核酸適配體靶向遞送siRNA的設(shè)計(jì)策略及應(yīng)用進(jìn)展

呂子陽(yáng)，任歡歡，聶盛丹，王 珊

(1. 中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，湖南 長(zhǎng)沙 410083；2. 湖南省人民醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種進(jìn)化保守的生物學(xué)過(guò)程，通過(guò)降解靶信使RNA(messenger RNA, mRNA)選擇性地抑制基因的表達(dá)[1]。RNAi在癌癥、感染、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病的治療中都展現(xiàn)出巨大的潛力[2]。引入外源性合成的小干擾RNA(small interfering, siRNA)，通過(guò)特定的堿基互補(bǔ)配對(duì)可以誘導(dǎo)RNAi的發(fā)生。然而，siRNA在實(shí)際應(yīng)用中存在許多問(wèn)題，如：siRNA穩(wěn)定性較差，在血液中易被降解；分子量相對(duì)較小，即使是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾能在血液中保持穩(wěn)定的siRNA分子也易經(jīng)尿液排泄；缺少靶向性，體內(nèi)的隨機(jī)分布易造成不必要的毒性；固有的負(fù)電性導(dǎo)致很難被細(xì)胞內(nèi)化。到目前為止，將siRNA遞送到靶組織/靶細(xì)胞并發(fā)揮基因沉默作用仍然是極具挑戰(zhàn)的事情。

許多靶向配體，如多肽、蛋白、親脂性分子已經(jīng)被用來(lái)靶向傳遞siRNA。核酸適配體(aptamer)又稱為“化學(xué)抗體”，特定的三維空間結(jié)構(gòu)賦予了其與細(xì)胞表面蛋白的高度親和力，而這種細(xì)胞特異性的核酸適配體可以用來(lái)遞送抗癌藥物、酶、核酸到靶細(xì)胞中。核酸適配體可以直接與siRNA共價(jià)結(jié)合構(gòu)建核酸適配體-siRNA嵌合體，或者作為一個(gè)靶向配體與其他siRNA載體連接來(lái)引導(dǎo)其進(jìn)入靶細(xì)胞。近年來(lái)，已有大量研究證明，核酸適配體作為靶向配體引導(dǎo)siRNA進(jìn)入靶細(xì)胞的可能性，許多核酸適配體也成功實(shí)現(xiàn)了在體內(nèi)靶向遞送siRNA[3-5]。該綜述總結(jié)了近幾年核酸適配體靶向遞送siRNA在疾病治療中的設(shè)計(jì)策略及應(yīng)用的最新研究進(jìn)展，并討論了核酸適配體介導(dǎo)siRNA傳遞在臨床轉(zhuǎn)化方面的挑戰(zhàn)與前景，以期為siRNA藥物的靶向遞送提供一定的參考。

1 核酸適配體作為靶向配體遞送siRNA的優(yōu)點(diǎn)

與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體作為靶向傳遞配體有著許多吸引人的地方。首先，核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(systemic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)的選擇方法從隨機(jī)分子庫(kù)合成得到的一段短的單鏈DNA或RNA分子，與抗體生產(chǎn)的復(fù)雜昂貴、冗長(zhǎng)的體內(nèi)篩選相比，這種SELEX的體外篩選方法能在幾周內(nèi)篩選出能夠靶向目的配體的核酸適配體。其次，由于核酸適配體是在完全體外環(huán)境依賴化學(xué)合成制造的，生產(chǎn)批次之間的差異更小，不存在或存在更低的污染風(fēng)險(xiǎn)。再次，與體積較大的抗體(150～180 ku, 直徑～15nm)相比，核酸適配體的尺寸較小( 6～30 ku, 直徑1～2 nm)，免疫原性更低，結(jié)構(gòu)更靈活，可以與更小的靶標(biāo)或者一些隱藏的結(jié)合區(qū)域結(jié)合[6]。最重要的是，小體積的核酸適配體表現(xiàn)出較強(qiáng)的組織滲透性，特別是在實(shí)體腫瘤中，這非常有利于遞送藥物到深層的組織細(xì)胞內(nèi)。到目前為止，許多的臨床前研究已經(jīng)證明了核酸適配體靶向遞送siRNA的潛力[3-4, 7]。

2 基于核酸適配體-siRNA嵌合體靶向遞送siRNA

核酸適配體和siRNA都為核酸，很容易通過(guò)共價(jià)連接或者堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合形成核酸適配體-siRNA嵌合體。2006年，Sullenger研究團(tuán)隊(duì)[8]首次用靶向前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen, PSMA)的核酸適配體與PLK1和BCL2 siRNA的正義鏈共價(jià)連接構(gòu)建核酸適配體-siRNA嵌合體。其中，PSMA是一種在只在前列腺癌細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮中過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞表面受體，PLK1和BCL2基因在人類多種癌癥中過(guò)表達(dá)且與癌細(xì)胞的生存相關(guān)。當(dāng)該嵌合體應(yīng)用于PSMA+細(xì)胞時(shí)，這些RNA能被Dicer酶加工，siRNA從嵌合體上分離并與特異性酶Argo-2蛋白等(包括核酸內(nèi)切酶、外切酶、螺旋酶等)形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，在ATP-依賴的解螺旋酶作用下，siRNA雙鏈打開(kāi)，正義鏈離去，反義鏈激活RISC，再與互補(bǔ)序列的靶mRNA的同源區(qū)特異性結(jié)合，通過(guò)酶的作用使mRNA降解，從而達(dá)到基因沉默的作用。并且，該核酸適配體-siRNA嵌合體的基因沉默效率與傳統(tǒng)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染相媲美。然而，由于該嵌合體的穩(wěn)定性較差，因此只能通過(guò)瘤內(nèi)注射來(lái)驗(yàn)證其體內(nèi)的治療效果[8]。

為提高核酸適配體-siRNA嵌合體的穩(wěn)定性，將其應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，可對(duì)核酸適配體和siRNA部分進(jìn)行化學(xué)修飾，如對(duì)核酸適配體3′端和/或5′端進(jìn)行修飾來(lái)抵抗核酸外切酶的水解作用；用氟、氨基、甲氧基等取代核酸適配體骨架的核糖或脫氧核糖的2′位氫，或?qū)⒘姿岫ユI修飾為硫代磷酸二酯鍵可抵抗核酸內(nèi)切酶的進(jìn)攻[9]；此外，鎖核酸技術(shù)和鏡像技術(shù)亦可增加核酸適配體的穩(wěn)定性。近來(lái)已有大量研究報(bào)道了基于構(gòu)建核酸適配體-siRNA嵌合體靶向遞送siRNA用于疾病治療。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcriptional-3, STAT3)的異常表達(dá)和激活在白血病、結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，是潛在的治療靶點(diǎn)。Gint4.T是由33個(gè)堿基組成的RNA適配體，能夠特異性結(jié)合并拮抗血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β(platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ)。Esposito等[3]通過(guò)化學(xué)的方法在Gint4.T的3′端融合4個(gè)—(CH2)3—作為linker，隨后在linker后共價(jià)連接一段17個(gè)堿基的隨機(jī)序列作為的粘性末端，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與接有17個(gè)未配對(duì)堿基的STAT3 siRNA反義鏈構(gòu)建Gint4.T-siRNA嵌合體。將Gint4.T和STAT3 siRNA嘧啶堿基或嘌呤2′位進(jìn)行氟修飾或甲氧基修飾，修飾后的嵌合體能夠在含80%人血清至少能穩(wěn)定存在24 h以上。體外實(shí)驗(yàn)中，該嵌合體能高效傳遞siRNA到PDGFRβ+膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)STAT3基因沉默，抑制細(xì)胞的增殖和遷移；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，即使經(jīng)腹腔注射該嵌合體，也能夠抑制皮下荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成。

HER家族由表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、HER1(EGFR)、HER2、HER3、 HER4組成，它們之間相互依賴，一個(gè)HER受體的阻斷通常可以由另一個(gè)HER家族成員來(lái)補(bǔ)償[10]。其中EGFR、HER2、 HER3促進(jìn)許多癌癥起始和發(fā)展，尤其在乳腺癌中，是公認(rèn)的治療靶點(diǎn)[11]。Liu等[4]采用HER2核酸適配體和HER3核酸適配體作為靶頭，將EGFR siRNA嵌入到兩個(gè)核酸適配體中間構(gòu)建HER2-EGFR siRNA-HER3核酸適配體嵌合體(H2EH3)。在核酸適配體和siRNA之間插入2～4個(gè)未配對(duì)的腺嘌呤核糖核苷酸，為每個(gè)核酸適配體提供空間靈活性，并在EGFR siRNA反義鏈的3′端融合2個(gè)核苷酸促進(jìn)RISC的形成[12]。結(jié)果顯示，EGFR siRNA能有效通過(guò)HER2/HER3核酸適配體誘導(dǎo)的內(nèi)化作用進(jìn)入HER2+細(xì)胞并發(fā)揮基因沉默作用。巧妙的是，在H2EH3中，HER2/HER3核酸適配體一方面可作為siRNA靶向遞送的載體；另一方面可作為HER2和HER3信號(hào)通路的拮抗劑，下調(diào)EGFR、 HER2、 HER3三種受體的表達(dá)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。H2EH3的分子量約為55.4 ku，大于腎小球的截留分子量(30～50 ku)，但小于抗體的分子量(～150 ku)，因此在體內(nèi)不易被截留。在乳腺癌異種移植模型中，經(jīng)靜脈或瘤內(nèi)給藥后，H2EH3高特異性結(jié)合乳腺癌細(xì)胞并抑制腫瘤生長(zhǎng)。

細(xì)胞上皮黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)是一種糖基化的1型膜蛋白。在正常上皮細(xì)胞中，EpCAM僅在基底外側(cè)間隙連接上低表達(dá)；而在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中，EpCAM的表達(dá)量高于正常細(xì)胞數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，且沿細(xì)胞膜分布。并且，EpCAM的連接能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。Lieberman研究團(tuán)隊(duì)[5]采用EpCAM核酸適配體作為靶頭，攜帶可促進(jìn)腫瘤新抗原表達(dá)(Upf2、 Parp1、 Apex1)，吞噬和抗原呈遞(Cd47)、減少檢查點(diǎn)抑制(Cd274)或?qū)е履[瘤細(xì)胞死亡(Mcl1)為靶點(diǎn)基因的siRNA，以敲除EpCAM+腫瘤細(xì)胞特定基因使腫瘤細(xì)胞更易被免疫系統(tǒng)察覺(jué)。EpCAM核酸適配體與siRNA的正義鏈5′端通過(guò)U—U—U linker共價(jià)連接形成核酸適配體-siRNA嵌合體。將嘧啶進(jìn)行2′氟修飾，siRNA的3′端連接兩個(gè)dTdT突出端，以增強(qiáng)其在體內(nèi)的穩(wěn)定性并降低脫靶效應(yīng)。該嵌合體基因沉默效果在三陰性乳腺癌、HER2+原位、轉(zhuǎn)移性和基因工程小鼠乳腺癌模型中都得到了驗(yàn)證。6種嵌合體中的4個(gè)(Upf2、 Parp1、 Cd47、 Mcl1)能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的功能。此外，多種混合嵌合體比單獨(dú)的嵌合體更有效，并能與抗PD-1檢查點(diǎn)抑制協(xié)同發(fā)揮作用?？偟膩?lái)說(shuō)，該核酸適配體-siRNA嵌合體為腫瘤免疫治療開(kāi)辟了新思路。

盡管核酸適配體-siRNA嵌合體能夠靶向傳遞并敲除目的基因，但是正常組織中的非特異性積累減少了病理組織中核酸適配體和siRNA的有效積累和釋放，這可能降低治療效果，產(chǎn)生不良影響，因此需要更精準(zhǔn)的siRNA釋放位點(diǎn)和可控的釋放時(shí)間節(jié)點(diǎn)。Huang等[14]提出了一種光觸發(fā)核酸適配體納米開(kāi)關(guān)用于siRNA傳遞的時(shí)空調(diào)控。該研究采用AS1411適配體與Polo樣激酶1(polo-like kinase 1, PLK1)siRNA的正義鏈3′端共價(jià)連接組成核酸適配體-siRNA嵌合體，用光敏感的寡核苷酸(photo-sensitive oligonucleotide, OliP)與AS1411配對(duì)以調(diào)節(jié)AS1411的空間結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，對(duì)siRNA的某些核苷酸的2′位進(jìn)行甲氧基修飾賦予siRNA核酸酶抗性。結(jié)果顯示，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，在沒(méi)有紫外光(ultraviolet, UV)照射的情況下，OliP與AS1411的配對(duì)阻斷了AS1411識(shí)別核仁素并介導(dǎo)的內(nèi)化功能，導(dǎo)致嵌合體無(wú)法有效進(jìn)入細(xì)胞誘導(dǎo)PLK1基因沉默；而在有UV的情況下，OliP被光降解使AS1411的靶向識(shí)別核仁素的功能重新激活，其基因沉默效率與單獨(dú)的核酸適配體-siRNA相當(dāng)。在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，接有OliP的核酸適配體-siRNA在沒(méi)有UV的情況下只有少量在腫瘤聚集；而在UV照射小鼠腫瘤的情況下，接有OliP的核酸適配體-siRNA在腫瘤富集的熒光強(qiáng)度甚至比單獨(dú)的核酸適配體-siRNA更強(qiáng)?？偟膩?lái)說(shuō)，該方法為復(fù)雜的生物系統(tǒng)中的精確有效傳遞提供了一個(gè)多功能且強(qiáng)大的平臺(tái)。

3 核酸適配體聯(lián)合納米載體靶向遞送siRNA

盡管核酸適配體-siRNA嵌合體在靶向遞送siRNA方面具有免疫原性低、易于化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)，但是低效的細(xì)胞質(zhì)傳遞、核內(nèi)體逃逸限制了其臨床轉(zhuǎn)化。將裝載有siRNA的納米載體結(jié)合核酸適配體用于靶向遞送siRNA有以下優(yōu)勢(shì)：首先，核酸適配體結(jié)合的納米載體能夠?qū)⑵溲b載的“貨物”特異性地聚集到靶細(xì)胞中；其次，納米載體可以穩(wěn)定地封裝siRNA，保護(hù)siRNA不被酶降解；再次，納米材料可以促進(jìn)siRNA的胞質(zhì)傳遞，并且可以改善siRNA的藥代動(dòng)力學(xué)，如延長(zhǎng)siRNA的血液循環(huán)；最后，納米材料可以融入額外的治療成分和探針以實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療和分子成像。目前已有大量研究聯(lián)合核酸適配體和納米材料遞送siRNA到特定的細(xì)胞/組織中。本章將主要介紹核酸適配體聯(lián)合脂質(zhì)體、天然生物膜囊泡、球形納米顆粒、RNA/DNA納米顆粒用于靶向遞送siRNA在設(shè)計(jì)和治療方面的最新進(jìn)展。

3.1 核酸適配體聯(lián)合脂質(zhì)體靶向遞送siRNA脂質(zhì)體是一種具有雙層結(jié)構(gòu)的球形囊泡，基于其優(yōu)越的生物相容性、生物降解性、低毒性、制備工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，常被作為載體被廣泛用于科學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)。Park等[15]在聚乙二醇化陽(yáng)離子脂質(zhì)體的雙分子層中插入疏水性的量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)用于實(shí)時(shí)成像，將治療性的siRNA(BCL-2和PKC-ι)與脂質(zhì)體絡(luò)合形成量子點(diǎn)脂質(zhì)納米載體(QD-lipid nanocarriers, QLs)，最后將EGFR核酸適配體偶聯(lián)到脂質(zhì)體上使其特異性靶向三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)。結(jié)果顯示，與非靶向的對(duì)照QLs相比，靶向EGFR的QLs顯示出對(duì)癌細(xì)胞更有效的基因沉默和增強(qiáng)的腫瘤成像。此外，同時(shí)將BCL-2和PKC-ιsiRNA裝載到靶向EGFR的QLs中，可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移?？偟膩?lái)說(shuō)，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，靶向EGFR的QLs表現(xiàn)出更強(qiáng)的體內(nèi)遞藥和治療效果，表明靶向EGFR的QLs可能是一種能同時(shí)用于TNBC的RNA干擾和熒光成像的治療載體。

盡管陽(yáng)離子脂質(zhì)體表現(xiàn)出較好的siRNA遞送效率，但是也存在許多局限性：如容易在血液中聚集，易被腎小球截留，易被帶負(fù)電的蛋白質(zhì)吸附。Fattal等[16]將魚精蛋白肽縮合的LUC2 siRNA裝載到聚乙二醇化脂質(zhì)體中，并通過(guò)進(jìn)一步酶解清除脂質(zhì)體的表面，然后將靶向CD44的核酸適配體與聚乙二醇化的磷脂結(jié)合，從而將核酸適配體嵌合到脂質(zhì)體上。其中魚精蛋白可以濃縮siRNA，以將其裝載到非陽(yáng)離子聚乙二醇化脂質(zhì)體中，實(shí)現(xiàn)較高的siRNA裝載量。CD44是一種跨膜蛋白，在黏附、遷移、增殖、運(yùn)動(dòng)和分化等多種細(xì)胞途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是許多腫瘤包括TBNC的生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，核酸適配體功能化的非陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)LUC2基因有較高沉默效率；在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，其有長(zhǎng)時(shí)間的抑制作用?？傊摲顷?yáng)離子脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)體內(nèi)表達(dá)CD44腫瘤細(xì)胞有效的基因沉默。

有效的溶酶體逃逸是目前核酸遞送系統(tǒng)亟待解決的問(wèn)題，由于腫瘤組織較正常組織pH值更低，pH響應(yīng)傳遞一直是核酸遞送領(lǐng)域非常有前景的方法之一。pH響應(yīng)型脂質(zhì)體是一種具有細(xì)胞內(nèi)靶向和控制藥物，如基因、核酸、肽、蛋白質(zhì)釋放的功能性脂質(zhì)體。其原理是：在低pH條件下，脂肪酯羧基質(zhì)子化形成六角晶相結(jié)構(gòu)——膜融合的主要機(jī)制。在核內(nèi)體形成后幾分鐘內(nèi)，進(jìn)入溶酶體之前，pH從7.4降低至5.3～6.3時(shí)，pH響應(yīng)型脂質(zhì)體膜發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，促使脂質(zhì)體膜與核內(nèi)體/溶酶體膜的融合，將包封的物質(zhì)導(dǎo)入胞質(zhì)及主動(dòng)靶向病變組織，從而避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除。Bhattacharya等[17]采用pH響應(yīng)的棕櫚酰同型半胱氨酸的雙脂質(zhì)，TPHC；天然兩親性脂質(zhì)，1, 2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)和基于膽固醇的雙陽(yáng)離子脂質(zhì)，C5C，按照一定的摩爾比(THPC ∶DOPE ∶C5C=1 ∶24 ∶8)制成pH響應(yīng)型脂質(zhì)體，然后將DY647標(biāo)記、膽固醇化的EpCAM核酸適配體嵌入到pH響應(yīng)型陽(yáng)離子脂質(zhì)的疏水層使其能夠選擇性地將基因傳遞給EpCAM過(guò)表達(dá)的癌癥干細(xì)胞，其中的熒光染料可幫助實(shí)時(shí)監(jiān)控其內(nèi)化途徑。結(jié)果顯示，該pH響應(yīng)型脂質(zhì)體可在一定程度上避免溶酶體降解并增加包封藥物的攝取量和穩(wěn)定性，有效地將包封物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)。

3.2 核酸適配體聯(lián)合天然生物膜囊泡靶向遞送siRNA外泌體(exosome)是直徑～100 nm的生物膜囊泡，相對(duì)較小的分子結(jié)構(gòu)，良好的生物相容性使其在藥物遞送領(lǐng)域富有巨大的潛力。近年來(lái)，已有許多研究將siRNA或小分子復(fù)合物融入到外泌體中用于治療癌癥等疾病，并取得了一定的療效。然而，由于外泌體缺乏靶向性和選擇性，這些外泌體可能會(huì)被其他細(xì)胞大量?jī)?nèi)化，從而導(dǎo)致其他副作用和不必要的浪費(fèi)。在外泌體表面修飾核酸適配體可以賦予其靶向性，從而降低這種副作用和不必要的浪費(fèi)。Xia等[18]將SIRT6 siRNA電轉(zhuǎn)入外泌體，通過(guò)巰基-馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)外泌體和E3核酸適配體的共軛連接。其中SIRT6基因的表達(dá)與前列腺癌的發(fā)展呈正相關(guān)，敲除SIRT6能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞株在體內(nèi)或體外的遷移；E3核酸適配體可特異性識(shí)別前列腺癌細(xì)胞而不識(shí)別正常細(xì)胞。結(jié)果顯示，無(wú)論是皮下腫瘤模型還是原位腫瘤模型，該載體都能夠有效敲除SIRT6基因抑制腫瘤的發(fā)展和遷移。Chen等[19]通過(guò)逐層自組裝的方式在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)來(lái)源的外泌體上修飾聚乙烯亞胺/聚乙二醇(polyethylenimine/polyethylene glycol, PEI/PEG)共聚物并偶聯(lián)核酸適配體-siRNA嵌合體，從基因水平來(lái)誘導(dǎo)移植中的免疫耐受。該研究首先將帶正電荷的PEI/PEG共聚物自組裝到帶負(fù)電的生物囊泡上，然后將靶向樹(shù)突細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素分子(dendritic cell-special intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintergrin, DC-SIGN)的核酸適配體-mTOR siRNA嵌合體偶聯(lián)到PEG上，構(gòu)建具有靶向性的外泌體遞藥系統(tǒng)。結(jié)果顯示，接有SIGN核酸適配體的外泌體大量被樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)化，內(nèi)化細(xì)胞的mTOR siRNA能夠抑制免疫應(yīng)答。此外，該遞藥體系還可以通過(guò)電轉(zhuǎn)的方法將microRNA-148a，microRNA-148b和microRNA-152導(dǎo)入外泌體中誘導(dǎo)人白細(xì)胞抗原-G(human leucocyte antigen-G, HLG-A)持續(xù)表達(dá)來(lái)介導(dǎo)免疫耐受。該遞藥系統(tǒng)中，SIGN核酸適配體能夠迅速誘導(dǎo)免疫耐受，內(nèi)化后的mTOR siRNA隨后抑制免疫應(yīng)答，microRNA能夠長(zhǎng)時(shí)間促進(jìn)HLA-G的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)免疫耐受。由于不同的RNA在不同的時(shí)間點(diǎn)發(fā)揮作用，因此該遞藥系統(tǒng)能夠維持移植中長(zhǎng)時(shí)間的免疫耐受。

雖然外泌體作為載體遞送核酸或小分子藥物具有安全、高效、循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，但是來(lái)源有限、產(chǎn)量低、獲取困難限制了其廣泛應(yīng)用。Pei等[20]通過(guò)擠壓的方法輕松獲得大量尺寸可控、生物均一性好的生物膜囊泡。在該生物膜囊泡上修飾AS1411核酸適配體可使該納米載體具有腫瘤靶向的能力。此外，通過(guò)孵育和膽固醇介導(dǎo)的方法可將阿霉素(doxorubicin, DOX)和P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)siRNA高效裝載到該生物膜囊泡上。其中P-gp是一種腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)驅(qū)動(dòng)的泵，可將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，是腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)的關(guān)鍵。結(jié)果顯示，該遞藥系統(tǒng)通過(guò)P-gp siRNA的基因沉默和DOX誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制成功克服了耐藥并協(xié)同殺傷了MDR腫瘤。這種基于紅細(xì)胞膜制成的納米囊泡遞藥系統(tǒng)為MDR腫瘤的協(xié)同靶向治療提供了新思路。

3.3 核酸適配體聯(lián)合球形多孔納米顆粒靶向遞送siRNA球形多孔納米是理想的藥物遞送納米結(jié)構(gòu)。介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles, MSNs)是一種比表面積大、孔隙大且孔徑可調(diào)的球形無(wú)機(jī)生物載體材料，其表面可以進(jìn)行各種化學(xué)修飾。基于其低細(xì)胞毒性和高載藥能力，已被大量研究作為藥物和siRNA的傳遞平臺(tái)。Xie等[21]將DOX裝載到修飾有巰基的MSNs中，隨后將AS1411和siTIE2的巰基與MSNs的巰基共價(jià)連接構(gòu)建了具有靶向和氧化還原響應(yīng)的遞藥系統(tǒng)MSN-SS-siTIE2/Apt@DOX。在該遞藥系統(tǒng)中，AS1411賦予MSNs靶向腫瘤細(xì)胞的能力，siTIE2能夠抑制TIE2基因的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；與此同時(shí)，AS1411和siTIE2兩種核酸可作為“門控開(kāi)關(guān)”調(diào)節(jié)MSNs中DOX的釋放，從而解決了DOX在體液循環(huán)中滲漏的問(wèn)題。當(dāng)MSN-SS-siTIE2/Apt@DOX被癌細(xì)胞攝取后，細(xì)胞內(nèi)高濃度的氧化還原分子，如谷胱甘肽會(huì)觸發(fā)siTIE2的釋放，隨即釋放DOX，從而抑制轉(zhuǎn)移性乳腺癌的遷移。

由于目前大部分球形多孔納米顆粒由不可降解的無(wú)機(jī)材料組成，阻礙了臨床應(yīng)用。Li等[22]以RNA為構(gòu)建塊，環(huán)糊精為黏合劑，通過(guò)滾環(huán)轉(zhuǎn)錄(rolling circle transcription, RCT)和獨(dú)特超分子介導(dǎo)的方法制備多孔R(shí)NA納米球。通過(guò)RCT生成的串聯(lián)、重復(fù)序列包含EpCAM核酸適配體和EpCAM siRNA。其中，多拷貝的EpCAM siRNA，解決了傳統(tǒng)載體siRNA裝載率低的問(wèn)題。RCT產(chǎn)物上的環(huán)糊精能夠有效促進(jìn)多孔納米結(jié)構(gòu)的形成，可裝載索拉非尼用于肝癌的治療。結(jié)果顯示，多孔納米球在核酸適配體的的幫助下特異性靶向并內(nèi)化到肝癌細(xì)胞中，然后被Dicer酶水解，釋放的siRNA和索拉非尼進(jìn)行協(xié)同治療。其協(xié)同效應(yīng)已在體外功能實(shí)驗(yàn)、皮下荷瘤小鼠和原位荷瘤小鼠模型中得到驗(yàn)證?；诨蛑委熍c化療協(xié)同作用的廣闊前景，以及多孔納米球中RNA和環(huán)糊精可以分別裝載各種不同類型的siRNA和小分子藥物，這種形式的生物多孔納米球?yàn)榘邢蜻f送特定腫瘤的藥物提供了廣闊的前景。

3.4 核酸適配體聯(lián)合RNA/DNA納米顆粒靶向遞送siRNA三聯(lián)節(jié)(three-way-junction, 3WJ)是源于噬菌體包裝RNA(packaging RNA, pRNA)中核心的一段，3個(gè)端點(diǎn)可分別連接靶向、治療、成像模塊[7]?；谄淞己玫臒崃W(xué)/化學(xué)穩(wěn)定性，常被用作傳遞siRNA等小分子的載體。Li等[23]利用2′氟修飾的3WJ作為納米材料的連接核心，在3WJ的兩端共價(jià)連接HER2核酸適配體和X-box結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)siRNA組裝成RNA納米粒子(8.54 ± 1.27 nm)。其中XBP1基因與HER2+乳腺癌化療敏感性與增殖有關(guān)。結(jié)果顯示，經(jīng)靜脈注射后，含HER2適配體的RNA納米粒子與腫瘤細(xì)胞有著較強(qiáng)的結(jié)合，而不與健康組織結(jié)合。并且能夠特異性敲除HER2+乳腺癌小鼠模型中XBP1基因，從而顯著抑制乳腺癌生長(zhǎng)，并促進(jìn)化療敏感性。

可編程DNA納米結(jié)構(gòu)是一類新型的生物相容性好、無(wú)毒的納米材料，可作為siRNA、蛋白的遞送載體，然而靶向能力不足和載藥效率較低限制了其廣泛使用。Qian等[24]以分步和自組裝的方式制作DNA納米柱來(lái)用于癌癥治療。一條核心DNA鏈(P1)與三條相同的外周PR鏈或PA鏈通過(guò)堿基配對(duì)相互作用形成三角形，兩個(gè)三角形進(jìn)一步折疊并自組裝成一個(gè)棱鏡結(jié)構(gòu)。PR鏈帶有一段懸垂與Rab26 siRNA互補(bǔ)，PA鏈中含有靶向MUC-1核酸適配體序列。其中Rab26蛋白參與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和高通透性，可作為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)；MUC1在許多癌癥細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)。在該項(xiàng)設(shè)計(jì)中，Rab siRNA和MUC-1核酸適配體的數(shù)量和位置可以通過(guò)切換PA鏈或PR鏈來(lái)輕松調(diào)整。所有具有不同功能的納米棱柱都以高產(chǎn)率自組裝，其自組裝的產(chǎn)率用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)得到了驗(yàn)證。并且，DNA納米棱柱的細(xì)胞攝取與每個(gè)納米棱柱上的核酸適配體數(shù)量成正比?？偟膩?lái)說(shuō)，所制備的DNA納米棱柱顯示出優(yōu)異的抗癌活性和靶向能力，可用于個(gè)性化的癌癥治療。

4 總結(jié)與展望

本綜述中總結(jié)了利用細(xì)胞特異性核酸適配體靶向遞送siRNA在設(shè)計(jì)和應(yīng)用方面最新進(jìn)展。核酸適配體-siRNA嵌合體設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)單，但在血液中快速清除、酶降解一直是其向臨床轉(zhuǎn)化的一大障礙。目前，研究者已進(jìn)行了大量研究來(lái)探索改善核酸適配體-siRNA嵌合體的藥代動(dòng)力學(xué)特性。采用PEG與核酸適配體結(jié)合能顯著增強(qiáng)核酸適配體-siRNA嵌合體的循環(huán)半衰期并增強(qiáng)酶穩(wěn)定性。此外，PEG的結(jié)合可以增加核酸適配體-siRNA嵌合體的生物利用度，并降低其體內(nèi)的免疫反應(yīng)；利用化學(xué)修飾，如2′-氟，2′-甲氧基等修飾核酸適配體骨架中核糖或脫氧核糖的2′位氫可以抵抗核酸酶。

利用核酸適配體-siRNA嵌合體靶向遞送siRNA時(shí)，siRNA活性的降低也是限制其廣泛應(yīng)用的一大問(wèn)題。有研究表明[25]，siRNA的熱穩(wěn)定性是影響其基因沉默效率的一個(gè)重要參數(shù)。低熔點(diǎn)的siRNA與核酸適配體結(jié)合時(shí)，其活性不受影響或受影響最小。并且，當(dāng)siRNA偶聯(lián)到2′-氟修飾核酸適配體的3′端時(shí)，siRNA的活性受影響最小。雖然化學(xué)修飾有助于增強(qiáng)siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，但合理的化學(xué)修飾仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。找到每個(gè)核酸適配體-siRNA嵌合體的最優(yōu)化修飾，使其治療效果最大化至關(guān)重要。未來(lái)的研究方向可借助強(qiáng)大的計(jì)算算法來(lái)幫助選擇高度特異性的適配體-siRNA嵌合體的組成和化學(xué)修飾。

當(dāng)siRNA被靶細(xì)胞或靶組織內(nèi)化后，不良的溶酶體逃逸仍然是限制其發(fā)揮基因沉默作用的主要原因。目前，研究者已采用了多種方法來(lái)增強(qiáng)siRNA的溶酶體逃逸。如應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”或pH響應(yīng)型脂質(zhì)體[17]可有效增強(qiáng)siRNA的溶酶體逃逸；通過(guò)脂質(zhì)體裝載魚精蛋白壓縮的siRNA從而增大siRNA的溶酶體逃逸量[16]。采用天然生物膜囊泡遞送siRNA也能夠?qū)崿F(xiàn)有效的溶酶體逃逸[19-20]。

由于有關(guān)核酸適配體的毒理學(xué)信息有限，其潛在的毒副作用及其作用機(jī)制尚未完全闡明。如高濃度的核酸可能引起一些潛在的毒性反應(yīng)，包括非特異性組織積累、非特異性免疫反應(yīng)等。未來(lái)應(yīng)對(duì)核酸適配體-siRNA嵌合體以及核酸適配體結(jié)合的納米載體的生物安全性進(jìn)行評(píng)估，以便更好地向臨床轉(zhuǎn)化。總的來(lái)說(shuō)，該綜述概述了核酸適配體靶向遞送siRNA在疾病治療中的設(shè)計(jì)策略及其應(yīng)用的最新研究進(jìn)展。

(作者貢獻(xiàn)：呂子陽(yáng)負(fù)責(zé)文章的文獻(xiàn)調(diào)研、起草、撰寫及修改；任歡歡負(fù)責(zé)校對(duì)全文；聶盛丹和王珊負(fù)責(zé)論文選題、指導(dǎo)及作批評(píng)性審閱。

利益沖突：該文所有作者均聲明不存在利益沖突。)