生物3D打印在器官再造中的前沿熱點和研究進展

黃文華

3D打印技術誕生于20世紀80年代，最早稱為快速成型技術，現(xiàn)歸類為增材制造技術。3D打印技術發(fā)展至今已衍生出多種打印工藝，并擴展至眾多行業(yè)領域，產(chǎn)生了重要的應用價值。目前3D打印技術在醫(yī)學領域多個方面的應用已經(jīng)日趨成熟，但在再生醫(yī)學、器官移植方面的應用仍處于研發(fā)和探索階段，距離實際臨床應用還有一段距離[1-3]。本文就生物3D打印技術在器官再造領域的前沿動態(tài)、熱點和難點進行介紹。

1 3D打印技術的醫(yī)學應用

3D打印技術是一種制造技術，基于三維數(shù)字模型切片后的路徑規(guī)劃參數(shù)，采用可粘合材料通過3D打印機按規(guī)劃路徑進行逐層打印，制造出立體產(chǎn)品。3D打印設備的種類通?；诓煌?D打印工藝進行劃分，最初問世的3D打印工藝是光固化立體成型（stereolithography，SLA），通過紫外光誘導光敏樹脂交聯(lián)進行逐層打印，而后選擇性激光燒結（selective laser sintering，SLS）、立體噴墨打印（3D printing，3DP）、熔融沉積成型（fused deposition modelling，F(xiàn)DM）、 數(shù) 字 光 處 理（digital optical processing，DLP）等多種工藝陸續(xù)問世[4-7]。

模型、器械3D打印的臨床應用已較為成熟。基于影像數(shù)據(jù)重建后的三維數(shù)字模型可以作為打印和計算機輔助設計的模板，為3D打印的醫(yī)學應用提供了技術基礎[8]。3D打印的醫(yī)學應用最早是制作病例模型、手術導板，之后擴展至個性化康復支具的制造，多基于FDM和SLA工藝，采用人工高分子材料進行制作[4,7]。類似應用已經(jīng)較為成熟，部分3D打印服務和產(chǎn)品也已納入醫(yī)保。近年來，3D打印的鈦合金材質三類醫(yī)療器械也陸續(xù)問世并投入生產(chǎn)，且隨著個性化定制醫(yī)療器械的相關產(chǎn)品標準逐步完善，該領域的臨床應用將不斷增多[9]。

具有生物活性的植入物是當下3D打印研究領域的熱點。利用3D打印技術制造人工組織可以修復組織創(chuàng)傷、重建組織功能，但目前多處于實驗室研究階段，少數(shù)研究進展到了臨床試驗階段。在目前的研究階段，通常將生物材料、干細胞、生長因子復合制成組織工程化制品[10]，3D打印技術在其中的作用是作為構建個性化仿生結構的制造技術。目前細胞和生物活性成分與生物材料的結合方式包括表面黏附和內部包載，早期因打印工藝和設備的缺乏，應用較廣泛的是表面黏附，采用熱塑性的高分子材料如聚乳酸、聚己內酯等，通過FDM工藝制作成多孔支架，再經(jīng)支架或細胞共培養(yǎng)促進細胞和生長因子黏附，用于組織移植修復。近年來，隨著對細胞無損的直寫成型、DLP等工藝的3D打印設備普及，采用水凝膠包載細胞進行生物3D打印成為新的研發(fā)熱點，可在保證細胞存活率的同時簡化共培養(yǎng)步驟，提供更貼近組織生長速率的材料降解速度[2,11]。除此之外，也有研究者嘗試直接在組織損傷創(chuàng)面上進行原位生物3D打印修復[12]。

3D打印技術在器官再造領域的未來發(fā)展目標是完全采用細胞成分進行3D打印，構建形態(tài)仿生、功能仿生的人工器官，并向多器官再造方向發(fā)展。器官是由多種不同類型組織發(fā)育分化并且互相結合構成，具有特定的形態(tài)和生理功能，生物3D打印從組織打印向器官打印過渡仍需一段時間的發(fā)展及基礎研究領域的不斷深入。

2 生物3D打印器官的研究進展

生物3D打印經(jīng)過最近十年的迅猛發(fā)展，取得了眾多里程碑式的成果。作為生物3D打印概念的早期驗證，人耳廓形態(tài)軟骨裸鼠模型早在1997年已被提出。上海交通大學曹誼林教授成功為5例患有先天性小耳畸形的兒童移植了定制化打印的耳狀軟骨，經(jīng)過兩年半的隨訪，3D打印耳形態(tài)與正常耳基本一致[13]。這項臨床試驗研究成功在體外培養(yǎng)人耳狀軟骨并進行移植，彰顯了3D打印器官未來應用的巨大潛力。

相較于3D打印硬組織已經(jīng)快速地應用于臨床治療中，3D打印軟組織器官的發(fā)展則較為曲折，真正的人體器官是由多種不同細胞及細胞亞群組成，器官中除了功能細胞還具有大量的血管、神經(jīng)等結構。因此，多組織協(xié)同打印是目前實現(xiàn)器官復雜功能的一種策略。在生物3D打印人工器官的血管網(wǎng)絡構建方面，美國Organovo公司研究人員打印了肝臟細胞與血管內皮細胞逐層交替的微型肝臟補片，其微血管吻合良好，血液可以從周圍的肝臟組織運輸?shù)礁闻K補片中，維持3D打印器官的功能，這項研究標志著移植3D打印器官促進血管再生吻合的可能性。

生物3D打印人工器官的形態(tài)仿生方面近年來取得重要進展。Noor等[14]采用來源于患者脂肪組織干細胞構建的誘導多能干細胞，混合細胞外基質、膠原蛋白等成分制成生物墨水，構建出具有心房、心室、主要血管的微型心臟。因為生物墨水主要成分來源于患者自體細胞，該人工器官可以匹配患者自身的免疫、細胞、生化特征。

生物3D打印人工器官的功能仿生同樣取得重要突破。在心臟的生物3D打印方面，Jallerat等[15]構建了一種打印膠原蛋白內外壁，中間打印心肌細胞的新型生物3D打印方式，構建了左心室和心臟瓣膜模型，經(jīng)過體外培養(yǎng)后，該組織模型可以產(chǎn)生自發(fā)搏動功能。在肺泡的生物3D打印方面，Grigoryan等[16]構建了具有與人體血管、氣管結構相同的網(wǎng)絡結構的3D打印肺，能夠像正常肺部一樣輸送氧氣，進行“呼吸”這一生理過程。

面對近年來新型冠狀病毒（SARS-CoV2）肺炎疫情的爆發(fā)，對于免疫系統(tǒng)的3D打印器官的研究也逐步加快。Ramaswamy等[17]團隊合成了一個完整的功能性免疫系統(tǒng)，其構建的3D打印淋巴結具有完整的合成系統(tǒng)，可以迅速產(chǎn)生大量SARS-CoV2抗體，應對病毒感染。

目前器官再造的生物3D打印已經(jīng)從單一成分打印向多種成分打印發(fā)展；從單一組織向多組織協(xié)同打印發(fā)展；從無響應性向刺激響應性發(fā)展。目前的生物3D打印在器官再造領域中，正從組織打印向類器官打印方向邁進，未來將進一步向完整器官打印邁進。回顧近年來的每一次3D打印器官技術的突破，我們有理由相信3D打印器官距離移植到人體已經(jīng)不再遙遠。

3 生物3D打印使器官再造迎來新的機遇

生物3D打印相關研究在最近十年迎來迅猛增長。2015年之前，3D打印相關的研究論文發(fā)表數(shù)量為2 400余篇，2015年至2021年，發(fā)文量上升至近16 000篇，并且呈現(xiàn)出與材料科學、納米科學、放射學核醫(yī)學、生物技術應用等多學科的交叉融合[18]。在轉化應用方面，生物3D打印的多家知名設備公司和打印服務供應商都在積極布局生物3D打印設備與組織器官再造的研究，市場規(guī)模的年復合增長率>20%，已有多項3D打印組織工程制品臨床研究正在進行。

3.1 工藝技術優(yōu)勢有望實現(xiàn)器官再造

科研領域和產(chǎn)業(yè)領域都將生物3D打印技術視為器官再造的重要技術手段，得益于技術本身的工藝和原理[19]。首先，分層打印、逐層疊加的工藝特點使3D打印技術易于構建三維立體結構。在細胞層面上，3D打印提供的三維培養(yǎng)環(huán)境較培養(yǎng)皿中的二維培養(yǎng)方式要更加接近體內的立體環(huán)境，細胞在體外培養(yǎng)如果缺乏空間上的細胞間和細胞與基質間相互作用，其細胞表型、增殖分化活動、代謝活動將與體內培養(yǎng)環(huán)境存在巨大差異[20]。

其次，三維數(shù)字模型等比例重建和設計修改便捷特點使3D打印技術易于進行個性化定制。3D打印技術在設計、打印、后處理等環(huán)節(jié)的可操控性高，適合進行少量產(chǎn)品的定制生產(chǎn)。因此，以缺損組織或損傷器官的形態(tài)作為打印模板，采用來源于患者的細胞進行生物3D打印，有望獲得精準匹配且無免疫原性的人工器官[21]。

再者，對細胞無損、多材料、多通道的生物3D打印有望實現(xiàn)多組織器官的構建。組織層面上，器官中特定組織的特異性分布是器官發(fā)揮生理學功能的先決條件，3D打印可控的立體結構制造恰好為多組織構建提供了可能。目前的生物3D打印機多采用氣壓或機械驅動的直寫成型式打印工藝，避免了長時間紫外光交聯(lián)、高溫熔融、激光熔融等會引起生物活性成分失活的工藝技術?，F(xiàn)有的生物3D打印設備已經(jīng)可以實現(xiàn)打印后細胞存活率>90%，并能適配多料倉、多材料打印方式。隨著工藝技術的開發(fā)，有望實現(xiàn)組織層次的精確構建[22]。除此之外，利用可提取或合成的生物材料，以及可培養(yǎng)擴增的細胞作為原料進行3D打印，極大程度解決了器官移植的供者來源、供者配型及排斥反應問題[23]。

3.2 生物3D打印結合器官芯片助力器官再造

近年來，3D打印技術與其他技術的交叉融合也產(chǎn)生出多種新型設備、新興應用。如靜電紡絲技術結合生物3D打印技術用于構建微納米表面的組織修復支架，提高支架仿生程度和生物相容性；載細胞可注射微球結合生物3D打印技術形成高細胞載量、模塊化的生物墨水，用于制備功能化組織修復支架等。在器官再造方面，隨著對器官發(fā)育復雜調控基礎研究的不斷深入，催生出對類器官模型、器官芯片技術、生物3D打印技術相結合的前沿研究方向。

隨著微流控芯片技術的不斷發(fā)展，在芯片上構建仿生微器官來替代生物體研究和進行藥物評估等已成為構建未來新藥評價體系的重要發(fā)展趨勢。將3D打印技術在微組織構建和器官再造等方面的獨特優(yōu)勢與微流控芯片技術整合，從而實現(xiàn)對器官疾病機制的研究和相關藥物的開發(fā)與評估，是當前生物醫(yī)學領域研究中的一個重要方向[24]。器官芯片與傳統(tǒng)培養(yǎng)方式最大的不同在于其動態(tài)灌注的特性。

Zohar等[25]利用其團隊設計的高通量血管工程芯片，研究了液體灌注環(huán)境對于上皮細胞遷移和血管網(wǎng)絡生成之間的關系，發(fā)現(xiàn)在適宜的灌注條件下，血管的生成速度是靜止條件下的兩倍，證明了器官模型培養(yǎng)中動態(tài)灌注條件的重要性。器官芯片另一個優(yōu)勢在于芯片結構的設計可以精細到微米，以滿足某些細胞的特殊需求。Yamamoto等[26]利用3D打印制備了相互分離的雙腔培養(yǎng)體系（分為神經(jīng)培養(yǎng)腔和肌肉培養(yǎng)腔）和連接雙腔的微米級流道，通過精密控制的微小流道，引導神經(jīng)軸突從神經(jīng)培養(yǎng)腔長入肌肉培養(yǎng)腔，組成一個微小的神經(jīng)肌肉單元。由于神經(jīng)、肌肉獨立培養(yǎng)，解決了傳統(tǒng)肌肉神經(jīng)共培養(yǎng)下難以分開控制的缺點，證實了該微小神經(jīng)肌肉接頭單元有望實現(xiàn)重癥肌無力相關的藥物測試，為藥物篩選開辟了新的途徑。Lind等[27]利用3D打印技術，以多種材料混合作為墨水，通過巧妙的設計在芯片內構建了電阻傳感器，可根據(jù)電阻的變化推算心肌組織的收縮力，并用一種簡單的、可視化的、非侵入性的方式持續(xù)采集心肌組織的數(shù)據(jù)，該芯片可以用于心肌類藥物藥效的研究。

器官芯片發(fā)展迅速，憑借微流控平臺高精度、動態(tài)灌注、體積微小、高通量的特點，為類器官的培養(yǎng)提供了良好的條件，3D打印加持下的芯片流道設計也可以做到更加精巧。但作為器官芯片主體的“器官”部分卻還停留在2D或2.5D階段，大部分器官芯片只能做到單層的細胞培養(yǎng)。如何重現(xiàn)天然復雜的三維器官結構仍是制約器官芯片發(fā)展的關鍵因素，而立體三維結構的構造恰好是生物3D打印技術的優(yōu)勢，相信隨著生物3D打印技術的發(fā)展，問題也將迎刃而解。

4 生物3D打印在器官再造領域的難點與挑戰(zhàn)

以往有關生物3D打印器官的研究被大量報道，但尚未能構建出可進行體內移植的人工器官，其涉及材料、細胞、微環(huán)境、3D打印結構等多個方面，以下簡要總結生物3D打印在人工器官構建中的難點問題和重點問題。

4.1 生物3D打印器官的仿生結構

生物3D打印器官的生理功能與其三維結構密切相關，該三維結構需要從3個方面與人體組織進行匹配：（1）厘米尺度上人工器官的形態(tài)需要與解剖學形態(tài)匹配；（2）微米尺度上人工器官的多孔結構需要與組織、細胞生長需求匹配；（3）亞微米尺度上人工器官的材料表面形貌需要與細胞生長、分化需求匹配。前兩者可以通過3D打印切片程序進行調控，后者需要結合工藝制備技術實現(xiàn)。

微米尺度的多孔結構方面，生物3D打印研究最常用的三維結構是0°和90°交替排列的“田字形”網(wǎng)格結構，該結構打印的路徑規(guī)劃簡單、成型難度低，可有效為細胞提供黏附生長空間，為物質交換提供連通的孔道，為組織長入提供空間。但隨著研究深入，蜂窩狀多孔結構、松質骨仿生結構等被陸續(xù)提出，并證實特定的仿生結構，在支架表面積、營養(yǎng)物質交換率、生物力學性質上可能優(yōu)于網(wǎng)格結構[28]。

亞微米尺度的材料表面形貌特征對細胞黏附、生長、分化具有重要影響。3D打印與靜電紡絲、相分離、微圖案化等技術方法相結合，可以在3D打印的微米級多孔結構基礎上，添加亞微米或納米級的纖維紋理。一方面，可促進細胞的定向排列生長，從而實現(xiàn)組織各向異性的仿生誘導，構建出器官的組織仿生層次[29]；另一方面，亞微米尺度的纖維紋理可引起細胞骨架、整合素重排，影響細胞的黏附、遷移，以及某些特定的定向分化功能。在功能仿生方面，也有仿生分層結構模擬自然界超疏水表面和不同顏色偏振的應用，實現(xiàn)變色和光學傳感功能；仿生結構結合響應性材料，可構建條件響應的功能化器官[30]。

仿生結構不是單純意義上對天然器官形態(tài)的仿生模擬，而是對器官功能構建相關結構特征的仿生。仿生結構的探索需要充分結合體內外研究，篩選適宜器官再造的結構參數(shù)條件，如對細胞分化有利的微孔形狀、對營養(yǎng)物質交換有利的孔隙率等。

4.2 生物3D打印器官的功能構建

生物3D打印器官的構建難點，在于維持人工器官的存活和運作。為了維持人工器官的生物活性，需要實現(xiàn)器官的氧氣和營養(yǎng)物質交換功能，因此血管化必不可少。有研究對多層組織進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)如果組織結構的厚度>500 μm，則無法通過單純的物質擴散來為細胞供給營養(yǎng)，需要血管網(wǎng)絡[31]。以往的研究工作發(fā)現(xiàn)，體內環(huán)境會誘發(fā)血管新生長入移植的人工組織中，但其生長速率和血管網(wǎng)絡形態(tài)是不可控且不理想的[32]。相比較下，來源于供者的移植器官由于保留了血管組織，血管吻合后即可恢復血供，體現(xiàn)出構建的人工器官和天然器官在形態(tài)和功能上仍存在較大差距。目前，已有多種方法可實現(xiàn)生物3D打印器官的血管化：（1）3D打印犧牲材料預留血管通道[33]。在人工器官制備時去除犧牲材料從而預留出血管通道，并采用共培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)的方法誘導內皮細胞形成血管樣組織，該方法有效建立了氣管內部的血管網(wǎng)絡，但對于復雜走形和細末分支的血管構建存在困難。（2）同軸3D打印制作中空結構血管樣通道[31]。同軸打印可構建核、殼層結構兩種材料，或是內層中空的結構，該方法構建的器官血管網(wǎng)絡分布廣泛且均勻，但對于血管分支構建存在困難。（3）體外及體內的預血管化培養(yǎng)[34]。打印完成的人工器官，在灌流裝置中誘導內皮細胞形成血管網(wǎng)絡，或是暫時移植于受體皮下進行血管化誘導。（4）生物因素調控血管新生。在生物墨水體系中加入血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），促進血管生成。上述生物3D打印器官血管化策略旨在通過血管網(wǎng)絡的構建提高人工器官的生物活性，維持其存活，但對于器官移植手術的血管吻合，則需要生物3D打印的多組織構建。

為了滿足移植需要并實現(xiàn)器官的生理功能，需要多細胞協(xié)同打印，且特定器官需實現(xiàn)特定的生理功能?，F(xiàn)階段生物3D打印多利用單一功能的細胞作為生物活性成分，然而器官作為多種組織結合構成的單位，包括了單種細胞無法模擬的復雜功能。有研究人員利用手術切除的部分肝臟，打印出了具備真正肝臟大部分功能的微型肝臟[35]。由此可見，要通過生物3D打印實現(xiàn)器官再造，需要多組織協(xié)同打印。在打印設備方面，目前通過多個打印料倉已經(jīng)可以實現(xiàn)多材料和多細胞打??；在組織層次構建方面，也可以通過路徑規(guī)劃實現(xiàn)分區(qū)打印，但是難點在于打印后的組織培養(yǎng)和功能重建。以心臟為例，心肌組織的組織形態(tài)具有多層、各向異性特點，需要調控三層心肌細胞按照內縱、中環(huán)、外斜的解剖結構生長，并且心肌組織需要血管組織的滋養(yǎng)，以及肌肉-神經(jīng)接頭以響應節(jié)律性搏動。對于心房心室結構的微型心臟打印、心肌-神經(jīng)接頭打印、各向異性心肌組織打印，目前只有單一研究的工作，未有多組織協(xié)同打印。生物3D打印的多細胞協(xié)同打印已經(jīng)引起了科研領域的重視和關注，有研究將腸道細胞、間充質干細胞、內皮細胞進行分層、分形狀打印，構建了多細胞、可響應分泌的類腸道組織，在多組織構建方面獲得重要突破[36]。

4.3 生物3D打印器官引起的免疫反應

器官移植受者的預后與其自身的免疫狀態(tài)密切相關[37]。為維持移植器官的長期存活與功能，大量的免疫抑制劑被應用于器官移植受者，以至于機體長期處于免疫抑制狀態(tài)，較大程度上增加了感染與癌變的風險[38]。在通過生物3D打印制作人工器官時，使用生物相容性良好的生物材料和自體來源的細胞，將有效降低排斥反應發(fā)生的可能，但仍存在多種潛在導致排斥反應的因素。

構建生物3D打印器官的原料需多方面考慮免疫反應的可能。與同種異體器官移植不同，生物材料的多樣性使其涉及的免疫反應更為復雜，但除了少數(shù)生物源性材料，一般不涉及嚴重的排斥反應[39]。其中，超急性排斥反應、急性排斥反應與移植器官表面抗原及人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）組織配型相關，而3D打印器官所用生物材料上一般不含有上述生物標志物，材料中所包含的種子細胞一般也是自體細胞，所以較少發(fā)生這兩類排斥反應。對于生物材料引起的免疫反應，以異物反應和慢性排斥反應較為常見，主要表現(xiàn)為急性期炎癥反應：巨噬細胞和中性粒細胞遷移并黏附于移植區(qū)域，大量的組胺、趨化因子、蛋白水解酶、活性氧釋放；而后進入慢性期，在干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）等促炎因子激活的M1型巨噬細胞的作用下，持續(xù)誘導肉芽組織生長和組織纖維化，導致移植器官的纖維化、瘢痕化[40]。另一方面，生物材料的降解速率和降解產(chǎn)物需與組織匹配。如聚乳酸材料雖然生物相容性良好，但其長達數(shù)年的緩慢降解可導致酸性pH環(huán)境誘發(fā)無菌性炎癥[41]，采用降解速率與機體匹配且降解產(chǎn)物具有良好組織相容性的生物材料，可以有效降低材料降解后成纖維細胞瘢痕化填補引起的組織慢性纖維化及慢性排斥反應。

改善機體的創(chuàng)傷微環(huán)境有利于減輕人工器官引起的免疫反應。目前關于生物3D打印組織器官的植入研究，體內實驗多基于損傷后即刻移植的動物模型，但病理狀態(tài)和急性創(chuàng)傷條件下機體往往已經(jīng)發(fā)生了免疫反應。根據(jù)以往報道，應對機體損傷的免疫反應策略包括：（1）以微創(chuàng)方式進行移植可減輕炎癥和免疫反應；（2）調控巨噬細胞的M2極化狀態(tài)可有效改善機體炎癥微環(huán)境，對應生物材料的理化性質，以往研究顯示材料表面親水性、亞微米的粗糙表面形貌、納米級微孔可招募更多的巨噬細胞并促進M2極化，材料硬度以及機械刺激對巨噬細胞的表型極化也有調節(jié)作用[42-43]；（3）調控免疫細胞與生物材料之間的相互作用，以實現(xiàn)3D打印器官的免疫耐受[44]，如信號調節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α，SIRP α）-CD47有助于髓源性抑制細胞產(chǎn)生移植物的免疫耐受，避免巨噬細胞對人工器官的吞噬[45]。

目前常用于器官打印的生物材料在機體免疫應答中涉及的免疫機制各不相同，但無論是器官移植受者自身的成體干細胞作為生物墨水，還是高分子材料生物墨水，都不可避免遇到移植后炎癥反應這一棘手的問題，如何妥善降低移植后炎癥反應的嚴重程度將較大程度上決定器官移植受者預后好壞，這是未來學者們需要著重攻克的難題。

5 小 結

綜上所述，生物3D打印技術在醫(yī)學領域應用廣泛，在器官再造領域具有獨特的優(yōu)勢，被給予相當高的期望。雖然當下生物3D打印技術尚無法構建可用于器官移植的產(chǎn)品，存在免疫反應、血管化、多組織打印、仿生結構等諸多方面的瓶頸，但這些難題既是挑戰(zhàn)，也是機遇。我們有理由相信在不久的將來，生物3D打印能夠在人工器官制備方面取得突破，推動器官移植和個性化醫(yī)療的發(fā)展。