微囊化胰島移植優(yōu)化策略研究進展

李萬里 豐丙政 楊玉偉 吳玲玲 顧姍姍 蔣鵬 陳繼冰 高宏君

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）在全球4.15億糖尿病患者中約占10%[1]，其特征為胰島素絕對缺乏。除常規(guī)胰島素治療外，胰島移植是目前唯一可能的替代療法，可長期穩(wěn)定地控制血糖。在胰島移植成為常規(guī)治療方法之前，需要克服兩個主要障礙：長期應用免疫抑制劑導致的不良反應和胰島細胞來源不足。為此，微囊化胰島移植技術應運而生，該技術旨在通過將移植胰島包封在半透性的微囊中作為機械屏障，實現(xiàn)移植胰島與宿主分離，保護移植胰島免受免疫細胞以及抗體介導的排斥反應損傷。以微囊化技術產(chǎn)生的免疫保護使得胰島在無需使用免疫抑制劑時即可進行移植，并可使用動物作為供體來源。盡管在動物研究中取得了一些令人鼓舞的成果，但免疫保護性移植物存活期仍較短，無法將該技術引入臨床實踐。因此，近年來關于如何提高微囊化胰島移植效果的研究有所增加，干細胞在微囊化胰島移植中的應用研究也逐步成為熱點。因此，本文從影響微囊化胰島移植技術應用的幾個關鍵因素及干細胞在微囊化胰島移植中的應用進行綜述，以期為微囊化技術在胰島移植中的成功應用提供參考。

1 微囊化胰島移植的優(yōu)化策略

微囊化胰島移植的成功率可從多個角度提高，如通過微囊裝置產(chǎn)生長期的免疫隔離、調節(jié)或降低移植物周圍免疫反應、提高材料的生物相容性、選擇合適的移植部位、促進移植物周圍氧氣和營養(yǎng)物質供應等方式，均可提高移植效果[2]，且各方式相輔相成，互相聯(lián)系。

1.1 免疫隔離和免疫保護

在供體細胞和受體免疫細胞之間提供長期免疫屏障是理想胰島封裝材料的首要標準[2]。海藻酸鹽（alginate，ALG）是目前微囊化胰島移植研究中使用最廣泛的材料[3]，其最重要的特征是可與多價陽離子選擇性結合，形成ALG凝膠珠。但ALG缺乏明顯的滲透選擇性，不能實現(xiàn)包封胰島的免疫隔離，因此需要用氨基酸聚合物如多聚-L-賴氨酸，對ALG微球進行常規(guī)的滲透選擇性包封[4]。半透的多聚-L-賴氨酸層能有效地阻止免疫系統(tǒng)的大細胞和抗體進入，同時允許胰島素、葡萄糖和營養(yǎng)物質通過[5]。

微囊對移植胰島提供的保護作用有限，不能維持胰島的長期存活。CXC趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）12可阻擋效應性T細胞，用CXCL12包封供體胰島可誘導局部免疫隔離，并在無系統(tǒng)性免疫抑制的情況下保護異種移植物的功能[6]。在糖尿病小鼠模型中，細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4免疫球蛋白（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4-immunoglobulin，CTLA4-Ig）、抗CD154單抗和囊內CXCL12的三聯(lián)療法可保護成年豬的移植胰島，減輕免疫損傷[7]。近年來，兩親性多肽（peptide amphiphile，PA）納米基質凝膠也被用于免疫隔離。PA可與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組裝形成納米基質凝膠，模擬胰島培養(yǎng)微環(huán)境和半透性免疫屏障，改善胰島在炎癥狀態(tài)下的功能，延長胰島存活時間，從而提高胰島移植的成功率和療效[8]。抗體積膨脹和壓縮變形能力的混合結構具有更好的形狀恢復性和長期回彈性，有望在沒有慢性免疫抑制的情況下實現(xiàn)長期糖尿病逆轉。用共價連接的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）加強ALG水凝膠的離子凝膠網(wǎng)絡，可以產(chǎn)生具有理想力學性能的雜化結構，且PEG-ALG網(wǎng)絡在微尺度表面變形和小振幅剪切過程中表現(xiàn)出與ALG相似的滲透率，表明混合聚合物免疫隔離裝置在體內的成功應用[9]。為了使微囊具有薄而穩(wěn)定的聚合物膜，Toda等[10]使用PEG偶聯(lián)磷脂和多層PEG膜進行細胞微囊化，發(fā)現(xiàn)由四臂PEG（相對分子質量為40）-馬來酰亞胺制成的聚合物膜在細胞表面具有最高的穩(wěn)定性，且不干擾胰島β細胞分泌胰島素。Mridha等[11]也描述了一種基于聚己內酯支架的3D生物打印裝置，該裝置包含免疫隔離微囊，當植入免疫功能正常的同種異體糖尿病小鼠皮下時，在不需要免疫抑制劑的情況下，小鼠血糖水平可以維持正?；辽?個月。以上內容表明通過不同形式的微囊化，可實現(xiàn)移植胰島免疫隔離和免疫保護，最終可實現(xiàn)T1DM微囊化胰島移植療法，通過進一步改進設計可實現(xiàn)更佳的效果。

1.2 材料的生物相容性

目前微囊化胰島移植技術的應用受到囊化材料生物相容性不足的限制，ALG的純度、組成和微囊完整性等因素都可能導致微囊發(fā)生異物反應及囊周纖維化。除研究最多的ALG外，一些其它的生物材料也逐漸被科研人員們所關注，并表現(xiàn)出一些優(yōu)良的特性。

1.2.1 ALG的純度 適當純化可改善ALG的生物相容性，與使用ALG粗品生產(chǎn)的微囊相比，使用純化ALG生產(chǎn)的微囊可大大減少囊周纖維化。臨床級商品化的ALG都會被純化去除內毒素，以確?？晒┤祟惏踩褂肹4]。為減輕免疫反應，依靠超純的聚合物是必不可少的，單體、催化劑和引發(fā)劑等多種存在于其中的雜質都可能表現(xiàn)出不利的生物學活性，導致封裝的胰島移植物失效。70%～90%的雜質可以通過電泳、Klock或改良的Klock萃取純化除去[12]，純化顯著減輕了ALG引起的炎癥反應。此外，已研究出化學修飾的ALG，進一步提高了ALG的生物相容性。有研究使用一種共價化學修飾的組合方法來創(chuàng)建ALG變異體的文庫，發(fā)現(xiàn)3種含有三氮唑的類似物可減少嚙齒類動物和非人靈長類動物的異物反應，三氮唑可使ALG產(chǎn)生一種新的水凝膠表面，抑制巨噬細胞的識別[13]。值得一提的是，純化還需重點考慮ALG的黏度以及分子量，純化時可盡量去除低分子量成分來增強ALG黏度，從而提高微囊的生物相容性[14]。

1.2.2 ALG的組成 ALG是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸通過β-1，4-糖苷鍵連接成的天然多糖。制備的微囊中，古洛糖醛酸相比甘露糖醛酸占更高比例時，微囊具有更好的穩(wěn)定性及更佳的生物相容性[15]。有學者表示，往Biodritin（一種以ALG為基礎的材料）中添加單一成分如層粘連蛋白不僅不會干擾微囊的穩(wěn)定性及生物相容性，還會促進胰島素的釋放[16]。Harrington等[17]開發(fā)了一種新型、無細胞毒性、非乳化的方法來生產(chǎn)與多種材料相容的水凝膠微囊，稱為核-殼球化（core-shell spherification，CSS），即以透明質酸和PEG二丙烯酸酯（PEG diacrylate，PEGDA）兩種水凝膠為原料制備微囊。在糖尿病小鼠腹腔注射聚PEGDA微囊化犬胰島，可逆轉糖尿?。ㄩL達16周）；注射甲基丙烯酸酯化透明質酸微囊化犬胰島，可恢復正常血糖（3～4周）?？傊?，CSS提供了一種無毒的微囊化工藝，可與各種水凝膠類型兼容。

1.2.3 微嚢的完整性 移植微囊缺乏完整性是導致囊周纖維化及移植物丟失的主要原因。囊膜不穩(wěn)定造成的破裂和囊膜表面的物理性不規(guī)則都會使微囊的完整性受到破壞。此外，趨化作用也起到了關鍵作用，在異種移植中，異種抗原的釋放，特別是β-1，3-半乳糖的釋放，可吸引并激活巨噬細胞，釋放的白細胞介素（interleukin，IL）-1β、干擾素（interferon，IFN）-γ 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-γ等細胞因子以及一氧化氮和氧自由基，可通過微囊的半透膜，影響移植物的功能和活力。改善微囊的生物相容性以減少囊周纖維化是微囊化胰島移植成功的關鍵。含PEG的雷帕霉素包衣（rapamycincontaining PEG，Rapa-PEG）涂層能有效地抑制巨噬細胞的增殖，可能是提高異種胰島微囊生物相容性的有效方法[18]。但PEG涂層可能不夠牢固，采用過強的交聯(lián)方法又可能會干擾雷帕霉素的釋放，因此，還需更進一步的研究。Alagpulinsa等[19]發(fā)現(xiàn)在未使用免疫抑制劑時，與CXCL12共包封的人多能干細胞（human pluripotent stem cell，hPSC）生成的功能性β細胞可避免囊周纖維化，在較長時間內（>150 d）控制小鼠血糖。Farah等[20]發(fā)現(xiàn)將集落刺激因子1受體抑制劑GW2580植入人體胰島微囊系統(tǒng)、基于電極的連續(xù)血糖監(jiān)測設備和肌肉刺激設備，可抑制囊周纖維化，改善移植物功能。體外實驗證實包封己酮可可堿的ALG微囊可改善囊周纖維化和胰島活性[21]。微囊的地塞米松21-磷酸涂層可明顯抑制微囊化異種胰島移植后囊周纖維化，對胰島的功能和存活無不良影響；體內外實驗均證實葡聚糖包封的ALG微囊保存了胰島功能，減少了囊周纖維化和炎癥細胞浸潤[22]。

1.2.4 其他材料 除ALG外，研究人員正試圖尋求一些替代材料來改善微囊性能，如瓊脂糖、纖維素、殼聚糖、聚氨酯、聚丙烯酸酯、PEG等。瓊脂糖是從紅藻細胞壁中提取的一種線狀多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，在特定溫度下可實現(xiàn)溶膠-凝膠轉變。瓊脂糖水凝膠由于其獨特的易于改性及熱性能，提高了微囊化胰島移植的成功率。然而，瓊脂糖在移植后隨著時間的推移表現(xiàn)出一些不穩(wěn)定性，一定程度上限制了其耐久性[3]。纖維素在自然界中存量豐富，其免疫原性較低，且不能在人體中降解。臨床前研究證實了纖維素包封可促進胰島的存活，有關方面的進一步研究將有助于闡明纖維素在封裝策略中的作用[23]。殼聚糖分子量高，生物降解性及生物相容性好。使用殼聚糖水凝膠作為免疫隔離基質可以保護微囊化的胰島細胞免受免疫反應，并在異種胰島移植中對包封胰島具有良好的保護作用[24]。聚氨酯具有良好的生物相容性，可大量制備，經(jīng)過特定修飾可表現(xiàn)出更佳優(yōu)良的包囊特性[23]。Liu等[25]提出了一種聚合物主鏈含有磺基甜菜堿的兩性離子型聚氨酯，可通過靜電紡絲制備成具有可調納米孔結構的胰島封裝裝置，其具有強大的機械性能，且在移植到小鼠腹腔后引起的異物反應較輕。聚丙烯酸酯是不可生物降解的聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚丙烯腈和聚丙烯酰胺。通過以不同比例混合兩種或多種丙烯酸酯，可實現(xiàn)對物理性能的微調。聚丙烯酸酯在機械強度、滲透性、生物相容性和保持細胞活力等方面性能較好，但其用于胰島包封的研究并不多，還需開展進一步的研究[23]。PEG水凝膠以其良好的生物相容性被廣泛應用于胰島包封，已在動物模型中觀察到其可促進細胞存活[26]。然而，仍需進一步在大動物模型中驗證PEG水凝膠的耐久性[3]。另外，PEG末端的羥基可修飾成一系列的PEG衍生物，而修飾后的PEG衍生物具有更佳的包封性[24]。

1.3 移植部位

為使微囊化的胰島發(fā)揮正常功能，選擇理想的移植部位必不可少。目前，大多數(shù)胰島移植是通過肝門靜脈進行輸注，但肝臟可能不是微囊化胰島移植的最佳部位，由于微囊化后的胰島體積會增大，可能導致肝臟血管系統(tǒng)缺氧[27]，且存在出血或門靜脈血栓形成的風險[28]。皮下間隙和肌肉是目前臨床上較理想的植入部位。多項臨床前和臨床研究正在進行，以優(yōu)化胰島移植的位置[29]。目前，還沒有臨床研究評估微囊化胰島移植到肌內部位的效果[23]。與肝門靜脈移植相比，肌內移植相對簡單，并發(fā)癥少[2]，但低血氧可能影響胰島存活。腎被膜是嚙齒類動物胰島移植的常選部位，但微囊化的胰島體積增大，阻礙了腎被膜作為植入部位的潛在適用性。腹膜腔是目前用于測試新型包封策略或裝置的常用植入部位，但植入包封胰島后的異物反應和纖維化反應相比于皮下間隙和腎被膜等部位明顯較高[23]。大網(wǎng)膜也是一個潛在移植部位，高度血管化的結構、較大的表面積以及承載大量胰島的能力使其成為微囊化胰島移植的理想場所。但與其他部位相比，大網(wǎng)膜移植更具侵入性，不能接受多次移植，因此，其安全性、有效性及適用性還需進一步驗證[30]?？偠灾?，需綜合考量微囊化胰島的大小、數(shù)量等多種因素，以選擇合適的部位。

1.4 氧氣和營養(yǎng)物質供應

胰島具有高度的代謝活性，需要大量的氧氣及營養(yǎng)物質來維持正常功能。由于微囊的存在，胰島氧氣及營養(yǎng)物質供應均受到影響，大量的胰島細胞因不可逆的慢性低氧應激及營養(yǎng)不足，發(fā)生細胞壞死或凋亡，成為微囊化胰島移植技術臨床應用的主要障礙之一[31]。因此，采取有效的策略來改善胰島周圍氧氣和營養(yǎng)物質的供應對胰島發(fā)揮正常生理功能至關重要。有團隊研究了低氧對游離和微囊化成年豬胰島在培養(yǎng)6 d過程中存活率、代謝活性的影響，證實在缺氧條件下，游離和封裝的胰島代謝活性都有下降趨勢，但游離胰島在6 d時出現(xiàn)大量細胞死亡，而微囊封裝顯著改善了胰島的存活[32]。過碳酸鈉和過氧化鈣可作為胰島潛在的補充氧源。Mcquilling等[33]研究表明過碳酸鈉或過氧化鈣等產(chǎn)氧材料可為游離胰島和封裝胰島補充氧氣，提高移植胰島的活性。

胰島微囊化過程中無法控制微囊的大小、形狀及微結構的一致性[34]，導致營養(yǎng)物質供應存在明顯的差異化。盡管ALG微囊化技術在嚙齒類動物中取得了成功，但由于微囊尺寸大，營養(yǎng)物質在腹腔內的擴散不理想，阻礙了ALG微囊向大型動物和人類應用的轉化。因此，近年來的研究旨在降低包膜厚度增加營養(yǎng)物質供應，同時維持被包封胰島的免疫保護能力[35]。Weaver等[26]開發(fā)了一種微流控封裝系統(tǒng)，該系統(tǒng)可合成直徑較小的PEG微囊。相較于ALG微囊，PEG微囊可更好地改善封裝胰島的胰島素反應性，并允許在血管化的組織空間移植，減少移植胰島的質量和體積。通過血管生成載體將PEG包裹的胰島移植到一個孤立的、可回收的、高度血管化的部位，證明單個胰腺供體的同基因胰島塊比傳統(tǒng)的ALG微囊具有更好的長期功能，并可與移植部位的血管系統(tǒng)緊密結合。有研究人員設計了非球形微囊化胰島樣微組織，并研究了幾何形狀對細胞活力的影響。發(fā)現(xiàn)與相同體積的桿狀和球狀微組織相比，環(huán)狀微組織具有更強的細胞活力和代謝活性，且環(huán)狀微組織可以維持大鼠胰島素瘤細胞特有的葡萄糖反應性和胰島素分泌能力。此外，環(huán)狀微組織在微囊化后，可保持幾何形狀和結構完整性[36]。

重建天然ECM可改善胰島周圍微環(huán)境，減少微囊內細胞死亡。ECM由膠原蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白、透明質酸等組成，可介導細胞間、細胞與基質間的相互作用，為細胞提供生理和機械支持。經(jīng)典ALG微囊提供的環(huán)境并不能模擬天然的ECM，胰島的生存會受到影響。一些ECM分子，如層粘連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白或Ⅳ型膠原蛋白，可與ALG結合獲得新的包封材料，促進微囊化細胞的生存能力并減少細胞凋亡。透明質酸是胰腺ECM的主要成分之一，與細胞黏附和活力變化有關。有實驗證明ALG和透明質酸混合微囊可提高被封裝胰島的活力，減少早期凋亡和膜損傷，保持穩(wěn)定的胰島素分泌功能，且不改變對葡萄糖刺激的反應[37]。有團隊研究出了一種基于ALG和ECM水凝膠復合材料互穿網(wǎng)絡的新型仿生胰島微囊材料，其可增強細胞與基質的相互作用，提高胰島細胞生長能力[38]。但無血管移植可能導致胰島活力喪失，其臨床應用仍需進一步的完善與驗證。

2 干細胞在微囊化胰島移植中的應用

供者短缺阻礙了胰島移植在全球范圍內的應用[38]。干細胞是一類既有自我更新能力，又有多分化潛能的細胞。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）和hPSC的應用可緩解胰島細胞來源不足的問題，其與微囊化技術的結合將有望進一步提高胰島移植的療效。

2.1 間充質干細胞

MSC是目前研究最多的干細胞，既可作為支持細胞保護現(xiàn)有的β細胞，又可作為新生β細胞的來源，如果其能夠完全分化成胰島素分泌細胞（insulinproducing cell，IPC），就可改善移植胰島的缺乏問題[27]。Ca?ibano-hernández等[39]已在三維 ALG 基質中完成了不同來源MSC向IPC的分化，發(fā)現(xiàn)與未分化的MSC相比，從胰腺來源的MSC分化的細胞產(chǎn)量最多。此外，ALG微囊基質中添加透明質酸可增加IPC的胰島素釋放。Jara等[40]發(fā)現(xiàn)從人體脂肪組織中提取的脂肪MSC可在體外有效分化為IPC和胰高血糖素分泌細胞（glucagon producing cell，GPC），將IPC、GPC聚集體用海藻酸鈉聚合物微凝膠進行微囊化處理，再經(jīng)Ba2+穩(wěn)定后，微凝膠更加穩(wěn)定，且對體外高葡萄糖和胰島素分泌具有較好的反應性。

人臍帶MSC（human umbilical cord MSC，hUCMSC）具有抗炎和免疫抑制的特性，人胰島源性祖細 胞（human pancreatic islet-derived progenitor cell，hIDC）可去分化，隨后再分化為IPC。Montanucci等[41]將海藻酸鈉微囊化的hUC-MSC/hIDC共移植到非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠中，觀察細胞產(chǎn)生和儲存激素的能力，隨后將其移植到新近發(fā)病的自發(fā)顯性糖尿病小鼠中，發(fā)現(xiàn)小鼠血糖水平下降，表明hUC-MSC、hIDC可能協(xié)同促進胰島素的產(chǎn)生，同時“凍結”自身免疫性疾病過程，逆轉免疫性糖尿病小鼠的高血糖。為改善移植部位低血管密度及減輕強烈的炎癥反應，有研究人員提出了一種名為CellSaics（一種三維結構，由MSC、新型生物可吸收材料、重組蛋白結合而成）的細胞移植技術，可增強血管誘導生成作用，并通過共移植增強胰島移植效果[42]。與此同時，Mochizuki等[43]證實MSC CellSaics（由MSC和被稱為MSC CellSaics的重組肽段組成的鑲嵌狀聚集體）可促進血管生成因子及抗炎因子的釋放，將共封裝的MSC CellSaics和大鼠胰島移植到糖尿病小鼠皮下，可促進血管生成因子分泌，增強胰島移植療效。MSC和由三肽Arg-Gly-Asp（RGD）組成的錨點對胰島細胞具有保護作用。Laporte等[44]研究證實，富含MSC和RGD-G的ALG微囊可提高胰島的體外存活率和功能。雖然MSC是異體細胞治療最有前景的來源[45]，但其在T1DM中的應用仍有較大爭議。到目前為止，無論是在體內還是在體外，都缺乏強有力的證據(jù)來支持MSC可以分化為功能性成熟細胞或胰島樣類器官的假設[27]。

2.2 人多能干細胞

hPSC是獲得胰島細胞的潛在來源，利用人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESC）和人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）定向分化胰島細胞已成為可能[46-48]。胚胎干細胞在體外培養(yǎng)中具有無限增殖、自我更新和多向分化的能力。近年來，已有研究成功地誘導胚胎干細胞分化為胰島前體細胞[49]。在移植過程中，胰島前體細胞可以進一步成熟為葡萄糖敏感的IPC，從而治療T1DM[24]。已有研究使用微囊裝置包裹hESC分化得到的成熟胰島細胞，發(fā)現(xiàn)將其移植到小鼠體內，可改善小鼠血糖水平，還可在一定程度上避開免疫系統(tǒng)攻擊[50-51]。

ALG微囊可促進hESC的存活和增殖，并在適當?shù)臈l件下使其分化為內胚層細胞。微囊化技術可用于移植多能干細胞來源的細胞，這些細胞具有更強的激素合成能力和免疫保護特性[52]。一些臨床試驗也在進行中，美國ViaCyte公司開發(fā)了PEC-Encap、PECDirect等多個產(chǎn)品，PEC-Encap、PEC-Direct的核心都是PEC-01細胞（由hESC定向分化的胰腺內胚層祖細胞），植入體內后可分化為IPC，從而分泌胰島素并調節(jié)血糖。已有研究證明PEC-Encap安全性和耐受性良好，可分化為IPC。2020年8月，ViaCyte公司簽署了一項協(xié)議，將開發(fā)改良版PEC-Encap，有可能在無需使用免疫抑制劑的同時仍允許血管形成[27]。2021年2月，ViaCyte宣布啟動針對T1DM患者的封裝細胞療法的2期研究，旨在評估ViaCyte封裝細胞治療候選藥物（VC01-103）在T1DM患者中的安全性和有效性（NCT04678557）[1,53]。盡管hiPSC是hESC的潛在替代品，體外研究已證明hiPSC能夠分化為胰島β細胞[54]，但其分化為成熟胰島內分泌細胞的能力尚未達到hESC的同等質量[27]。

干細胞替代療法雖在一定程度上克服了胰島來源不足的障礙，但仍存在排斥反應等問題[27]。一些免疫保護策略，如將hESC衍生的胰島細胞與宏包封裝置和微包封技術相結合等各種有關方案都需繼續(xù)研究，來平衡免疫保護的必要性和血管化的需要。

3 小 結

綜上所述，多種策略已被用于改善胰島微囊化技術和提高胰島移植后的存活率。增強微囊免疫隔離及保護作用，提高微囊化材料的生物相容性，選擇合適的移植部位，強化氧氣和營養(yǎng)物質的供應及干細胞和微囊化技術的聯(lián)合應用等均可提高移植胰島的性能。但微囊化胰島移植的臨床療效仍有待觀察，將何種策略與微囊結合才可建立一種簡單安全有效的胰島移植方法，還需進一步的深入研究。