超聲輔助離子液體混合溶劑提取甘薯葉片多酚物質(zhì)

張文婷，孫健，徐飛，朱紅，岳瑞雪，張毅，馬晨，鈕福祥

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所，江蘇 徐州 221131)

甘薯葉片中含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有提高人體免疫力、促進(jìn)膽固醇的排泄、防止心血管脂肪沉積等保健功能[1-2]。甘薯葉片中含有大量的多酚類物質(zhì)，包括酚酸、花青素和類黃酮等[3]。多酚類物質(zhì)具有清除自由基、抗氧化、抗動脈硬化、抗衰老和防治心血管疾病等多種生理功能[4-5]，隨著“追求天然”消費(fèi)觀念的興起，植物多酚作為純天然提取物深受人們的喜愛，在制藥、生化、食品及精細(xì)化工等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。

室溫離子液體(RTILs-room temperature ionic liquids，IL)是指室溫范圍或100 ℃以內(nèi)可呈現(xiàn)為液態(tài)的熔融鹽[6]，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、萃取能力好、可重復(fù)利用等特殊性質(zhì)。由于其具有優(yōu)良的特性，是許多化學(xué)反應(yīng)、活性物質(zhì)提取中用到的優(yōu)良溶劑。IL可與植物中的某些化學(xué)成分進(jìn)行偶極-偶極相互作用、氫鍵作用及疏水作用等，因此，可用其對植物中的有效成分進(jìn)行提取和分離。研究表明，少量IL添加可提高乙醇/硫酸銨ATPS的分相能力及其對茶多酚的得率，咪唑型IL對提取茶多酚具有更好的促進(jìn)作用[7]。王剛等[8]優(yōu)化了微波輔助IL提取石上柏穗花杉雙黃酮工藝，最佳提取條件為：提取溶劑為2.0 mmol·L-1[C6MIM] [PF6]溶液，料液比1∶15 (g·mL-1)，微波功率500 W，提取時間39 min，提取溫度46 ℃。蘇適等[9]研究表明，黑豆異黃酮的最佳提取條件為IL濃度為0.75 mol·L-1、料液比1∶23 (g·mL-1)、提取溫度50 ℃、提取時間40 min，在此條件下黑豆異黃酮的提取率為0.419%?？梢娫谟肐L對植物中的有效成分進(jìn)行提取時，可提高有效成分的提取效率。

目前用綠色溶劑離子液體提取甘薯葉片多酚的研究鮮有報道。本研究以漯薯11號甘薯葉片為試驗材料，將離子液體與70%乙醇組成混合溶劑用于甘薯葉片多酚的提取，探究了最優(yōu)的離子液體類型和提取條件，為甘薯葉片多酚的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漯薯11號甘薯品種種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所試驗田(117°17.48′E，34°16.95′N)。沒食子酸對照品和離子液體(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；福林-酚顯色劑(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；無水乙醇等所有試劑均為國產(chǎn)分析純，水為蒸餾水。

1.2 主要儀器

UV-2450紫外分光光度計(日本島津公司)；ALPHA1-4LD plus冷凍干燥儀(德國Christ公司)；DK-S26恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司)；JA3003電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；YP1002N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定參考劉麗香[10]的方法。多酚物質(zhì)的提取和測定參考衣申艷[11]的方法并進(jìn)行改進(jìn)：準(zhǔn)確稱取1.00 g葉片粉末至150 mL錐形瓶，加入IL-70%乙醇混合溶液，超聲條件下(50 ℃，功率為100 W)浸提，過濾，冷卻后離心(轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1)20 min，收集上清液定容至150 mL容量瓶中作為待測提取物。將待測溶液稀釋，精確吸取稀釋液0.2 mL，加入1.0 mL 10%(V/V)福林-酚溶液和2.8 mL 7.5%(m/V)碳酸鈉溶液，混合均勻后，在30 ℃水浴鍋中避光條件下反應(yīng)30 min，隨后立即測定760 nm處吸光度值，每個處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以3次以上結(jié)果的平均值表示，并采用SPSS 17.0軟件和Excel 2007軟件分析整理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL的篩選

2.1.1 不同類型IL對多酚提取率的影響

選擇4種不同類型的IL(吡咯烷類、咪唑類、吡啶類和哌啶類)：溴化N-丁基-N-甲基吡咯烷([BMPyrr]Br)(a)、溴化1-乙基-3-甲基咪唑([BMIM]Br)(b)、溴化1-乙基吡啶([EMIM]Br)(c)和溴化N-丁基-N-甲基哌啶([C4MPd]Br)(d)對多酚提取率的影響。由圖1可知，4種類型IL對多酚提取效果的影響大小順序為咪唑類>吡啶類>吡咯烷類>哌啶類。咪唑環(huán)陽離子相比其他3種類型IL，具有更高的多酚得率，這主要是由于咪唑環(huán)屬于芳香環(huán)，具有π電子，可以和多酚發(fā)生π-π電子共軛作用，此外咪唑環(huán)上含有2個N原子，與多酚組分形成的氫鍵作用更大[12]。

圖1 IL類型對多酚提取率的影響

2.1.2 不同陰離子型咪唑類IL對多酚提取率的影響

選用1-乙基-3-甲基咪唑為陽離子，考察4種不同類型的陰離子IL：溴化1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM]Br)(b)、硫酸乙酯1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM]Es)(e)、碘化1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM]I)(f)、醋酸1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM]Ac)(g)對多酚提取率的影響。如圖2所示，[EMIM]Br對多酚的提取效果最好，可能原因是[EMIM]Br與乙醇分子之間的強(qiáng)作用力使得IL溶液能有效滲透到植物細(xì)胞中，從而提高了多酚的溶解度。

圖2 陰離子類型對多酚提取率的影響

2.1.3 不同陽離子類型IL對多酚提取率的影響

選用溴離子為陰離子，考察4種不同鏈長的咪唑陽離子溴鹽：1-乙基3-甲基咪唑離子([EMIM]Br)(b)、1-丁基3-甲基咪唑離子([BMIM]Br)(h)、1-己基3-甲基咪唑離子([HMIM]Br)(i)、1-辛基3-甲基咪唑離子([OMIM]Br)(j)對多酚提取率的影響。如圖3所示，隨著陽離子烷基鏈長度從乙基增大到丁基，多酚提取率呈現(xiàn)升高趨勢，這可能是由于IL對多酚的氫鍵作用和疏水作用逐漸增強(qiáng)；當(dāng)陽離子鏈長從丁基增大到辛基時，提取率逐漸下降，這可能是由于IL的黏度增加，導(dǎo)致其溶劑化作用減弱；同時IL分子鏈長度增加導(dǎo)致空間位阻增加，使得IL分子與多酚化合物之間的接觸減少。另外，碳鏈長度越長，離子液體的極性越小，在提取天然藥物有效成分時，應(yīng)根據(jù)相似相溶原理選擇合適的離子液體。

圖3 陽離子類型對多酚提取率的影響

綜合以上實(shí)驗結(jié)果，可確定對甘薯葉片中多酚物質(zhì)提取效果最佳的IL為[BMIM]Br，并選擇該IL進(jìn)一步做單因素考察。

2.2 單因素實(shí)驗

2.2.1 離子液體濃度的影響

IL濃度是影響植物有效成分提取率的主要因素，為尋找最佳IL濃度，考察了一系列不同的IL濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L-1)對多酚提取率的影響。

圖4所示，當(dāng)IL濃度逐漸增大時，多酚提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，IL濃度在0.4 mol·L-1時多酚提取率最高。隨著IL濃度增加，IL的黏度增加導(dǎo)致IL溶液的擴(kuò)散能力降低，IL溶液較難滲透到植物細(xì)胞組織中，而不能充分地從植物中提取目標(biāo)化合物[13]。

圖4 IL濃度對多酚提取率的影響

2.2.2 提取時間的影響

本次研究在其他參數(shù)不變的情況下，考察了提取時間(10、20、30、40、50、60 min)對多酚提取率的影響。由圖5可知，隨提取時間的不斷增長，多酚提取率呈現(xiàn)增長趨勢，說明超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)能在較短的時間內(nèi)破碎植物細(xì)胞，使得位于細(xì)胞間和細(xì)胞壁的多酚溶解出來[14]。當(dāng)提取時間為40 min時，提取率達(dá)到最大值，但時間超過40 min，提取率開始降低。其原因可能是隨著處理時間的延長，植物組織細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及黏性物質(zhì)等混入提取液中，使溶液中雜質(zhì)增多，黏度增大，從而增加了傳質(zhì)阻力，影響多酚成分的溶出。因此，提取時間選擇40 min。

圖5 提取時間對多酚提取率的影響

2.2.3 料液比的影響

溶劑與原料的比率是影響多酚提取效果的關(guān)鍵因素，改變料液比可改變?nèi)軇┖驮现g的接觸面積。本研究設(shè)定的料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g·mL-1，圖6所示，隨著料液比的增加，多酚提取率呈上升趨勢并在1∶40 g·mL-1時達(dá)到最高，隨后下降?？赡茉蚴钱?dāng)料液比過大時，葉片內(nèi)部脂溶性物質(zhì)會更多地溶出，而與多酚類物質(zhì)產(chǎn)生競爭[15]。因此，合適的料液比選擇為1∶40 g·mL-1進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖6 料液比對多酚提取率的影響

2.3 離子液體的回收

先將提取物用熱水100 mL溶解，用等體積的乙酸乙酯萃取3次；合并萃取后的離子液體水溶液，減壓濃縮得到離子液體[BMIM]Br，將其在60 ℃下真空干燥至恒重即可。

3 小結(jié)

考察了不同IL類型(包括不同陰離子和陽離子IL)對甘薯葉片中多酚提取率的影響，得出最佳的IL為[BMIM]Br；通過考察IL濃度、提取時間、料液比對甘薯葉片多酚提取率的影響，得出最佳的提取條件為[BMIM]Br濃度為0.4 mol·L-1、提取時間為40 min、料液比為1∶40 g·mL-1。在最優(yōu)條件下多酚的提取率為55.614 mg·g-1，高于常規(guī)方法47.577 mg·g-1[16]。離子液體種類多、結(jié)構(gòu)雜，其他不同結(jié)構(gòu)組成離子液體對多酚得率及其影響機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。