谷氨酸脫氫酶作為藥物性肝損傷潛在生物標(biāo)志物的研究進展

黎 韻，向懷榮，程 旋，何 貝，彭文興,2

（中南大學(xué)1.湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，2.臨床藥學(xué)研究所，湖南長沙 410011）

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是人體暴露于特定藥物后由藥物本身或其代謝產(chǎn)物對肝的直接或間接作用而引起的肝損傷[1]。DILI是常見藥物不良反應(yīng)，可導(dǎo)致急性肝衰竭甚至死亡等嚴重不良預(yù)后[2-3]。在中國大陸，DILI發(fā)病率約為23.8/100 000，高于西方國家的報道[4]。根據(jù)機制DILI可分為固有型和特異質(zhì)型。固有型DILI是指由藥物或其代謝物直接損傷引起的DILI，與藥物劑量正相關(guān)，可預(yù)測，潛伏期短，且個體間差異不明顯。然而，大部分藥物引起的DILI是特異質(zhì)型DILI。特異質(zhì)型DILI通常與藥物劑量無關(guān)，個體間差異大，機制復(fù)雜，難以預(yù)防和診斷[5]。特異質(zhì)型DILI難以在實驗動物復(fù)制，臨床表現(xiàn)多樣，是醫(yī)藥公司、患者和臨床醫(yī)生密切關(guān)注的問題。特異質(zhì)型DILI不僅是藥物審批失敗、增加警示以及退出市場的重要原因，也是臨床出現(xiàn)不明原因肝損傷的重要原因[6]。對于DILI，迄今仍缺乏靈敏性高且特異性強的診斷標(biāo)志物和有效的治療方法，存在診斷和治療兩大困難。

谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）是一種變構(gòu)酶，主要催化谷氨酸氧化脫氨生成α-酮戊二酸的可逆反應(yīng)，在胰島素穩(wěn)態(tài)[7]、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8]和癌細胞繁殖[9]中發(fā)揮著重要作用。在人體，GLDH廣泛存在于細胞內(nèi)線粒體基質(zhì)中，當(dāng)線粒體遭到破壞時，GLDH從線粒體基質(zhì)被釋放到體循環(huán)中，導(dǎo)致血清中GLDH水平升高。另外，GLDH作為氨基酸代謝過程的關(guān)鍵酶在肝組織中含量最高[10]。且線粒體損傷是多數(shù)DILI機制的關(guān)鍵步驟，DILI發(fā)生時，血清GLDH水平會顯著升高。因此，GLDH被視為DILI的潛在生物標(biāo)志物[11-12]。最新研究表明，GLDH作為DILI的生物標(biāo)志物在一定程度上優(yōu)于其他傳統(tǒng)生物標(biāo)志物[11,13]。如2019年Church等[13]進行了一項國際合作的大型前瞻性研究，對miR-122、GLDH、炎癥標(biāo)志物高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等DILI的候選生物標(biāo)志物進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)GLDH作為DILI的診斷標(biāo)志物優(yōu)于其他生物標(biāo)志物。

1 傳統(tǒng)DlLl生物標(biāo)志物及其不足

傳統(tǒng)肝功能指標(biāo)是常用的DILI診斷指標(biāo)，包括谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）等。目前臨床診斷DILI的金標(biāo)準(zhǔn)為GPT，GOT，ALP和TBIL的聯(lián)合檢測。隨著金標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用于臨床，這些傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的不足逐漸顯現(xiàn)。首先，這些傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的肝特異性不強，肝以外的其他器官損傷也會導(dǎo)致它們的升高和假陽性診斷。如肌損傷可導(dǎo)致血清GPT升高；腎炎和肌損傷均可導(dǎo)致GOT升高[14-15]；ALP同時分布于肝組織和骨組織中，可隨成骨細胞活性的升高而升高。婦女絕經(jīng)后血清中的ALP水平升高，而絕經(jīng)后婦女是DILI的高危人群，易導(dǎo)致假陽性診斷[16]；當(dāng)血紅蛋白降解增加或膽紅素轉(zhuǎn)運體發(fā)生改變時，血清中TBIL水平也會隨之升高[17]。其次，這些傳統(tǒng)生物標(biāo)志物的靈敏性不高，部分患者在DILI發(fā)生的早期僅表現(xiàn)出金標(biāo)準(zhǔn)的血清水平輕微升高，甚至不升高，容易錯過最佳診療時間，發(fā)生不可逆嚴重肝損傷，甚至導(dǎo)致肝衰竭，最后危及生命?？傊壳芭R床上使用的金標(biāo)準(zhǔn)不能早期、準(zhǔn)確、特異地對DILI進行診斷，不利于及時對發(fā)生了DILI的患者進行干預(yù)。為更早、靈敏、特異地診斷DILI以減少DILI引起的嚴重肝損傷和死亡，尋找新的DILI生物標(biāo)志物勢在必行。

2 GLDH作為潛在DlLl生物標(biāo)志物的特點

關(guān)于GLDH作為DILI的潛在生物標(biāo)志物已有大量相關(guān)研究。下面對GLDH作為DILI生物標(biāo)志物在生物學(xué)特性、肝損傷特異性、靈敏性和穩(wěn)定性等4個方面的研究進展進行綜述。

2.1 生物學(xué)特性

GLDH（EC 1.4.1.3）是由谷氨酸脫氫酶基因（NCBI序列號NC_000010.11）編碼的一種酶。哺乳動物組織中GLDH由6個相同的亞基組成的六聚體分子組成，每個亞基的相對分子質(zhì)量約為5.6×104，由505個氨基酸組成的多肽鏈組成。GLDH主要催化谷氨酸氧化脫氨生成α-酮戊二酸和氨，這一過程是機體獲得ATP的重要途徑。GPT（EC 2.6.1.2）和GOT（EC 2.6.1.1）是氨基酸代謝過程中重要的酶。GPT和GOT為蛋白單體，相對分子質(zhì)量比GLDH小，但GLDH在結(jié)構(gòu)、組織分布和功能上更保守，物種間轉(zhuǎn)化率更高[18-19]。與GPT一樣，GLDH是一種在肝組織中分布最多的酶，但兩者在肝細胞內(nèi)的分布不同[10]。GPT起源于胞漿，而GLDH位于線粒體基質(zhì)中[18]。GLDH在含有富含基質(zhì)的線粒體的肝組織中分布最廣，而在含有富含嵴的線粒體的組織中，如心肌和骨骼肌，分布極少[19]。GLDH雖也存在于腎和神經(jīng)組織中，但這些組織通常分別向管腔和腦脊液釋放酶。

2.2 肝損傷特異性

與GPT相比，GLDH的肝特異性更強。GPT是一種在肝細胞含量較高的代謝酶，在肝細胞壞死過程中，細胞膜受到損壞，GPT被釋放到血液中。然而，GPT不僅由肝細胞釋放，也能在其他器官的細胞受到損傷時從中釋放，如腎、肌肉和心臟等[10，19]。在劇烈運動[20-21]和心梗[14]后，血清GPT水平顯著升高。此外，GPT的血清水平還受人體代謝變化的影響，如饑餓、糖尿病[22-23]或某些藥物治療期間[24]均會引起GPT血清水平的變化。因此，GPT的肝損傷特異性不足。GLDH雖在腎、胰腺、大腦和腸道有少量表達，在肌組織中也有微量表達，但主要在肝小葉中均勻表達[10]?；贕LDH的肝損傷特異性比GPT更強，美國FDA在2020年已批準(zhǔn)了臨床應(yīng)用GLDH代替GPT聯(lián)合其他生物標(biāo)志物（如TBIL，GOT和ALP）作為肌損傷患者的肝損傷生物標(biāo)志物[25]。

2.3 靈敏性

GPT等傳統(tǒng)生物標(biāo)志物不能較早診斷出DILI，存在患者病情嚴重而血清中的GPT水平仍處于正常水平的情況[26]。GLDH相較于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物能更早地診斷出DILI，靈敏性更高。有研究顯示，隨著肝損傷的加重，相較于GPT，血清GLDH水平的升高能更早地被檢測到[27]。在蒼耳子水提取物致大鼠肝損傷研究中，可以觀察到動物輕微肝損傷時GLDH明顯升高，而傳統(tǒng)生物標(biāo)志物（如GPT和GOT）血清水平并未出現(xiàn)明顯升高[28]。此外，在對乙酰氨基酚引起的肝損傷大鼠模型中，GLDH被證明是比GPT更靈敏的DILI生物標(biāo)志物[29]。

2.4 穩(wěn)定性

GLDH的穩(wěn)定性表現(xiàn)在個體穩(wěn)定性、藥物穩(wěn)定性和檢測穩(wěn)定性3個方面。在個體穩(wěn)定性方面，GLDH在健康受試者血清中的濃度不受性別和年齡等因素的影響，穩(wěn)定在1～10 U·L-1[30]，個體間差異小。藥物穩(wěn)定性體現(xiàn)在GLDH不易受到藥物的抑制和誘導(dǎo)。某些藥物可抑制GPT的表達并掩蓋其血清水平的升高。在一項大鼠的急性肝損傷研究中發(fā)現(xiàn)，異煙肼和硝酸鉛會抑制GPT的表達，環(huán)丙孕酮和地塞米松會誘導(dǎo)GPT的表達升高，Wyeth-14643會誘導(dǎo)ALP的表達升高，從而導(dǎo)致假陽性、假陰性結(jié)果，而血清GLDH的水平不受這些藥物的影響[10]。檢測穩(wěn)定性體現(xiàn)在人血清中GLDH在室溫下放置48 h，-20℃冷藏14 d或-80℃冷凍18個月后其水平僅輕微下降。且將3種GLDH含量不同的人血清在-80℃冷凍并融化4次后，在每個解凍循環(huán)后檢測的樣品中的GLDH濃度均在真實值的86%～103%范圍內(nèi)[31]。

3 GLDH與其他新型DlLl標(biāo)志物比較

由于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物存在的不足，除GLDH外，還出現(xiàn)了其他一些潛在的新型生物標(biāo)志物，如：miR-122、HMGB1和OPN、細胞死亡標(biāo)志物細胞角蛋白 18（cytokeratin 18 protein，CK18）等。miR-122是肝組織中含量最高的微RNA，在成年小鼠肝組織中占70%，在人肝組織中占52%[32]，在肝損傷時會釋放到血液循環(huán)中。miR-122的肝損傷特異性比GLDH更強，但其個體間的差異大，穩(wěn)定性比GLDH差[13]。HMGB1是一種核內(nèi)蛋白，其血清水平升高提示細胞損傷或炎癥反應(yīng)，在肝損傷中比傳統(tǒng)生物標(biāo)志物升高更早[32]。然而HMGB1在淋巴、腦和肝等組織中均廣泛大量分布從而缺乏肝特異性，且其個體內(nèi)的差異大，特異性和敏感性均比GLDH差[33]。CK18是一種細胞死亡的標(biāo)志物，可作為早期檢測肝細胞壞死和凋亡的標(biāo)志物。OPN是一種多功能蛋白，其血清水平與肝損傷程度相關(guān)。與GLDH相比，CK18和OPN對不良預(yù)后具有更強的診斷力，但它們同樣在體內(nèi)廣泛分布，缺乏肝損傷特異性[34-35]。GLDH還具有檢測方法簡便的優(yōu)勢。目前GLDH采用速率法來檢測其活性。樣本中的GLDH在還原型輔酶Ⅰ（NADH）存在下催化α-酮戊二酸與氨反應(yīng)生成L-谷氨酸和水，同時NADH被氧化，氧化速率與GLDH的活性成正相關(guān)，NADH在340 nm處有吸收峰，通過監(jiān)測340 nm處吸光度的下降速率即可計算出樣本中GLDH活性[36]。根據(jù)這個原理，GLDH的活性測定可采用全自動生化分析儀來完成。該法操作簡便，技術(shù)成熟，而其他新型生物標(biāo)志物檢測方法復(fù)雜、繁瑣，技術(shù)含量高。總之，GLDH與其他新型生物標(biāo)志物相比，在肝特異性和靈敏度，個體間和個體內(nèi)穩(wěn)定性，檢測方法等方面的綜合能力更具優(yōu)勢。

4 問題與展望

GLDH比肝損傷傳統(tǒng)生物標(biāo)志物特異性更強、靈敏性更高、穩(wěn)定性更好。與其他新型生物標(biāo)志物相比較，GLDH比miR-122的個體間和個體內(nèi)差異小，比HMGB1，OPN和CK18的肝損傷特異性和靈敏性更好。此外，GLDH比這些新型生物標(biāo)志物更易于檢測。GLDH作為DILI的潛在循環(huán)生物標(biāo)志物顯示出很大的應(yīng)用潛力，具有很好的臨床應(yīng)用前景。但GLDH作為DILI潛在生物標(biāo)志物存在以下不足：①血清中GLDH水平的升高不一定能真實反映臨床意義上的DILI。2014年，Singhal等[37]研究發(fā)現(xiàn)，服用消膽胺的67名受試者中有11名受試者未引起DILI，但血清GLDH有升高的現(xiàn)象，其平均水平升高了7.3倍。2012年，Harrill等[38]研究發(fā)現(xiàn)，使用肝素的48名健康志愿者中有4例未引起DILI，但出現(xiàn)血清GLDH異常的現(xiàn)象，升高水平在4～14倍。以上研究中，GPT，HMGB1和miR-122的血清水平也存在異常升高現(xiàn)象。②由于GLDH主要存在于線粒體基質(zhì)中，所以僅在涉及線粒體損傷的DILI時才會釋放GLDH到血液中。但隨著對DILI的機制的進一步認識，未來也許能利用GLDH與其他生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測的方式來克服其缺點，從而提高診斷的準(zhǔn)確性，應(yīng)用于臨床。

未來，GLDH將主要用于以下幾個方面：①聯(lián)合傳統(tǒng)或其他新型DILI標(biāo)志物作為新的DILI標(biāo)志物。大量研究證實，每個生物標(biāo)志物都只能反映肝的某一方面的功能，不能代表肝功能的整體變化，因此在診斷肝損傷時不能單獨用一個生物標(biāo)志物，應(yīng)聯(lián)合檢測優(yōu)勢互補的生物標(biāo)志物。如GLDH作為線粒體損傷標(biāo)志物可與氧化應(yīng)激、細胞壞死凋亡或炎癥標(biāo)志物進行聯(lián)合檢測，更準(zhǔn)確地診斷DILI，為臨床治療提供科學(xué)參考。②用于研究DILI的相關(guān)機制。GLDH作為線粒體損傷標(biāo)志物能反映線粒體的損傷情況，以進一步了解到線粒體功能障礙在DILI中的作用，對不同藥物引起的DILI機制研究有重大意義。③作為DILI治療后恢復(fù)程度判定指標(biāo)。GLDH的血清水平與肝損傷程度呈正相關(guān)，患者病情加重時則GLDH血清水平升高。GLDH的半衰期較短，可實時反映肝損傷和恢復(fù)的情況。