抗菌肽buforin Ⅱ結(jié)構(gòu)及其抗菌和抗癌活性研究進(jìn)展

王玉霞，羅祿軍，張 賽，黃曉斐，賈廣韜，孫同毅，高媛媛

（濰坊醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院，2.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東省蛋白質(zhì)與多肽藥物工程實(shí)驗(yàn)室，山東省高校生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261053）

抗生素的廣泛使用甚至濫用導(dǎo)致耐藥性菌株種類和數(shù)量驚人地增長(zhǎng)，已成為全球性公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[1]。抗菌肽是具有抗菌活性的多肽分子[2]，相比于傳統(tǒng)抗生素，不易產(chǎn)生耐藥性，作為對(duì)抗抗生素耐藥細(xì)菌的潛在候選藥物備受關(guān)注。抗菌肽存在于絕大多數(shù)生命體中（包括病毒、原核微生物、真核微生物、原生生物、植物、魚(yú)類、昆蟲(chóng)、兩棲類、爬行類和哺乳動(dòng)物等），是生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化適應(yīng)外在生存環(huán)境的產(chǎn)物。組蛋白來(lái)源的抗菌肽多存在于魚(yú)類等水生生物體內(nèi)，與組蛋白氨基酸序列高度相似，在不同生命體中擁有較高的保守性[3]，因其優(yōu)良的抗菌特性成為近幾年的研究熱點(diǎn)[4]。

抗菌肽buforin是其中一類組蛋白來(lái)源的抗菌肽，主要包括buforin Ⅰ，buforin Ⅱ和buforin Ⅱ衍生肽。buforin Ⅰ最早由Park等[5]從亞洲蟾蜍的胃組織中分離得到，是首個(gè)被挖掘的buforin家族抗菌肽。組蛋白H2A通過(guò)在蛙胃部冗余表達(dá)并分泌到胃內(nèi)腔，經(jīng)過(guò)胃蛋白酶C的切割，形成含有39個(gè)氨基酸殘基的多肽，即buforin Ⅰ，其具有較強(qiáng)抗菌活性（表1），形成的抗菌層可以防止外來(lái)細(xì)菌侵襲蛙胃[6]。buforin Ⅱ是buforin Ⅰ在胞內(nèi)經(jīng)蛋白酶進(jìn)一步切割后得到的含21個(gè)氨基酸殘基的多肽[7]，其抗菌活性較buforin Ⅰ有較大提高，且具有良好的抗癌活性。本文對(duì)buforin Ⅱ及其重要衍生肽的結(jié)構(gòu)及其抗菌和抗癌活性的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為改造現(xiàn)有抗菌肽，開(kāi)發(fā)生物活性、安全性和穩(wěn)定性更好的潛力分子及其臨床應(yīng)用提供思路。

表1 buforin及其衍生肽的抑菌活性[5，7，9]

1 buforin Ⅱ的結(jié)構(gòu)

buforin Ⅱ的氨基酸序列為T(mén)RSSRAGLQFPVGRVHRLLRK，含有5個(gè)精氨酸（arginine，Arg）和1個(gè)賴氨酸，帶6個(gè)正電荷。buforin Ⅱ二級(jí)結(jié)構(gòu)的分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬結(jié)果表明，C端由兩親性α螺旋構(gòu)成，正電荷側(cè)鏈和疏水側(cè)鏈分布在螺旋的兩面。多肽主鏈上第11位氨基酸——脯氨酸處的剛性吡咯環(huán)打斷了α螺旋，形成了一個(gè)脯氨酸鉸鏈，在鉸鏈的N端形成了一個(gè)額外螺旋區(qū)[7]。buforin Ⅱ具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，從N端到C端依次為“螺旋-脯氨酸鉸鏈-兩親性螺旋”（圖1A），此特殊結(jié)構(gòu)使其具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制。隨著對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能探索的深入，研究者以buforin Ⅱ?yàn)樗{(lán)本設(shè)計(jì)了大量buforin Ⅱ衍生肽，對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的研究起到了促進(jìn)作用。

圖1 Buforin Ⅱ結(jié)構(gòu)（A）及其選擇性穿膜（B）、抗菌（C）、抗癌（D）機(jī)制.Arg：精氨酸；Pro：脯氨酸；Lys：賴氨酸.

2 buforin Ⅱ的抗菌作用及其機(jī)制

buforin Ⅱ的二級(jí)結(jié)構(gòu)與陽(yáng)離子螺旋抗菌肽，特別是等陽(yáng)離子螺旋抗菌肽（cathelicidin）家族的LL-37[8]極其相似。LL-37通過(guò)利用正電荷的氨基酸殘基（Arg/賴氨酸）靶向細(xì)菌帶負(fù)電荷的磷脂和脂多糖，通過(guò)擾動(dòng)細(xì)胞膜發(fā)揮抗菌作用。但大量研究結(jié)果表明，有別于LL-37等陽(yáng)離子螺旋抗菌肽家族抗菌肽，buforin Ⅱ是穿透細(xì)胞膜而非破壞細(xì)胞膜發(fā)揮作用。因此，研究buforin Ⅱ的穿膜機(jī)制有重要意義。

2.1 buforin Ⅱ的穿膜機(jī)制

脯氨酸鉸鏈和“Arg面”賦予buforin Ⅱ穿透細(xì)胞膜而不破壞細(xì)胞膜的特殊生物活性。Uyterhoeven等[9]研究表明，buforin Ⅱ一級(jí)氨基酸序列可在水溶液中形成“螺旋-脯氨酸鉸鏈-兩親性螺旋”的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而其最重要特點(diǎn)是5個(gè)Arg處于一個(gè)平面，形成一個(gè)“Arg面”。這個(gè)“Arg面”帶有5個(gè)正電荷，在遇到負(fù)電荷磷脂分子時(shí)，通過(guò)電荷吸引，分子迅速反轉(zhuǎn)使“Arg面”朝向膜[10]。肽的N端和C端以脯氨酸鉸鏈為核心發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，與Arg接觸的磷脂分子迅速向內(nèi)部塌陷，形成瞬時(shí)孔道進(jìn)入胞內(nèi)[11]（圖1B）。當(dāng)11位脯氨酸被置換為其他氨基酸時(shí)破壞細(xì)胞膜，而非穿透細(xì)胞膜，驗(yàn)證了脯氨酸鉸鏈?zhǔn)莃uforin Ⅱ穿膜而非破膜的關(guān)鍵[7，12]。

與此同時(shí)更多的數(shù)據(jù)表明，富集的Arg是穿膜肽的一個(gè)重要特征，許多穿膜肽如Tat，tachyplesin Ⅰ和bactenecin-7等均可通過(guò)在序列中富集的Arg發(fā)揮穿膜功能[13]。而buforin Ⅱ形成的“Arg面”驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，為之后改造多肽和預(yù)測(cè)多肽結(jié)構(gòu)提供了理論基礎(chǔ)。此外，由于buforin Ⅱ可通過(guò)獨(dú)特的穿膜機(jī)制將藥物遞送至胞內(nèi)而未破壞細(xì)胞，在藥物遞送方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[14-16]。

2.2 buforin Ⅱ的抗菌機(jī)制

buforin Ⅱ?qū)?xì)菌（G+/G-）和真菌均有廣譜高效的抗菌能力（表1）。buforin Ⅱ?qū)追N典型的G+/G-菌均有較強(qiáng)的抑菌活性（最低抑菌濃度≤4 mg·L-1），且對(duì)真菌的抑菌活性（最低抑菌濃度為1 mg·L-1）強(qiáng)于細(xì)菌。根據(jù)buforin Ⅱ穿膜而不破膜的特殊機(jī)制，推測(cè)其抗菌靶點(diǎn)在胞內(nèi)。Uyterhoeven等[9]推測(cè)其胞內(nèi)靶點(diǎn)為帶負(fù)電的DNA，并進(jìn)行了buforin Ⅱ與DNA體外MD模擬。結(jié)果表明，buforin Ⅱ與DNA的雙螺旋大溝緊密結(jié)合，且結(jié)合前后多肽構(gòu)象并未發(fā)生顯著改變（圖1C）。buforin Ⅱ各氨基酸側(cè)鏈與DNA結(jié)合時(shí)的相互作用研究結(jié)果表明，Arg2，Arg14和Arg20與DNA的相互作用能較高。借此驗(yàn)證了細(xì)菌DNA可能是buforin Ⅱ的抗菌靶點(diǎn)之一。

郝剛課題組[17-18]對(duì)buforin Ⅱ及其衍生肽的抗菌機(jī)制做了較多研究，主要有以下結(jié)果：①buforin Ⅱ可與DNA靜電吸附結(jié)合，通過(guò)消除堿基堆砌力使雙螺旋構(gòu)型解旋達(dá)到抗菌效果；②buforin Ⅱ與DNA結(jié)合部分較為保守，AT堿基對(duì)的濃度越高，結(jié)合能力越強(qiáng)；③buforin Ⅱ也可與RNA結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯，影響大分子物質(zhì)合成；④buforin Ⅱ可攻擊呼吸鏈，抑制呼吸作用和ATP合成。

目前，有關(guān)buforin Ⅱ抗菌機(jī)制方面的研究還停留在體外實(shí)驗(yàn)和分子模擬的水平，雖然已經(jīng)證明buforin Ⅱ可抑制DNA的部分功能，但仍然不排除其他靶點(diǎn)，因此需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 buforin Ⅱ的結(jié)構(gòu)改造及其衍生肽的抗菌作用

為提高 buforin Ⅱ的抗菌能力，Park等[7]用3種策略對(duì)buforin Ⅱ進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。第1種是截?cái)嗖呗?，通過(guò)逐一將氨基酸從N端或C端切下，驗(yàn)證截短多肽的抗菌功能。buforin ⅡN端的4個(gè)氨基酸殘基（TRSS）被切除后，得到衍生肽buforin ⅡA，其序列為RAGLQFPVGRVHRLLRK，抗菌活性得以提升。與之相反，C端氨基酸殘基的切除會(huì)導(dǎo)致抗菌活性降低（最小抑菌濃度＞256 mg·L-1），且圓二色光譜圖顯示多肽呈無(wú)規(guī)卷曲。第2種改造策略是替換策略，在buforin ⅡA的基礎(chǔ)上替換個(gè)別氨基酸，這一策略同樣會(huì)導(dǎo)致抗菌活性的喪失。第3種是拼接策略，即用不同多肽片段與buforin核心序列進(jìn)行拼接。buforin ⅡB是對(duì)α螺旋部件（RLLR）進(jìn)行3次重復(fù)得到的buforin Ⅱ衍生物，其序列為RAGLQFPLGRLLRRLLRRLLR。此拼接改造增強(qiáng)了C端兩親螺旋的正電荷密度和疏水強(qiáng)度，其抗菌活性與buforin ⅡA相似甚至更高（表1）。Kim等[19]做了相似的拼接改造，并將之命名為histonin，序列為RAGLQFPVGKLLKKLLKRLKR，與 Bufouin Ⅱ相比其抗菌效果較差（表1），但增強(qiáng)了其在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量。Beyth等[20]在buforin ⅡB的基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步改造：一方面通過(guò)增強(qiáng)脯氨酸附近氨基酸側(cè)鏈空間位阻來(lái)增強(qiáng)脯氨酸鉸鏈；另一方面將亮氨酸全部替換為疏水性更強(qiáng)的纈氨酸，增強(qiáng)脯氨酸鉸鏈兩端兩親性螺旋的疏水強(qiáng)度。改造得到的肽序列為RVVRQWPIGRVVRRVVRRVVR，將其命名為buforin ⅢB。buforin Ⅲ B較buforin ⅡB對(duì)大腸桿菌和糞腸球菌有更強(qiáng)的抑制作用。另外，肽環(huán)化也可在固定多肽構(gòu)象的基礎(chǔ)上，使抗菌活性得到提升[21]。

此外，增強(qiáng)抗菌肽對(duì)蛋白酶的耐受性也是重要的改造方向。Meng等[22]對(duì)buforin家族多個(gè)抗菌肽進(jìn)行了氟化改造，通過(guò)將亮氨酸側(cè)鏈甲基的6個(gè)氫替換為氟，得到了多個(gè)buforin家族抗菌肽的氟化物。這些多肽對(duì)胃蛋白酶的耐受顯著增強(qiáng)，抗菌能力也得到了保留或加強(qiáng)，但溶血活性卻無(wú)改變。

4 buforin Ⅱ衍生肽的抗癌作用和機(jī)制

buforin Ⅱ抗癌作用的研究起步較晚，由于此時(shí)已發(fā)現(xiàn)作用機(jī)制相同但生物活性更強(qiáng)的buforin ⅡB，為此抗癌作用研究主要集中于buforin ⅡB。

Lee等[23]對(duì)buforin ⅡB的廣譜抗癌效果進(jìn)行了驗(yàn)證，對(duì)其對(duì)人成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、Jurkat和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，buforin ⅡB對(duì)2種成纖維細(xì)胞株（人和小鼠的正常組織細(xì)胞）無(wú)殺傷作用，但在極低濃度對(duì)2種癌細(xì)胞的殺傷率即可＞85%。這種對(duì)癌細(xì)胞的選擇性殺傷可能是由于癌細(xì)胞膜上有大量帶負(fù)電荷的神經(jīng)節(jié)苷脂。隨后，他們測(cè)定了buforin ⅡB對(duì)包括非小細(xì)胞肺癌、白血病、乳腺癌、中樞神經(jīng)瘤、黑色素瘤、腎癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和前列腺癌在內(nèi)的62種癌細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度。結(jié)果顯示，半數(shù)抑制濃度均＜25 mg·L-1，表明buforin ⅡB體外有廣譜抗癌作用，同時(shí)也闡明了buforin ⅡB對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞毒性有差異的原因。癌細(xì)胞表面有很多帶負(fù)電的神經(jīng)節(jié)苷脂，buforin ⅡB帶正電荷的“Arg面”可以神經(jīng)節(jié)苷脂為靶點(diǎn)富集到癌細(xì)胞表面，從而選擇性攻擊癌細(xì)胞。在選擇性進(jìn)入癌細(xì)胞后，內(nèi)膜系統(tǒng)中只有線粒體表面帶有較高密度的負(fù)電磷脂，之后則通過(guò)線粒體依賴途徑來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡（圖1D）。

buforin ⅡB對(duì)不同癌細(xì)胞的抗癌機(jī)制或有不同。Li等[24]報(bào)道，buforin ⅡB通過(guò)調(diào)控周期蛋白依賴性激酶2和周期蛋白A的表達(dá)，阻斷肺癌細(xì)胞HepG 2的細(xì)胞周期，從而抑制癌細(xì)胞的活性。Han等[25]報(bào)道，buforin ⅡB通過(guò)P53途徑誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞Pc-3和Du-145凋亡。buforin ⅡB在體外的廣譜抗癌能力使其成為一種新型的抗癌分子，但由于其對(duì)不同癌細(xì)胞的抗癌機(jī)制不同，因此仍有待深入研究。

表2 組蛋白H2A源抗菌肽buforin Ⅱ的同源肽

5 buforin Ⅱ同源肽與結(jié)構(gòu)改造

buforin Ⅱ?yàn)閬喼摅蛤蹾2A源抗菌肽，在許多水生生物及兩棲動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)了buforin Ⅱ的同源肽（表 2）。其中abhisin[26]來(lái)自于盤(pán)鮑，當(dāng)abhisin濃度為250 mg·L-1時(shí)，不能抑制其他幾種G+/G-致病菌（如溶藻弧菌和副溶血性弧菌）的生長(zhǎng)，但對(duì)卵形假單胞菌的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于對(duì)其他幾種細(xì)菌。hipposin[27-28]來(lái)自于大西洋比目魚(yú)的皮膚黏液，對(duì)多種致病菌均具有良好的抗菌能力。與之類似的還有himantura，litopenaeu和scallop A等。這些抗菌肽均為組蛋白H2A源抗菌肽，序列上保留了脯氨酸鉸鏈，并含有大量帶正電荷氨基酸殘基。有一個(gè)例外是parasin[29]，來(lái)自于鯰魚(yú)的皮膚黏液，序列并未保留重要的脯氨酸鉸鏈，且二級(jí)結(jié)構(gòu)也與其他組蛋白H2A N端抗菌肽的α螺旋不同，而是以兩親性β折疊為特征。根據(jù)序列的保守性，Kong等[4]利用齊河鯽魚(yú)cDNA文庫(kù)和PCR技術(shù)，得到了齊河鯽魚(yú)的組蛋白H2A源抗菌肽Ca-L-hippo，其抑菌效果與hipposin相近。

這些抗菌肽是長(zhǎng)期自然選擇保留下來(lái)的天然肽序列，對(duì)其進(jìn)行活性探究對(duì)發(fā)現(xiàn)新抗菌肽和改造抗菌肽結(jié)構(gòu)方面意義重大。對(duì)不同物種同源片段的整理和分析，既可拓寬研發(fā)潛在活性多肽分子的思路，也可加深人們對(duì)多肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解，在抗生素濫用導(dǎo)致耐藥性嚴(yán)重的今天尤為重要。

5 結(jié)語(yǔ)

目前對(duì)buforin Ⅱ的研究仍集中于分子改造與作用機(jī)制方面，雖可通過(guò)各種改造得到抗菌效果良好的衍生肽，但其抗菌作用靶點(diǎn)尚未確定，仍需要繼續(xù)探索。buforin Ⅱ獨(dú)特的穿膜機(jī)制在納米藥物研究上有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前已有研究通過(guò)將buforin Ⅱ修飾在磁性納米粒上，利用其穿膜特性將納米制劑遞送至胞內(nèi)靶點(diǎn)，但這樣的修飾手段抑制了buforin Ⅱ原本的抗菌效力[16，30]。因此，在利用穿膜特性的同時(shí)如何保留其原本的抗菌活性也需繼續(xù)探索。