一種復(fù)方中草藥制劑對(duì)草魚非特異性免疫機(jī)能的影響

鄭善堅(jiān)，胡金春，葉霆，史文競(jìng)，于瑾

(1.浙江師范大學(xué)，浙江 金華 321004； 2.衢州市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，浙江 衢州 324000；3.龍游縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，浙江 龍游 324400)

草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的淡水魚類，2019年產(chǎn)量達(dá)到553.3萬(wàn)t(2020中國(guó)漁業(yè)年鑒)。草魚耐粗飼，生長(zhǎng)速度快，肉質(zhì)細(xì)嫩，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但隨著草魚養(yǎng)殖密度提高，受水質(zhì)、飼料質(zhì)量及種質(zhì)退化等影響，草魚病害問(wèn)題突出，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

研究表明，單一或復(fù)方的中草藥內(nèi)服等可以提高水產(chǎn)動(dòng)物抵御外界不良環(huán)境的能力，可促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫指標(biāo)的提高，增強(qiáng)其免疫機(jī)能，提高水產(chǎn)動(dòng)物生存能力[1]。田照輝等[2]將由植物多糖、益生素、寡糖和天然分子篩等成分有機(jī)結(jié)合成的復(fù)方中草藥制劑在飼料中添加1%飼喂，顯著降低了草魚的病害發(fā)生率和死亡率。植物多糖、益生素和寡糖還能調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)環(huán)境，增加消化酶的分泌，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病力[3-6]。本試驗(yàn)通過(guò)篩選復(fù)方中草藥制劑，研究其在不同拌喂策略時(shí)對(duì)草魚血清免疫活性影響，以期為草魚的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用草魚來(lái)自于浙江龍和水產(chǎn)養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)有限公司，草魚體質(zhì)健壯，外表無(wú)傷，規(guī)格為(162.04±7.31)g，經(jīng)室內(nèi)循環(huán)流水暫養(yǎng)7 d后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.2 復(fù)方中草藥制劑組成

使用的復(fù)方中草藥制劑主要由郁金、五味子、甘草、黃芪多糖等組成，使用前與草魚飼料(通威飼料182，蛋白28%)按1%的添加比例制成粒徑約2.0 mm的飼料顆粒，避光風(fēng)干備用。

1.3 處理設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以未添加復(fù)方中草藥制劑的實(shí)驗(yàn)初始草魚為對(duì)照(SⅠ)；設(shè)計(jì)4個(gè)試驗(yàn)組，分別為持續(xù)拌喂復(fù)方中草藥制劑7 d組(SⅡ)，持續(xù)拌喂復(fù)方中草藥制劑14 d組(SⅢ)，拌喂7 d后停7 d組(SⅣ)及拌喂7 d后停14 d組(SⅤ)，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在養(yǎng)殖桶(直徑1 m，水位0.5 m)內(nèi)進(jìn)行，每桶放養(yǎng)10尾試驗(yàn)草魚；每日19：00投喂1次，投餌率為魚體重的2%；試驗(yàn)期間水溫為26～32 ℃，溶解氧保持在6 mg·L-1以上，pH為7.8±0.1。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與分析

1.4.1 血液生化指標(biāo)測(cè)定

隨機(jī)選取3尾魚進(jìn)行尾靜脈采血，室溫自然凝固20 min后，3 000 r·min-1室溫離心20 min取上清液，-20 ℃保存，用于血液生化指標(biāo)測(cè)定。SOD采用WST-1法測(cè)定，MDA采用TBA法，使用試劑盒均來(lái)自南京建成生物工程研究所。

1.4.2 血液中免疫相關(guān)基因MHCⅠ的表達(dá)量分析

草魚MHCⅠ基因引物F：5′-GATCCCTCCTCTC CAGTGACG-3′，R：5′-GTCCTCATTGGGAAGAAGTTCA-3′，委托上海生工合成。取試驗(yàn)草魚血液樣品300 μL，RNA提取試劑盒提取總RNA，按照cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄。將得到的cDNA模板置于qRT-PCR反應(yīng)體系中，經(jīng)過(guò)6 000 r·min-1離心后，置于ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀，以95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)為擴(kuò)增程序；β-actin(登錄號(hào)：DQ211096.1)為內(nèi)參基因，每孔3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法分別計(jì)算MHCⅠ免疫基因在血液中的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)做3次獨(dú)立反應(yīng)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，使用Shapiro-Wilk和Levene檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差同質(zhì)性分析，利用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)各組之間的顯著性，并用Duncan’s法進(jìn)行多重分析，P<0.05為差異顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥制劑對(duì)草魚免疫活性的影響

由圖1可知，使用復(fù)方中草藥制劑后的試驗(yàn)組草魚SOD活性均顯著高于對(duì)照組，除SⅣ組和SⅤ組之間無(wú)顯著性差異外，其余各組間差異顯著。草魚SOD活性依次是SⅡ組>SⅢ組>SⅣ組>SⅤ組>對(duì)照組；試驗(yàn)組草魚血液MDA含量和對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

同一指標(biāo)不同處理間沒(méi)有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 復(fù)方中草藥制劑對(duì)草魚免疫活性的影響

2.2 復(fù)方中草藥制劑對(duì)草魚免疫基因MHCⅠ表達(dá)量的影響

由表1可知，使用復(fù)方中草藥制劑后試驗(yàn)組草魚SⅢ的MHCⅠ免疫基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組，其他各組之間無(wú)顯著性差異。

表1 抗應(yīng)激劑對(duì)草魚免疫基因MHC Ⅰ 表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥制劑對(duì)草魚非特異性免疫功能的影響

SOD是魚體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)。SOD可以幫助魚體清除自由基，對(duì)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力和機(jī)體的免疫功能具有重要作用[7]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加1%的復(fù)方中草藥制劑可以顯著提高草魚血清中SOD活性。其中，添加1%復(fù)方中草藥制劑持續(xù)拌喂7 d時(shí)草魚的SOD活性最高，其次是持續(xù)拌喂14 d時(shí)的草魚，然后是拌7 d停7 d和拌7 d停14 d時(shí)的草魚。李赫等[8]發(fā)現(xiàn)投喂含黃芪多糖、枸杞多糖和金絲桃素的飼料使草魚血清SOD活性顯著高于對(duì)照組。本試驗(yàn)用的復(fù)方中草藥制劑含有黃芪多糖、姜黃等，被證明具有增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能，能不同程度地提高草魚血清的SOD活性。研究也發(fā)現(xiàn)，持續(xù)拌喂復(fù)方中草藥制劑14 d時(shí)草魚血清SOD活性較持續(xù)拌喂7 d時(shí)反而下降，分析原因可能是持續(xù)拌喂復(fù)方中草藥制劑造成了草魚的免疫疲勞。這與Lin等[9]認(rèn)為,長(zhǎng)期口服復(fù)方中草藥制劑會(huì)降低魚類免疫水平的結(jié)果一致。姚嘉赟等[10]在研究3種免疫增強(qiáng)劑(黃芪、參芪和酵母)對(duì)黃顙魚血清中SOD活性的影響中發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)組的血清SOD活性在7 d達(dá)到峰值，此后呈降低趨勢(shì)，與本研究的結(jié)果類似。

本研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)方中草藥制劑草魚血清的MDA含量與對(duì)照差異不顯著。MDA是細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)物之一，其含量的高低可以反映機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的程度。當(dāng)生物體內(nèi)的氧化脅迫超過(guò)生物體自身抗氧化防御系統(tǒng)的保護(hù)能力時(shí)，就不可避免地對(duì)生物體造成毒害[11]。徐軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)草魚受到臭氧的脅迫時(shí)，其血清中的MDA含量會(huì)升高，脅迫解除時(shí)，MDA含量的水平會(huì)恢復(fù)至正常水平。本研究草魚血清中的MDA含量未見(jiàn)顯著性差異，推測(cè)可能是由于本試驗(yàn)草魚并未受到外來(lái)脅迫，因此,變化并不明顯。

3.2 復(fù)方中草藥制劑對(duì)草魚MHCⅠ免疫基因的影響

主要組織相容性復(fù)合體(MHC)在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，通過(guò)編碼抗原識(shí)別蛋白激發(fā)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)。MHCⅠ類分子主要是呈遞內(nèi)源性抗原多肽，與處理后的多肽結(jié)合形成復(fù)合體，并激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+)，使T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫[13]。吳凡等[14]檢測(cè)草魚在嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染后的MHCⅠ區(qū)部分免疫基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，BRD2、MHCⅠa、PSMB9、TAP2的表達(dá)量在攻毒后都有顯著性變化，表明這4個(gè)基因在草魚免疫方面具有重要的作用。許友卿等[15]發(fā)現(xiàn),在飼料中添加5.0%和7.5%杜仲葉粉組使青魚腎組織中MHCⅠ基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組，添加2.5%杜仲葉粉組相比于對(duì)照組無(wú)顯著差異。本研究中1%復(fù)方中草藥制劑持續(xù)拌喂14 d，草魚血清中MHCⅠ免疫基因的表達(dá)量有顯著提升，其他試驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。說(shuō)明1%復(fù)方中草藥制劑具有調(diào)節(jié)免疫基因的功能，但需要一定的持續(xù)時(shí)間。

3.3 復(fù)方中草藥制劑的作用機(jī)制

本試驗(yàn)的復(fù)方中草藥制劑主要組成為郁金、五味子、甘草、黃芪多糖等。其中郁金含有揮發(fā)油和姜黃素，具有行氣解郁、清心涼血、利膽退黃等功效[16]，姜黃素能夠顯著提高羅非魚的SOD活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)腸道組織發(fā)育[17]；五味子具有降血脂和舒張血管的心血管保護(hù)作用，具有抗氧化和免疫活性[18]；甘草中的甘草多糖可對(duì)特異性免疫、非特異性免疫有正向調(diào)節(jié)作用，可以提高異育銀鯽上清中GSH-Px和SOD活力以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成來(lái)減輕對(duì)肝細(xì)胞的損傷；黃芪多糖則具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗病毒、抗氧化等多種藥理功效。黃芪多糖可使小鼠血清中IgA、IgG、IgM的含量顯著提高；還可刺激T、B淋巴細(xì)胞、抗體分泌細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，使其活力增強(qiáng)[19]。復(fù)方中草藥制劑通過(guò)綜合調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的特異性與非特異性免疫，參與草魚的免疫保護(hù)。