2,4-表油菜素內(nèi)酯對高溫脅迫下金線蓮的影響

葉巧玲，董向陽，顏丹紅，屈雨晨，劉永立，胡海濤*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004； 2.玉環(huán)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村和水利局，浙江 臺(tái)州 317600；3.浙江大學(xué) 新農(nóng)村研究院，浙江 杭州 310058)

金線蓮又名金線蘭、金絲草、金不換等，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴藥材，具有較高的藥用價(jià)值，在民間素有“金草”“神藥”“烏人參”等美稱[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金線蓮具有抗腫瘤、降血糖、保肝、抗HBV和降血壓等功效，藥用價(jià)值和保健功能顯著，市場開發(fā)價(jià)值極高[2-3]。近年來，金線蓮的市場需求量巨大，價(jià)格居高不下，人工栽培是解決其供需矛盾的唯一途徑。金線蓮喜陰涼、潮濕的環(huán)境，適宜生長溫度為18～25 ℃，南方夏季35 ℃以上的高溫嚴(yán)重影響人工栽培金線蓮的產(chǎn)量[4]，雖然大棚栽培可以通過密閉水簾等方式降溫，但運(yùn)行成本較高。因此，南方夏季高溫已成為制約金線蓮人工栽培產(chǎn)業(yè)推廣、發(fā)展的瓶頸，尋找緩解高溫脅迫的有效途徑是目前金線蓮人工栽培生產(chǎn)中急需解決的問題。迄今為止，僅林曉紅等[4]對高溫脅迫下金線蓮葉綠素?zé)晒鈪?shù)、SOD活性及電導(dǎo)率等生理指標(biāo)進(jìn)行了初步研究，未見有關(guān)緩解金線蓮夏季高溫脅迫的相應(yīng)解決措施的報(bào)道。

油菜素甾醇類(BRs)是已公認(rèn)的第六大類植物激素，具有促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂、促進(jìn)光合作用、提高植物抗逆性等作用[5]。大量研究[5-6]表明，BRs能有效提高植物的抗熱、抗寒、抗?jié)n和抗旱等能力。吳進(jìn)東等[7]研究了油菜素內(nèi)酯對霍山石斛耐熱性的影響，發(fā)現(xiàn)外源噴施BR可以顯著增強(qiáng)霍山石斛耐熱性，緩解高溫脅迫對霍山石斛的傷害。陸兵等[8]發(fā)現(xiàn)外源EBR(2，4-表油菜素內(nèi)酯)可以通過提高浙貝母葉片可溶性蛋白、葉綠素含量和抗氧化酶活性，來降低體內(nèi)活性氧水平，進(jìn)而提高浙貝母的耐熱性。張永平等[9]研究了EBR對高溫脅迫下甜瓜幼苗生理及光合特性的影響，結(jié)果表明，EBR處理顯著促進(jìn)甜瓜幼苗生長，有利于高溫脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的維持和對光能的捕獲與轉(zhuǎn)換。目前，有關(guān)EBR對高溫脅迫下金線蓮耐熱性影響的研究鮮有報(bào)道。本文研究了EBR對高溫脅迫下金線蓮葉片中活性氧代謝及抗氧化系統(tǒng)的影響，以期為利用EBR緩解夏季高溫脅迫對金線蓮產(chǎn)生的危害提供理論和生產(chǎn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

試驗(yàn)于2019年5—9月在浙江師范大學(xué)植物分子生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。首先選取生長勢一致的金線蓮組培苗，以泥炭土為栽培基質(zhì)進(jìn)行定植，然后放入智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周；培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃/(20±1)℃(晝/夜)，光周期12 h/12 h(晝/夜)，光照強(qiáng)度4 000 lx，相對濕度保持在70%～80%。

高溫處理前，先分別用1.0 μmol·L-1EBR、蒸餾水(均含0.02% Tween 20)噴施金線蓮植株，每株50 mL，連續(xù)噴灑4 d，使金線蓮苗充分吸收EBR。4 d后進(jìn)行溫度處理，試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理組合，每個(gè)處理50株：常溫噴蒸餾水、常溫噴EBR、高溫脅迫噴蒸餾水、高溫脅迫噴EBR。培養(yǎng)箱參數(shù)：常溫處理為(25±1) ℃/(20±1)℃(晝/夜)，高溫脅迫處理為(35±1) ℃/(30±1)℃(晝/夜)，除溫度處理不同，光強(qiáng)、濕度等其他因素均保持一致。高溫脅迫6 d后剪取金線蓮葉片進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。處理編號(hào)：常溫噴施蒸餾水，Normal temperature(NT)；常溫噴施EBR，Normal temperature+EBR(BRNT)；高溫噴施蒸餾水，Heat temperature+H2O2(HT)；高溫噴施EBR，Heat temperature+EBR(BRHT)。

1.2 指標(biāo)測定

1.2.1 活性氧測定

1.2.2 抗氧化劑測定

參照Costa等[12]的方法測定還原型抗壞血酸和總抗壞血酸的含量。測定D525，含量以mg·g-1表示。總抗壞血酸(AsA+DHA)含量通過被二硫蘇糖醇還原后的AsA測定，氧化型抗壞血酸(DHA)含量=總抗壞血酸-還原型抗壞血酸(AsA)。

GSH和總谷胱甘肽(GSH+GSSG)含量測定參考Anderson等[13]的方法。測定D412值，含量以mg·g-1表示。

1.2.3 抗氧化酶活性測定

SOD活性測定參照Stewart等[14]的方法，采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法，將抑制NBT光還原的50%作為1個(gè)酶活單位(U)，酶活性以U·g-1表示。CAT活性測定參照Aebi的方法[15]，將D240每分鐘減少0.1作為1個(gè)酶活單位(U)，酶活性以U·g-1表示。采用Jiang等[16]的方法提取AsA-GSH循環(huán)酶。分別參照Nakano等[17]、Hossain等[18]、Foyer等[19]的方法，檢測APX、DHAR、MDHAR、GR的活性。APX和DHAR以D265每分鐘減少0.1作為1個(gè)酶活單位，酶活性均以U·g-1·min-1表示，GR和MDHAR以D340每分鐘減少0.01作為1個(gè)酶活單位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各指標(biāo)測定重復(fù)3次，取平均值，使用SPSS軟件對平均數(shù)進(jìn)行Duncan’s多重比較，分析差異顯著性，再用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對金線蓮和H2O2含量的影響

表1 外源EBR處理對金線蓮產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

2.2 對金線蓮SOD和CAT活性的影響

柱上無相同小寫字母表示組間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，圖2～4同。圖1 外源EBR處理對金線蓮SOD、CAT活性的影響

2.3 對金線蓮抗壞血酸循環(huán)的影響

在AsA-GSH循環(huán)中，AsA含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA)比值與抗逆性呈正相關(guān)[20]。AsA通過APX酶參與清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，以此減輕脅迫(高溫、低溫、鹽堿、紫外線等)下引發(fā)的氧化脅迫，植株內(nèi)AsA的含量及AsA/DHA比值在一定程度上能夠反映植物的抗逆性強(qiáng)弱。在正常條件下，單獨(dú)EBR處理對AsA、DHA含量以及AsA/DHA比值無明顯影響(圖2)。與對照相比，高溫脅迫使金線蓮葉片AsA含量顯著下降，DHA含量升高；AsA/DHA比值與AsA含量變化趨勢一樣，顯著下降。而高溫脅迫下噴施外源EBR后，金線蓮葉片內(nèi)AsA含量比未噴施組顯著增加，AsA/DHA比值也顯著提高；相反，DHA的含量顯著下降。由此說明，連續(xù)6 d的高溫脅迫下，AsA再生能力減弱，細(xì)胞氧化還原力降低，抗氧化能力下降，而外源EBR處理可以顯著提高金線蓮葉片內(nèi)AsA含量及AsA/DHA比值，從而增強(qiáng)植株的抗逆能力。

圖2 外源EBR處理對金線蓮葉片中AsA和DHA含量的影響

2.4 對金線蓮谷胱甘肽循環(huán)的影響

GSH是AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中重要的抗氧化劑，GSH可直接與活性氧自由基反應(yīng)，并由GSH轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG，GR利用NADPH的電子將GSSG還原為GSH，從而使細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽庫保持在還原狀態(tài)，增強(qiáng)植物對逆境的抵抗力。正常溫度下EBR處理對GSH、GSSG含量以及GSH/GSSG比值無明顯影響，而高溫脅迫下，GSH含量顯著下降，GSSG顯著上升，GSH/GSSG比值顯著下降；高溫脅迫下，外源EBR處理較未噴施組顯著提高金線蓮葉片中GSH含量及GSH/GSSG比值，而且GSSG含量較對照顯著下降，其中GSH含量顯著上升(圖3)。外源EBR處理顯著提高了GSH含量及GSH/GSSG，表明外源EBR處理有利于維護(hù)谷胱甘肽系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

圖3 外源EBR處理對高溫脅迫下金線蓮葉片中GSH和GSSG含量的影響

2.5 對金線蓮AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活性的影響

與常溫相比，高溫脅迫處理下金線蓮葉片中APX活性顯著下降，而外源EBR處理比未噴施顯著提高了金線蓮葉片中APX活性，從而保證H2O2可以被及時(shí)清除(圖4)。AsA-GSH循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)效率與MDHAR、DHAR、GR等酶的活性密切相關(guān)，這些酶參與了AsA-GSH循環(huán)中AsA的再生。AsA被氧化形成MDHA，MDHA在MDHAR的作用下再生成AsA，或通過非酶促歧化形成DHA，在DHAR參與下DHA可以再生形成AsA。植株AsA-GSH循環(huán)酶并不直接作用于活性氧物質(zhì)，其作用機(jī)制主要是為了保持體內(nèi)抗氧化物質(zhì)AsA、GSH的還原性，與H2O2的清除密切相關(guān)。在正常條件下，EBR處理對MDHAR、DHAR、GR活性無顯著影響。高溫脅迫導(dǎo)致金線蓮葉片中MDHAR、DHAR、GR等酶活性比對照均顯著降低，而外源EBR處理可以使金線蓮葉片中AsA-GSH循環(huán)中MDHAR、DHAR、GR的活性均顯著提高。由此可見，外源的EBR處理可以通過提高金線蓮葉片中MDHAR、DHAR、GR的活性，保證其體內(nèi)AsA含量水平，從而增強(qiáng)金線蓮的抗高溫能力。

圖4 外源EBR處理對金線蓮葉片APX、MDHAR、DHAR、GR活性的影響

3 討論

綜上所述，高溫脅迫下，噴施適宜濃度的外源EBR可以激活金線蓮的活性氧防御系統(tǒng)，從而增加活性氧清除能力，降低了ROS積累水平，進(jìn)而減輕了高溫脅迫對金線蓮組織細(xì)胞的損傷程度，增強(qiáng)金線蓮植株抵抗高溫脅迫的能力。