接種AM真菌對紫枝玫瑰應(yīng)答舞毒蛾脅迫的影響1)

呂亞茹 王菲 張婷婷 陳紅 嚴(yán)俊鑫

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

玫瑰(Rosarugosa)花大色艷，香氣濃郁，多次開花且花期長，是優(yōu)良的園林綠化材料，同時具有極高經(jīng)濟(jì)價值，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、精油行業(yè)[1]。舞毒蛾(Lymantriadispar)是一種世界性害蟲，食性雜、分布廣、危害較大[2]，是玫瑰的主要害蟲之一，嚴(yán)重影響玫瑰的生長，降低玫瑰的價值，對玫瑰產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。目前蟲害防治主要依靠化學(xué)藥劑，此方法不僅污染環(huán)境，藥品殘留對玫瑰的食品安全性造成威脅。因此，探究環(huán)境友好的綠色生物防治技術(shù)成為當(dāng)下的迫切需求。

叢枝菌根(AM)真菌，作為一種生態(tài)友好的微生物廣泛存在于土壤中，能與陸地大約80%的植物根系形成共生體，提高植物抗性[3]。接種AM真菌提高了紫花苜蓿(Medicagosativa)[4]、箭舌豌豆(Acyrthosiphonpisum)[5]和烏桕(Triadicasebifera)[6]的抗蟲性。取食接種AM真菌的花生(Arachishypogaea)和番茄(Lycopersiconesculentum)抑制了甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的生長發(fā)育，使其存活率下降、幼蟲發(fā)育歷期和蛹期明顯延長[7]。用接種異形孢囊霉(Rhizophagusirregularis)的番茄(SolanumlycopersicumL.)喂養(yǎng)甜貪夜蛾(Spodopteralittoralis)幼蟲，其體質(zhì)量和存活率比對照分別降低32%和19%[8]。相關(guān)研究表明AM真菌作為一個連接植物和昆蟲的橋梁，可以通過調(diào)控植物生長和生理生化等來增強(qiáng)植物對昆蟲的防御[9-10]，因此，這為生物防治提供了新的探索思路。

遭受蟲害脅迫時會破壞植物正常生長代謝所保持的動態(tài)平衡，誘導(dǎo)活性氧大量生成，因此在植物應(yīng)對蟲害脅迫時會啟動相關(guān)防御酶進(jìn)行防御[11]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等防御酶可促進(jìn)植物體合成抗蟲物質(zhì)，使昆蟲中毒，影響其取食、消化及生長發(fā)育[11-12]，在植物應(yīng)對蟲害脅迫中起重要作用。對菜青蟲(Pierisrapae)表現(xiàn)出顯著抗性的野生甘藍(lán)(Brassicaincana)體內(nèi)的PPO、POD和PAL酶活性顯著升高[13]。胰蛋白酶抑制劑(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI)能與昆蟲消化道內(nèi)的蛋白消化酶相互作用，從而使昆蟲厭食，降低昆蟲體質(zhì)量并抑制其生長發(fā)育[14]。柳蠣盾蚧(Lepidosaphessalicina)危害盛期，丁香(Syringaspp.)的TI和CI升高幅度與丁香抗蟲性呈正相關(guān)[15]。植物次生代謝產(chǎn)物是植物抵抗病蟲害防御中協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果[16]，其中在抗蟲中起重要作用的次生代謝物有單寧、酚類和類黃酮等物質(zhì)，影響昆蟲的取食和生長發(fā)育[17]。致癭昆蟲(gall-inducing insects)常誘導(dǎo)寄主植物合成大量酚類，植物對致癭昆蟲的抗性與體內(nèi)酚類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)[18]。小麥(Triticumaestivum)葉片內(nèi)高的總酚和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)抑制了草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)幼蟲的取食[19]。在研究楊樹(Populusspp.)抗蟲性時發(fā)現(xiàn)類黃酮化合物是楊樹的重要抗蟲物質(zhì)[20]。

目前，關(guān)于AM真菌應(yīng)用于園林植物抗蟲脅迫的研究尚不多見，本研究以紫枝玫瑰為植物材料，測定取食菌根玫瑰對舞毒蛾幼蟲發(fā)育歷期及體質(zhì)量的影響，以及接種AM真菌后玫瑰體內(nèi)防御蛋白及次生代謝物質(zhì)的變化，探究接種叢枝菌根真菌對紫枝玫瑰應(yīng)答舞毒蛾脅迫的影響，豐富AM真菌提高植物抗蟲性相關(guān)研究，為生物防治相關(guān)理論研究提供參考。

1 材料與方法

玫瑰品種為紫枝玫瑰(Rosarugose‘Zi Zhi’)，選取粗細(xì)長短一致的健康枝條于2020年1月在溫室進(jìn)行扦插。V(珍珠巖)∶V(蛭石)∶V(花卉土)=1∶1∶1混合，經(jīng)高壓蒸汽121 ℃滅菌2 h。玫瑰扦插于直徑為15 cm、高13 cm的花盆中，插后立即澆透水，每隔7 d每盆噴施1/4的無磷Hoagland營養(yǎng)液，用于試驗。

AM真菌為摩西斗管囊霉(FM)，購買于甘肅省武威市林科院，為孢子、菌絲及菌根根段的土壤混合物。試驗昆蟲為舞毒蛾幼蟲，卵塊采自林場，用10%的甲醛溶液消毒1 h，洗凈后放入溫度為(25±1)℃、相對濕度為(70±1)%、光周期為16 h黑暗和8 h光照的培養(yǎng)箱孵化，之后用人工飼料喂養(yǎng)至3齡用于試驗。

試驗于2020年5月下旬進(jìn)行，2個AM真菌處理，接種AM真菌摩西斗管囊霉(FM)和不接種AM真菌(NM)；2個舞毒蛾處理，接蟲(infestation byLymantriadispar，L)與不接蟲；共4個處理組：NM、FM、NM+L、FM+L，每個處理組3個重復(fù)，共計60盆。每盆混入AM真菌孢子數(shù)量為12個/g的真菌混合物30 g(FM處理)，對應(yīng)的NM處理添加30 g滅菌基質(zhì)，2個月后測定菌根侵染率。隨后做接蟲處理，選取新蛻皮不超過12 h，大小一致的3齡舞毒蛾幼蟲饑餓處理12 h，一部分幼蟲用玫瑰葉片進(jìn)行喂養(yǎng)，測定幼蟲發(fā)育歷期及體質(zhì)量，每個處理20頭。另一部分接到玫瑰植株上，每個處理3株，每株3頭幼蟲，外套紗網(wǎng)系緊，接蟲5 d后收獲植株，存放于冰箱-80 ℃保存用于生理生化指標(biāo)的測定。

菌根侵染率的測定依據(jù)Phillips[21]方法測定，并略有改進(jìn)，采用臺盼藍(lán)染色。將清洗干凈的根剪成0.5～1.0 cm的小段放入試管中，加入5% KOH溶液90 ℃水浴20 min后再用清水洗3次，乳酸酸化5 min后再用0.2%酸性品紅乳酸甘油染色液90 ℃水浴20 min染色，制成臨時切片在熒光顯微鏡下鏡檢觀察。菌根侵染率=(被侵染的根段數(shù)/鏡檢總根段數(shù))×100%，最后測得的FM菌根侵染率為70.12%。

舞毒蛾幼蟲指標(biāo)測定。采取新鮮玫瑰葉片喂養(yǎng)舞毒蛾幼蟲，在幼蟲蛻皮進(jìn)入4、5和6齡時，記錄幼蟲的發(fā)育歷期，用電子分析天平稱量每頭舞毒蛾幼蟲體質(zhì)量。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)采用苯丙氨酸比色法，多酚氧化酶(PPO)采用鄰苯二酚法，過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法，胰蛋白酶抑制劑(TI)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI)采用孟昭君[22]和段文昌等[23]的方法測定，總酚采用福林酚比色法，黃酮和單寧采用王燕芳[24]的方法。

用Excel2011統(tǒng)計數(shù)據(jù)，SPSS26.0計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，獨(dú)立樣本T檢驗對同一齡期下的發(fā)育歷期和體質(zhì)量進(jìn)行分析，用單因素分析對防御蛋白活性和次生代謝物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行一般描述與統(tǒng)計并進(jìn)行事后多重比較(LSD法)，用一般線性分析對取食和AM接菌兩因素進(jìn)行雙因素方差分析，用皮爾遜相關(guān)性系數(shù)對舞毒蛾幼蟲發(fā)育歷期、體質(zhì)量及玫瑰各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種AM真菌對舞毒蛾生長發(fā)育的影響

由表1可知，與NM相比，取食菌根玫瑰葉片顯著延長了舞毒蛾幼蟲4、5和6齡的發(fā)育歷期，分別延長了2.48、1.07和1.29d。取食菌根玫瑰葉片顯著降低了舞毒蛾幼蟲4、5和6齡的體質(zhì)量，與NM相比，分別降低了34.10%、22.17%和23.89%。

表1 接種AM真菌后舞毒蛾幼蟲發(fā)育歷期和體質(zhì)量的情況

2.2 玫瑰植株防御酶活性

接種AM真菌與玫瑰葉片中的PAL、PPO和POD活性存在顯著相關(guān)性(表2)。接種前，相比于NM，接種FM顯著提高了玫瑰葉片的PPO和POD酶活性，分別提高了66.35%和34.04%；接種后，接種FM的玫瑰葉片表現(xiàn)出更高的PPO和POD酶活性，分別提高了36.28%和11.92%(表3)。

表2 AM真菌、舞毒蛾及兩者互作效應(yīng)方差分析P值

舞毒蛾幼蟲取食與玫瑰葉片中的PAL、PPO和POD活性極顯著相關(guān)(表2)。無論是否接菌，舞毒蛾幼蟲取食均顯著提高了玫瑰葉片的PAL、PPO和POD酶活性；對于未接菌處理的NM來說，舞毒蛾幼蟲取食顯著提高了玫瑰葉片的PAL、PPO和POD酶活性，分別提高了131.39%、215.68%和221.28%；對接種FM來說，舞毒蛾幼蟲取食后的玫瑰葉片表現(xiàn)出更高的PAL、PPO和POD酶活性，分別提高了100.29%、158.62%和168.25%(表3)。

AM真菌與玫瑰葉片中的CI和TI活性存在顯著相關(guān)性(表2)。無論是否做接蟲處理，接種FM均較NM表現(xiàn)更高的TI和CI活性。接蟲前，接種FM顯著提高了玫瑰葉片的TI和CI，分別提高了34.80%和49.19%；接蟲后，接種FM的玫瑰葉片較未接菌表現(xiàn)出更高的TI和CI活性，分別提高了62.77%和41.74%(表4)。

表4 接種AM真菌和舞毒蛾取食下玫瑰葉片TI和CI的活性 U·g-1

舞毒蛾幼蟲取食與玫瑰葉片中的CI活性極顯著相關(guān)，但與TI活性無顯著相關(guān)性(表2)。對于NM和FM來說，舞毒蛾幼蟲取食均顯著提高了玫瑰葉片的TI和CI。對于NM來說，舞毒蛾幼蟲取食顯著提高了玫瑰葉片的TI和CI，分別提高了5.92%和73.58%；對于FM，舞毒蛾幼蟲取食提高了玫瑰葉片的TI和CI活性分別為27.90%和64.91%(表4)。

2.3 玫瑰植株抗蟲次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)

AM真菌與玫瑰葉片中的黃酮、總酚和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著相關(guān)性，且與總酚和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著相關(guān)(表2)。無論是否接蟲，較NM玫瑰來說，接種FM的玫瑰葉片表現(xiàn)更高黃酮、總酚和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)；接蟲前，對NM玫瑰來說，接種FM顯著提高了玫瑰葉片的黃酮、總酚和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別提高了35.50%、23.75%和35.49%；接蟲后，接種FM顯著提高了玫瑰葉片的黃酮、總酚和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別提高了44.09%、23.80%和21.19%(表5)。

舞毒蛾幼蟲取食與玫瑰葉片中的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著相關(guān)，與單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著相關(guān)，但與黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著相關(guān)性(表2)。無論是否接菌，舞毒蛾幼蟲取食均未顯著改變玫瑰葉片的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。對于NM玫瑰來說，舞毒蛾幼蟲取食顯著提高了玫瑰葉片中的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.06%，顯著提高了玫瑰葉片中的單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)42.90%；對于FM玫瑰來說，舞毒蛾幼蟲取食顯著提高了玫瑰葉片中的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.12%，顯著提高了玫瑰葉片中的單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)27.81(表5)。

2.4 相關(guān)性分析

圖1為舞毒蛾幼蟲發(fā)育歷期、體質(zhì)量及玫瑰各指標(biāo)的相關(guān)性分析。體質(zhì)量與玫瑰POD酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，舞毒蛾幼蟲發(fā)育歷期與玫瑰的PAL酶活、總酚和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著相關(guān)，與玫瑰CI、TI、PPO、POD酶活和黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，說明玫瑰各指標(biāo)與玫瑰抵抗舞毒蛾防御相關(guān)，接種AM真菌通過增強(qiáng)玫瑰防御蛋白活性和提高抗蟲相關(guān)次生代謝物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增強(qiáng)了玫瑰對舞毒蛾的防御，提高了玫瑰的抗蟲性。

*表示顯著相關(guān)(P<0.05),** 表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)慢生長-高死亡率假說，發(fā)育期延長的昆蟲更難完成整個發(fā)育歷期繁衍后代，更容易被天敵捕食，所以抑制昆蟲的生長發(fā)育說明植物在抵抗防御[25]。用接種摩西斗管囊霉的銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)葉片喂養(yǎng)舞毒蛾幼蟲顯著延長了其4和5齡幼蟲的發(fā)育歷期，體質(zhì)量、體長和頭鞘寬顯著降低，存活率也顯著降低[26]。本研究也表明取食菌根玫瑰葉片顯著降低了4、5和6齡舞毒蛾幼蟲的體質(zhì)量，延長了其發(fā)育歷期，說明取食菌根玫瑰葉片顯著抑制了舞毒蛾幼蟲的生長發(fā)育，提高了玫瑰對舞毒蛾的抗性。

研究表明PPO、PAL和POD可以通過改變植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)而干擾植物對昆蟲的營養(yǎng)利用產(chǎn)生防御[27]。舞毒蛾取食誘導(dǎo)了小黑楊(Populussimonii×P.nigra)葉片中PPO、POD和PAL的活性增高[28-29]。接種根際促生菌(Bacillusvelezensis)番茄幼苗的PPO和POD活性顯著增高，提高了番茄對斜紋夜蛾(Spodopteralitura)的抗性[30]。在本研究中，接種AM真菌的玫瑰葉片體內(nèi)表現(xiàn)了更高的PPO、PAL和POD活性，說明接種AM真菌誘導(dǎo)了玫瑰葉片防御酶活性的提高，增強(qiáng)了玫瑰的防御。植物蛋白酶抑制劑通過削弱或阻斷消化酶對食物中的蛋白質(zhì)起水解消化作用，刺激昆蟲消化酶過度分泌，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)[31]。癭螨(AceriapallidaKeifer)取食使枸杞(LyciumbarbarumL.)葉片中的CI和TI明顯增強(qiáng)，表明枸杞在癭螨危害下誘導(dǎo)了抗蟲性[23]。該研究也表明舞毒蛾取食后的菌根玫瑰葉片體內(nèi)的CI和TI顯著高于未接種玫瑰葉片，說明接種AM真菌誘導(dǎo)玫瑰對舞毒蛾幼蟲具有更強(qiáng)的防御。

植物在遭到蟲害后會通過積累一些次生代謝物質(zhì)來抵抗防御，部分次生代謝物質(zhì)會對昆蟲產(chǎn)生趨避、引誘、拒食、毒殺和不育等作用，抑制昆蟲的生長發(fā)育[32]。單寧和類黃酮化合物因其澀性，降低昆蟲的適口性從而使昆蟲產(chǎn)生拒食[33]。酚類物質(zhì)與昆蟲腸道中蛋白酶共價結(jié)合，抑制昆蟲體內(nèi)的消化酶來抑制昆蟲的消化，從而產(chǎn)生防御[34]。接種摩西斗管囊霉顯著提高了銀中楊葉片中的黃酮、總酚和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)[26]。用添加有黃酮或單寧的人工飼料喂養(yǎng)美國白蛾(Hyphantriaaunea)幼蟲，其取食量、食物轉(zhuǎn)化率、食物利用率和相對增長率均不同程度的低于對照組[35]。王亞軍等[36]也發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物中的山奈酚對舞毒蛾幼蟲有很強(qiáng)的拒食效果。本試驗中，接種AM真菌的玫瑰葉片中的總酚、黃酮和單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于未接種的玫瑰植株，說明接種AM真菌促進(jìn)了玫瑰葉片中次生代謝物質(zhì)的積累，提高了玫瑰的防御。

本試驗結(jié)果表明，接種AM真菌顯著延長了舞毒蛾幼蟲的發(fā)育歷期，降低了舞毒蛾幼蟲的體質(zhì)量，抑制了其生長發(fā)育。通過進(jìn)一步的生理測定，發(fā)現(xiàn)接種AM真菌顯著增強(qiáng)了玫瑰葉片體內(nèi)的防御蛋白活性，提高了抗蟲相關(guān)次生代謝物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。綜上，接種AM真菌增強(qiáng)玫瑰對舞毒蛾的防御，提高了玫瑰的抗蟲性。