組織工程在先天性心臟瓣膜病外科治療領(lǐng)域中的應(yīng)用

竇錚綜述，李守軍審校

先天性心臟?。ㄏ刃牟。┓N類復(fù)雜，病種繁多，其外科治療往往離不開(kāi)瓣膜、補(bǔ)片、外管道等人工材料的植入，其中以瓣膜病為甚。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，外科人工植入物也經(jīng)歷了一代代更迭，但或多或少都存在缺陷，即使目前臨床上更受青睞的生物瓣，也面臨瓣膜退化，耐久性差等問(wèn)題，使其在臨床應(yīng)用過(guò)程中受到一定限制[1]。對(duì)兒科患者而言，最大的問(wèn)題莫過(guò)于兒童的生長(zhǎng)發(fā)育導(dǎo)致的心內(nèi)結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致人工瓣膜-患者不匹配，并可能引起術(shù)后患兒心功能減低、心室重構(gòu)等嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。上世紀(jì)80 年代，美國(guó)Joseph Vacanti 和Robert Langer提出了嘗試人工制造人類器官以應(yīng)對(duì)器官移植物短缺的設(shè)想，并最終發(fā)展成為今天的組織工程學(xué)（TE）[3-4]。目前人類對(duì)組織工程的設(shè)想，是在解決現(xiàn)有移植物面臨的抗凝、衰敗、炎癥反應(yīng)等問(wèn)題的基礎(chǔ)上，使組織工程移植物植入人體后具有一定的生長(zhǎng)發(fā)育潛能。盡管這一設(shè)想在臨床階段尚未完全實(shí)現(xiàn)，但組織工程在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到的積極成果及其在兒科領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿?，依舊吸引著眾多科研工作者投入其中。本文收集了目前組織工程在先心病瓣膜外科領(lǐng)域的臨床應(yīng)用成功實(shí)例，并進(jìn)行匯總，以期對(duì)組織工程在先心病領(lǐng)域的研究提供指導(dǎo)，并為小兒心臟外科醫(yī)師提供一定的臨床參考。

1 組織工程技術(shù)簡(jiǎn)介

根據(jù)細(xì)胞定植發(fā)生部位的不同，組織工程可以分為：體外組織工程、體內(nèi)組織工程和原位組織工程。

1.1 體外組織工程

體外組織工程也是最早提出的組織工程范例。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)是將一部分體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞，植入預(yù)先處理好的可吸收細(xì)胞支架，輔以細(xì)胞因子等，在體外生物反應(yīng)器模擬的生理?xiàng)l件下進(jìn)行增殖（細(xì)胞化）后植入人體[5]。在人體中，細(xì)胞支架逐漸被分解吸收，當(dāng)植入細(xì)胞的增殖速度＞細(xì)胞支架的分解速度時(shí)，移植物便表現(xiàn)出穩(wěn)定的自我生長(zhǎng)趨勢(shì)。在支架中原有基質(zhì)與細(xì)胞因子的共同作用下，種子細(xì)胞會(huì)逐步增殖為新的具有相應(yīng)形態(tài)和功能的目標(biāo)組織、器官，從而達(dá)到治療目的。但體外組織工程所需前期試驗(yàn)較為復(fù)雜，如何選取合適的細(xì)胞與材料一直困擾著科研人員。

目前具有臨床意義的組織工程瓣膜主要聚焦于對(duì)可吸收細(xì)胞支架的研究。組織工程發(fā)展過(guò)程中，支架材料經(jīng)歷了從同種和異種供體瓣膜到天然聚合物、合成生物可降解聚合物和雜化支架等技術(shù)進(jìn)展[6]。脫細(xì)胞技術(shù)是生物來(lái)源組織工程細(xì)胞支架的基礎(chǔ)，即用酶、洗滌劑等除去組織中的細(xì)胞，保留細(xì)胞外基質(zhì)及其幾何結(jié)構(gòu)，形成具有細(xì)胞空隙的三維支架。但同種異體瓣來(lái)源不穩(wěn)定，異種瓣膜在兒科中的免疫原性問(wèn)題尚未解決[3]。新一代可生物降解的合成材料/天然聚合物材料可用于替代脫細(xì)胞生物瓣膜，如聚乙二醇、聚己內(nèi)酯等，然而聚合物支架生物強(qiáng)度和耐久性雖好，其降解產(chǎn)物所引起的局部炎癥反應(yīng)依舊限制了其臨床應(yīng)用[7]。當(dāng)下，新型的3D 打印支架逐漸進(jìn)入人們的視野，該技術(shù)通常選取生物-聚合物水凝膠作為支架材料，種子細(xì)胞附著于3D支架上，可進(jìn)行生長(zhǎng)、增殖。2017 年，Bracaglia 等[8]報(bào)道了一種由聚乙二醇二丙烯酸酯與脫細(xì)胞牛心包基質(zhì)勻漿交聯(lián)的水凝膠制成的生物-聚合物雜化支架，并證實(shí)了二者交聯(lián)可以提高雜化支架的壓縮模量，機(jī)械強(qiáng)度良好，在組織工程尤其是兒科領(lǐng)域移植物的開(kāi)發(fā)中具有重要潛力。

1.2 體內(nèi)組織工程

體內(nèi)組織工程也稱活體組織工程，是將不可吸收的模具植入人體非病變部位（一般為皮下），利用人體自身的炎癥反應(yīng)，使纖維組織包裹模具，一段時(shí)間后取出，剔除模具，回收纖維組織用于移植物制備。相較于其他兩種方法，體內(nèi)組織工程不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室步驟以及漫長(zhǎng)的制備時(shí)間，取材相對(duì)不受倫理學(xué)限制，但由于制備過(guò)程全程位于體內(nèi)，可控性相對(duì)較差，且如何誘導(dǎo)形成心內(nèi)組織，尤其是瓣膜的復(fù)雜多層結(jié)構(gòu)，成為了限制其應(yīng)用的最大因素[9]。

1.3 原位組織工程

將脫細(xì)胞的細(xì)胞支架直接植入患者體內(nèi)（通常是待修補(bǔ)的部位），利用患者自身的循環(huán)系統(tǒng)充當(dāng)生物反應(yīng)器。原位組織工程的流程簡(jiǎn)單、成本較低，相較于傳統(tǒng)體外生物反應(yīng)器，再細(xì)胞化發(fā)生在患者體內(nèi)，于生理?xiàng)l件下的血氧飽和度、血壓和剪切力等條件下進(jìn)行，有利于組織的生長(zhǎng)、增殖。然而，原位組織工程相應(yīng)的難度也更大，血栓并發(fā)癥常見(jiàn)。且如何在體內(nèi)控制支架的再細(xì)胞化是該技術(shù)最大的挑戰(zhàn)[7]。目前有研究人員嘗試用靜電紡絲制作原位組織工程瓣膜微孔支架，并在羊肺動(dòng)脈瓣植入的12個(gè)月隨訪中獲得了較為理想的結(jié)果[10]，在兒科組織工程瓣膜應(yīng)用方向表現(xiàn)出優(yōu)秀的潛力，但仍缺乏相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)支持。

2 不同移植物的臨床應(yīng)用進(jìn)展

2.1 組織工程瓣膜

目前臨床常用的瓣膜植入物主要為機(jī)械瓣和生物瓣，機(jī)械瓣耐用性強(qiáng)，但需終生抗凝；生物瓣雖不需長(zhǎng)期服用抗凝藥物，但由于瓣膜衰敗較快，常在10～15 年內(nèi)需二次手術(shù)或介入換瓣[11]。目前常用于降低生物瓣膜免疫原性的戊二醛已被證實(shí)其殘留物具有一定的細(xì)胞毒性，并會(huì)引起強(qiáng)烈的宿主免疫反應(yīng)，加速瓣膜衰敗[12]。自脫細(xì)胞技術(shù)開(kāi)發(fā)以來(lái)，各種脫細(xì)胞瓣膜應(yīng)運(yùn)而生，在一定程度上彌補(bǔ)了現(xiàn)有瓣膜植入物的缺陷。

脫細(xì)胞同種瓣膜在臨床實(shí)踐過(guò)程中表現(xiàn)出巨大潛力。一項(xiàng)多中心研究回顧了共計(jì)287 例右心室流出道狹窄患者，其中163 例患者接受降低了免疫原性的脫細(xì)胞同種異體組織工程瓣膜移植，124 例患者接受了目前標(biāo)準(zhǔn)的同種異體生物瓣置換治療。兩組患者死亡率、精算生存期無(wú)差別，組織工程組的右心室流出道功能恢復(fù)情況明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)組。另外，研究者對(duì)1 歲以下患者進(jìn)行了亞組分析，發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)組相比，組織工程組患兒的免于再干預(yù)率更高，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而免于功能障礙率顯著高于標(biāo)準(zhǔn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。德國(guó)漢諾威醫(yī)學(xué)院的Tudorache 等[14]報(bào)告了64 例接受脫細(xì)胞同種主動(dòng)脈瓣置換的兒童及青少年患者的平均2 年隨訪結(jié)果，所有患者術(shù)中及術(shù)后組織學(xué)分析均未發(fā)現(xiàn)移植物出現(xiàn)鈣化，再細(xì)胞化良好，未觀察到炎癥反應(yīng)。對(duì)10 歲以下患兒進(jìn)行的亞組分析也印證了以上結(jié)果。另外，為進(jìn)一步證實(shí)同種瓣膜的優(yōu)勢(shì)，該團(tuán)隊(duì)中的Sarikouch 等[15]又為364 例患者進(jìn)行了組織工程同種瓣移植并完成了所有同種異體移植物的術(shù)后組織學(xué)評(píng)估，該試驗(yàn)共有8 例患者需要術(shù)后再移植，同種主動(dòng)脈瓣和肺動(dòng)脈瓣的免于再移植率分別為96.1%和98.7%，感染和瓣下狹窄是引起再移植的主要原因。研究者發(fā)現(xiàn)，發(fā)生感染性心內(nèi)膜炎患者的再細(xì)胞化水平明顯低于未感染者，且使用人造材料會(huì)增加發(fā)生感染性心內(nèi)膜炎的風(fēng)險(xiǎn)，故并不建議將人造材料與組織工程瓣膜聯(lián)合使用。更有趣的是，在所有接受移植的患者中，組織學(xué)檢查評(píng)分最優(yōu)者是一名嬰兒，據(jù)報(bào)道，患兒在6 周大時(shí)即接受了組織工程主動(dòng)脈瓣置換術(shù)，術(shù)后患兒的移植物與間充質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等具有良好的整體再細(xì)胞化率，且?guī)缀跷窗l(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞，4.5 年后患兒的無(wú)冠竇再細(xì)胞化依舊良好。

對(duì)主動(dòng)脈瓣置換患者，目前臨床常采用ROSS手術(shù)用于替代現(xiàn)有人工機(jī)械瓣和生物瓣，但ROSS術(shù)后仍面臨肺動(dòng)脈瓣假體置換以及二次手術(shù)無(wú)法取材等問(wèn)題[5]。最初對(duì)原位組織工程瓣膜的嘗試就是將脫細(xì)胞豬瓣膜移置入Ross 術(shù)后患兒的肺動(dòng)脈瓣位，然而術(shù)后4 例瓣膜均表現(xiàn)出非常嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和鈣化，這可能由脫細(xì)胞不完全引起[16]。經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)革新，目前脫細(xì)胞同種異體組織工程瓣膜已經(jīng)成功地應(yīng)用于Ross 手術(shù)，能夠維持良好的瓣膜功能和免于再手術(shù)率，但在臨床推廣之前，仍應(yīng)考慮如何解決瓣葉增厚的問(wèn)題[7]。

作為脫細(xì)胞異種和同種基質(zhì)的替代品，可生物降解的合成和天然聚合物已被引入臨床。聚合物材料沒(méi)有異種疾病和排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并且來(lái)源廣泛，易于批量制備。纖維蛋白等天然聚合物，分解產(chǎn)物沒(méi)有毒性，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)；合成聚合物，如聚乙醇酸等，具有足夠的強(qiáng)度和耐久性，其分解產(chǎn)物可能會(huì)引起局部炎癥。聚乙醇酸聚合物支架在先心病血管移植領(lǐng)域已經(jīng)取得了良好的臨床結(jié)果，期待該材料在瓣膜病領(lǐng)域的突破。

此外，間充質(zhì)細(xì)胞可能適用于體外方法設(shè)計(jì)兒科組織工程瓣膜。該細(xì)胞可在出生前或出生后立即獲取，用于合成自體瓣膜組織，以便對(duì)患兒及早進(jìn)行手術(shù)換瓣。真皮成纖維細(xì)胞是目前更新的一類種子細(xì)胞，但目前缺乏足夠的臨床應(yīng)用實(shí)例以證明其可行性。

2.2 組織工程補(bǔ)片和外管道

先天性心臟瓣膜病，常合并多種缺損、畸形，往往需要同時(shí)應(yīng)用人工瓣膜、補(bǔ)片、帶瓣管道等進(jìn)行修補(bǔ)，故對(duì)組織工程補(bǔ)片和外管道的臨床應(yīng)用進(jìn)展也進(jìn)行簡(jiǎn)要回顧和綜述。

傳統(tǒng)異種材料補(bǔ)片不具有生長(zhǎng)潛能，同樣會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的鈣化形成，故目前以自體心包為首選材料，但其缺乏生長(zhǎng)潛力，且需二次手術(shù)時(shí)，往往因炎癥、粘連等導(dǎo)致自體心包不可取用[17-18]。2018 年，萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心首次報(bào)道了一類新型脫細(xì)胞牛心包補(bǔ)片CardioCel 的臨床應(yīng)用結(jié)果[19]。同年P(guān)avy 等[20]回顧了101 例18 歲以下應(yīng)用CardioCel 治療先心病的患兒。該材料被應(yīng)用于63 例間隔缺損修補(bǔ)（房間隔缺損3 例、室間隔缺損54 例、完全型房室間隔缺損4 例、部分型房室間隔缺損2 例），24 例血管擴(kuò)大（升主動(dòng)脈4 例、主動(dòng)脈弓部5 例、肺動(dòng)脈15 例），16例右心室流出道擴(kuò)大（漏斗部擴(kuò)大補(bǔ)片11 例、跨環(huán)補(bǔ)片5 例），10 例瓣膜重建（主動(dòng)脈瓣延長(zhǎng)或單瓣修復(fù)術(shù)4 例、Ozaki 手術(shù)2 例、二尖瓣成形術(shù)3 例、三尖瓣成形術(shù)1 例）以及1 例靜脈吻合（Senning 手術(shù)1例）。結(jié)果顯示，術(shù)后30 d 內(nèi)患兒死亡率3.9%，中位隨訪212 d 期間，共有5 例患者因補(bǔ)片衰敗而進(jìn)行再手術(shù)修補(bǔ)。研究者發(fā)現(xiàn)，CardioCel 在術(shù)中易于植入，在右心系統(tǒng)低壓區(qū)的表現(xiàn)良好，然而左心系統(tǒng)高壓區(qū)域中早期即發(fā)生移植物衰敗，研究者認(rèn)為這是由于在正常血壓下，主動(dòng)脈和CardioCel 補(bǔ)片的彈性出現(xiàn)不匹配，血液對(duì)主動(dòng)脈壁產(chǎn)生剪切力，從而引起內(nèi)膜反應(yīng)產(chǎn)生局部組織肥厚，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的主動(dòng)脈狹窄。Deutsch 等[21]的研究也在低齡患兒中印證了這一點(diǎn)，研究者對(duì)CardioCel 修補(bǔ)后脫落的患者的補(bǔ)片進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在5 例＜18的患者中，1 例7 歲主動(dòng)脈瓣修補(bǔ)的患者補(bǔ)片僅在體內(nèi)存留的3 d；1 例1 歲行二尖瓣修補(bǔ)的患者，9 d后因補(bǔ)片脫落再次手術(shù)修補(bǔ)；1 例部分房室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)的5 歲患兒補(bǔ)片在其體內(nèi)存留了237 d。然而在年長(zhǎng)兒中（10 歲、16 歲），左心系統(tǒng)補(bǔ)片分別存留了795 d 和1 247 d。5 例脫落補(bǔ)片的組織形態(tài)學(xué)分析幾乎全部發(fā)現(xiàn)肉芽組織層，2 例年長(zhǎng)兒補(bǔ)片中均存在膠原基質(zhì)的輕微碎裂。

2017 年，Bockeria 等[22]首次在5 例單心室病變的兒科患者中植入脫細(xì)胞生物可吸收移植物，作為下腔靜脈和肺動(dòng)脈之間的心外腔肺導(dǎo)管。Sugiura 等[23]對(duì)25 例平均年齡5.5 歲的生理學(xué)單心室患兒進(jìn)行了組織工程血管移植，移植物采用聚乙醇酸支架植入自體骨髓單核細(xì)胞種植。經(jīng)過(guò)平均11.1 年的隨訪，所有患兒未發(fā)生移植物相關(guān)死亡，也沒(méi)有證據(jù)表明有動(dòng)脈瘤形成、移植物破裂、感染和鈣化等情況的發(fā)生。證實(shí)了該材料在小兒心血管手術(shù)中具有可行性。

另外值得關(guān)注的是，2020 年，F(xiàn)ujita 等[18]首次報(bào)道了將體內(nèi)組織工程血管移植物代替自體心包應(yīng)用于肺動(dòng)脈重建手術(shù)中的嘗試，研究者首先將硅膠引流管制成了組織工程血管模具，在患兒初次手術(shù)時(shí)植入腹部皮下。其中一例為1 歲男孩，首次手術(shù)行姑息性右室流出道疏通，同時(shí)植入模具，13 個(gè)月后取出并裁剪組織用于肺動(dòng)脈狹窄的修補(bǔ)；另一例4 歲男孩在初次肺動(dòng)脈置換術(shù)后26 個(gè)月，將組織工程移植物用于肺動(dòng)脈殘余狹窄的修補(bǔ)。其中，該1歲患兒術(shù)后五年?duì)顩r良好，40 個(gè)月CT 未發(fā)現(xiàn)狹窄或動(dòng)脈瘤的形成。初步證實(shí)了體內(nèi)組織工程用作肺動(dòng)脈狹窄修補(bǔ)的可行性。次年，該團(tuán)隊(duì)補(bǔ)充了體內(nèi)組織工程血管移植物在先心病中的應(yīng)用實(shí)例[24]，研究者對(duì)共計(jì)4 例患有主肺側(cè)支動(dòng)脈或合并室間隔缺損的肺動(dòng)脈閉鎖的患兒施行了體內(nèi)移植。經(jīng)過(guò)最長(zhǎng)4 年的隨訪，所有患者肺動(dòng)靜脈壓均有不同程度緩解，且并未出現(xiàn)肺動(dòng)脈再狹窄或瘤樣擴(kuò)張，故作者認(rèn)為對(duì)于需要多次分期手術(shù)的先心病患兒，體內(nèi)組織工程血管移植物是一種非常有前景的自體心包替代品。

3 討論與總結(jié)

對(duì)于組織工程瓣膜移植物的研究，還處于臨床前的基礎(chǔ)研究或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。然而不同物種間的免疫系統(tǒng)具有較大差距，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得陽(yáng)性結(jié)果，并不能說(shuō)明能較易轉(zhuǎn)化為臨床。目前獲得良好臨床反饋的組織工程瓣膜，主要集中在不同材質(zhì)細(xì)胞支架的移植物，其他方向尚未取得突破。初步結(jié)果良好的補(bǔ)片和外管道移植物也缺乏更大樣本量數(shù)據(jù)的支持。目前組織工程在兒科領(lǐng)域的發(fā)展，還有非常漫長(zhǎng)的路要走，但同樣我們也可以看到許多材料均表現(xiàn)出令人振奮的潛力，希望未來(lái)有更多臨床應(yīng)用的成功實(shí)例以及更新組織工程材料的出現(xiàn)，能推動(dòng)該領(lǐng)域的發(fā)展，為先心病患兒帶來(lái)新希望。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突