰人員等，造成38人死亡，引起了世界范圍內(nèi)的高度關(guān)注。［11］除血清2型豬鏈球菌以外，血清1、7和9型等也是常見的引起豬感染發(fā)病的重要血清型，備受獸醫(yī)工作者的重視。

豬鏈球菌病在臨床上表現(xiàn)主要分為關(guān)節(jié)炎型、敗血癥型、腦膜炎型三種［12］。腦膜炎型通常表現(xiàn)為豬只突然倒地、站立不起、四肢劃水、眼瞼腫大和眼球突出的發(fā)病特征，及早發(fā)現(xiàn)及早救治的豬只一般能夠康復(fù)，若發(fā)病超過2小時(shí)沒有采取治療措施，基本上以死亡告終。本試驗(yàn)從疑似豬鏈球菌感染的患病死亡豬體內(nèi)分離到病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定確定該菌株為鏈球菌，結(jié)合臨床發(fā)病癥狀，初步判斷為本次疫情為腦膜炎型鏈球菌病。由于鏈球菌莢膜多糖抗原性是確定其血清型的重要依據(jù)，基于莢膜多糖抗原基因的差異設(shè)計(jì)血清型特異引物可以對鏈球菌分離菌株進(jìn)行精確的鑒定。王花茹［13］等建立的主要致病血清型多重PCR檢測方法對豬鏈球菌血清1型、2型、1/2型、7型、9型、14型等6種主要致病血清型檢出率可達(dá)100%。本試驗(yàn)中通過特異性的PCR引物對莢膜多糖基因進(jìn)行檢測，確定所分離的菌株為豬鏈球菌血清2型，為科學(xué)精準(zhǔn)的制定防控措施提供了重要依據(jù)。

為能夠提供可靠的治療方法，本試驗(yàn)對分離菌株進(jìn)行藥敏測定。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看，分離菌株對鏈霉素等11種藥物低度敏感或者耐藥，對頭孢西丁等11種藥物中度敏感，對頭孢哌酮等6種藥物高度敏感。由于豬場投藥能夠較好的控制病情，但停藥后病情反彈，結(jié)合臨床治療經(jīng)驗(yàn)，建議其配合采取疫苗免疫的策略。據(jù)豬場主反饋，在緊急免疫豬鏈球菌滅活疫苗5天后，就沒有再出現(xiàn)腦膜炎型鏈球菌的病例，收到了良好的防控效果。