人參單體皂苷藥性(氣)評價(jià)方法研究

張曉桐, 劉雪瑩, 劉琳琳, 冉小庫, 竇德強(qiáng)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116600)

中藥藥性理論是中藥最重要的基本理論之一,目前對中藥單體有效成分藥性的研究仍不完善,結(jié)合早期學(xué)者提出的“藥性分子假說”中對有效成分藥性的闡釋[1],以及其后匡海學(xué)等[2]提出的“中藥性味理論新假說”中提倡的從有效成分層面探討中藥藥性,基于以上假說和思想,我們推測作為人參屬中藥中主要有效成分的人參單體皂苷也應(yīng)該具有各自相應(yīng)的藥性(氣),并期望建立出人參單體皂苷的藥性(氣)評價(jià)方法。考慮到臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)分析中藥藥性對機(jī)體的生理功能有不同作用,本實(shí)驗(yàn)室前期對中藥藥性與細(xì)胞增殖關(guān)系的研究[3],以及研究者對中藥藥性與能量代謝關(guān)系的研究[4],本研究擬通過進(jìn)行人參單體皂苷與藥性相關(guān)性分析,并測定人參皂苷對人肝細(xì)胞LO2與豬大腦皮層Na+/K+-ATPase活力影響來評價(jià)人參單體皂苷藥性。若本研究結(jié)果與中醫(yī)臨床理論一致,與現(xiàn)有研究成果一致,即溫?zé)崴幮缘娜藚误w皂苷呈興奮作用,寒涼藥性的人參單體皂苷呈抑制作用,則表明該評價(jià)方法可行,從而提出人參單體皂苷的藥性(氣)評價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑人肝細(xì)胞LO2(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；豬大腦皮層ATPase(批號：SLBN7649V 美國Sigma)；人參皂苷R-Rg3、Ro、Rb1、Rd、Re、Rg1、F11、Rf、Rb2、Rb3、Rc、Rg2、Rh1、三七皂苷R1和齊墩果酸(OA)均為本實(shí)驗(yàn)室分離自制,純度均>95%；R-Rh2(批號：HG027746198 寶雞市辰光生物科技有限公司)；去乙酰毛花苷注射液(批號：161105上海禾豐制藥有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(批號：1117X0514北京Solarbio公司)；二甲基亞砜(批號：520C0313 美國SIGMA公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(批號：8117244美國Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶(批號：1860129 美國Gibco公司)；胎牛血清(批號：1050B5061 上海李記生物科技有限公司)；雙抗(批號：J160035美國Hyclone公司)；PBS磷酸鹽緩沖液(批號：1016K022 北京Solarbio公司)；超微量Na+/K+-ATPase試劑盒(批號：20180529南京建成)；總ATPase試劑盒(批號：20171219南京建成)；蛋白定量試劑盒(批號：20180504南京建成)

1.2 儀器可調(diào)式移液器(美國RAININ公司)；KQ-250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2100 紫外分光光度計(jì)(上海UNICO公司)；HH-S型電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；NU-4750型CO2培養(yǎng)箱(美國NUAIRE公司)；HD2-BCN-1360B生物潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；AE31EF型倒置顯微鏡(Motic公司)；Caretium酶標(biāo)儀(深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司)；U570-86 Premium系列超低溫冰箱(-80 ℃)(美國NBS公司)；TDZ4-WS低速臺式離心機(jī)(湘儀離心機(jī))；濾器(0.22 μm)(Millex.GP)；96孔無菌培養(yǎng)板(Corning公司)；6孔無菌培養(yǎng)板(Corning公司)；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)

1.3 主要試劑的配制(1)10% RPMI1640培養(yǎng)液：取適量RPMI1640培養(yǎng)基,并加入1%雙抗和10%于56 ℃滅活胎牛血清,0.22 μm濾膜過濾,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)MTT溶液：稱取50 mg MTT,用10 mL的PBS(pH 7.4,0.01 mol·L-1)將MTT溶解,用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌,分裝,-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?3)待測液的配制：各單體皂苷儲備液采用DMSO配置,-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 利用雙變量相關(guān)分析評價(jià)人參皂苷藥性(氣)通過檢索關(guān)于三七、紅參、人參、西洋參、人參葉皂苷含量測定相關(guān)文獻(xiàn)[5-6],收集整理5種中藥中Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rg2、Rf、Ro、Rg3、F11、R1含量數(shù)據(jù),依據(jù)中國藥典中含量測定項(xiàng)下規(guī)定,剔除不滿足藥典規(guī)定樣品,得出滿足藥典規(guī)定的每種中藥各十批樣品中皂苷類成分含量數(shù)據(jù)(Tab 1)。同時(shí)將藥性賦值[7],即寒-2、涼-1、微溫0.5、溫1。將藥性屬性由寒到溫依次從小到大編秩,相同藥性秩次X相加求平均值得秩次Y,如Tab 2所示,將各藥材皂苷含量及藥性錄入SPSS 17.0軟件,做雙變量相關(guān)分析,得出藥性(氣)與各皂苷含量之間相關(guān)性。

Tab 1 Content data of ginsenosides in Panax notoginseng, red ginseng, ginseng, American ginseng and ginseng leaves

Tab 2 Assign value by characteristics

1.5 利用灰色關(guān)聯(lián)度法評價(jià)人參皂苷對人參屬五種中藥藥性(氣)的貢獻(xiàn)為評價(jià)各成分貢獻(xiàn)大小,原始數(shù)據(jù)的變換采用初值化變換法。以中藥藥性賦值作為母序列(賦值分別為寒-2、涼-1、微溫0.5、溫1),中藥中各批次的成分含量作為子序列。按照灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算方法計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度。

1.6 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測不同藥性的人參屬五種常用中藥對于代謝通路的調(diào)節(jié)作用

1.6.1人參屬五種常用中藥主要活性成分提取 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP (http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php),以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為閾值對結(jié)果進(jìn)行篩選,分別查找5種中藥的主要活性成分及與主要活性成分相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。

1.6.2人參屬五種常用中藥中皂苷成分提取 利用數(shù)據(jù)庫TCMSP,分別查找5種中藥中皂苷成分及與其相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。

1.6.3人參屬五種常用中藥靶點(diǎn)預(yù)測 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction (http：//www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫,將1.6.2項(xiàng)下獲得的活性成分轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)SMILES格式,導(dǎo)入平臺分析,設(shè)置屬性為“homo sapiens”,將靶點(diǎn)概率值不小于0的分子作為該成分有效靶點(diǎn)。

1.6.4KEGG通路富集分析 利用R 3.6.3 (https：//www.r-project.org)軟件中Bioconductor (org.Hs.eg.db)合集對各藥材不同蛋白模塊的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號通路富集分析,分別得到五種中藥所涉及的代謝通路。在此基礎(chǔ)上,通過對比去重的方法剔除寒涼、溫性中藥共同涉及的代謝通路,得到寒涼性中藥和溫性中藥的特異性代謝通路。

1.7 人參皂苷對人肝細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATPase活力調(diào)控作用研究利用MTT法篩選對細(xì)胞無抑制作用人參皂苷濃度進(jìn)行Na+/K+-ATPase活力測定,取對數(shù)生長期人肝細(xì)胞LO2,以1×108·L-1密度將其接種于6孔培養(yǎng)板上,每孔2 mL,置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h待細(xì)胞貼壁后,更換新鮮培養(yǎng)液。分別加入含終質(zhì)量濃度分別為1、10 μmol·L-1含人參皂苷R-Rg3、S-Rg3、Re、Rb1、Rg1、Rd、OA、Ro 和PPT 的培養(yǎng)液,空白對照組只加培養(yǎng)液,每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。將各處理組細(xì)胞用0.25%胰酶消化,1 000 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞,生理鹽水洗2遍以除掉殘留的培養(yǎng)液或磷酸緩沖鹽溶液,棄上清,留下層細(xì)胞,用生理鹽水制備109-1010·L-1的細(xì)胞懸液(500 μL),經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎機(jī)破碎細(xì)胞后(功率10%,4 s/次,間隔8 s,重復(fù)8～10次),按照Na+/K+-ATPase試劑盒說明書進(jìn)行測定,同時(shí)采用BCA法檢測細(xì)胞總蛋白濃度。

1.8 人參皂苷對豬大腦皮層ATPase活力調(diào)控作用研究分別將終蛋白濃度為12.5 mg·L-1的豬大腦皮層ATP酶與終濃度為100、10、1、0.1 μmoL·L-1的 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、R-Rg3、R-Rh2、Ro、Re、Rg1、、Rf、Rg2、Rh1、三七皂苷R1、Deslanoside和齊墩果酸(OA)溶液混合后制成待測樣本,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù),按照Na+/K+-ATPase試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.9 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用2016 OFFICE EXCEL按照試劑盒說明書中公式進(jìn)行計(jì)算后采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用One-Way ANOVA進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 雙變量相關(guān)分析結(jié)果及灰色關(guān)聯(lián)度法評價(jià)結(jié)果當(dāng)Kendall相關(guān)系數(shù)>0時(shí)表明與溫?zé)崴幮韵嚓P(guān),Kendall相關(guān)系數(shù)<0則與寒涼藥性相關(guān)(Tab 3)。其中與溫?zé)崴幮韵嚓P(guān)的人參皂苷的相關(guān)程度順序?yàn)镽f>R1>Rg3>Rg2>Rb1>Ro,與寒涼藥性相關(guān)的人參皂苷的相關(guān)程度順序?yàn)镽b2>Re>Rd>F11,另外Rg1、Rc與寒熱藥性無顯著性相關(guān),可能為平性。灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果表明,人參皂苷含量對人參屬中藥藥性的貢獻(xiàn)程度為F11>Re>Rg2>Rd>Rb2>Rb1>Rg1>Rc>Rg3>R1>Rf>Ro。

Tab 3 Bivariate correlation analysis results and grey correlation analysis results

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測不同藥性的人參屬五種常用中藥對于代謝通路的調(diào)節(jié)作用檢索數(shù)據(jù)庫TCMSP,共篩選到三七成分20個(gè),紅參19個(gè),人參41個(gè),西洋參27個(gè),人參葉33個(gè)。經(jīng)過KEGG信號通路富集分析,并對結(jié)果對比去重后,分別得到溫性和寒涼性藥物組特異性代謝通路27個(gè)和13個(gè)。由Fig 1～2可知,性溫的三七與紅參及性微溫的人參與AMPK信號通路、ErbB信號通路、FoxO信號通路與MAPK信號通路等相關(guān),而性涼的西洋參與性寒的人參葉參與鈣信號通路、NOD樣受體信號通路與VEGF信號通路等相關(guān)。其中AMPK信號通路與ATP的生成與消耗相關(guān),而ATPase在物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳遞和能量代謝等方面起著重要作用,隨著Na+-K+-ATPase活力增加,能量消耗和熱量產(chǎn)生也隨之增加,因此進(jìn)一步肯定了可以通過測定Na+-K+-ATPase活力評價(jià)藥性。

2.3 人參皂苷對人肝細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATPase活力調(diào)控結(jié)果由Fig 3B可知,人參皂苷Rg3、Re、Rd與Ro對肝細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATPase活力呈抑制作用,可能為寒涼藥性,人參皂苷Rb1、Rg1對其呈促進(jìn)趨勢,可能為溫?zé)崴幮?而OA對其無明顯作用,可能為平性。但考慮到Rg3與Ro的抑制作用可能與其細(xì)胞毒性有關(guān)(Fig 3A),細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATPase活力評價(jià)藥性有一定局限性,則后續(xù)利用市售豬大腦皮層ATPase對人參單體皂苷藥性進(jìn)行評價(jià)。

2.4 人參皂苷對豬大腦皮層Na+/K+-ATPase活力調(diào)控結(jié)果以去乙酰毛花苷(Deslanoside)為陽性對照,由Fig 4可知,Deslanoside能有效抑制豬大腦皮層Na+/K+-ATPase活力,證實(shí)該酶活力正常。在0.1 ～100 μmol·L-1濃度范圍內(nèi),人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rf、Rg2、Rg1與Rh1能夠增強(qiáng)Na+/K+-ATPase活力,而Rg3、R1與Ro在0.1 μmol·L-1時(shí)能夠增強(qiáng)Na+/K+-ATPase活力,但隨著濃度升高表現(xiàn)出抑制的作用。人參皂苷Rb2、Rd、Rh2、Re及OA均具有抑制Na+/K+-ATPase活力的作用,且隨著濃度增高,抑制作用增強(qiáng)。

Fig 1 Effective components of warm ginseng traditional Chinese medicine - key targets - pathway diagram

Fig 2 Effective components of cold ginseng traditional Chinese medicine - key targets-pathway map

Fig 3 Effect of ginsenoside on proliferation of human hepatocytes(A),and effect of ginsenoside on Na+/K+-ATPase activity in human hepatocytes (B)

Fig 4 Effect of ginsenoside on Na+/K+-ATPase activity in porcine cerebral cortex

Fig 5 Average content of saponins in Panax notoginseng, red ginseng, ginseng, American ginseng and ginseng leaves

基于該實(shí)驗(yàn)評價(jià)人參皂苷藥性規(guī)律為,溫?zé)崴幵诘蜐舛葪l件下增強(qiáng)Na+/K+-ATPase活力,隨著濃度升高,其對Na+/K+-ATPase活力的影響可能表現(xiàn)為增強(qiáng)或抑制,而寒涼藥無論在何種濃度下,均抑制Na+/K+-ATPase活力。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)雙變量相關(guān)分析結(jié)果表明，與溫?zé)岷秃疀鏊幮韵嚓P(guān)皂苷的相關(guān)程度分別為Rf>R1>Rg3>Rg2>Rb1>Ro和 Rb2>Re>Rd>F11?；疑P(guān)聯(lián)度分析結(jié)果表明，其貢獻(xiàn)程度順序?yàn)镕11>Re>Rg2>Rd>Rb2>Rb1>Rg1>Rc>Rg3>R1>Rf>Ro。對Na+/K+-ATPase活力影響結(jié)果表明人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rf、Rg2、Rg1、Rh1、Rg3、R1和Ro藥性呈現(xiàn)為溫?zé)?能增強(qiáng)Na+/K+-ATPase活力,人參皂苷Rb2、Rd、Rh2、Re和齊墩果酸藥性呈現(xiàn)為寒涼,能抑制Na+/K+-ATPase活力。

現(xiàn)有諸多文獻(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、機(jī)體物質(zhì)代謝以及抗感染、抗腫瘤等方面均反映出各人參單體皂苷成分的藥性。通常溫?zé)崴幮缘娜藚误w皂苷對機(jī)體能量、物質(zhì)代謝呈促進(jìn)作用,寒涼藥性則呈抑制作用。現(xiàn)有研究表明，三七皂苷R1能通過恢復(fù)凋亡相關(guān)基因BAX與BCL2的平衡,保護(hù)大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞免于過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡作用,人參皂苷Rg2能通過海馬BDNF信號通路興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而發(fā)揮抗抑郁作用,Rf能有效緩解大鼠神經(jīng)性疼痛的痛覺過敏反應(yīng)中抑郁表現(xiàn)[8],反映出三七皂苷R1與人參皂苷Rg2、Rf溫?zé)岬乃幮浴g3能調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞增殖周期[9]。Ro 能劑量依賴性地增加急性運(yùn)動挑戰(zhàn)后的握力和耐力游泳時(shí)間,顯著增加總蛋白、葡萄糖水平與腓腸肌糖原含量。Rf能顯著提高肝臟載脂蛋白A-Ⅰ和C-Ⅲ mRNA的基礎(chǔ)水平[10]。人參皂苷Rb1能夠通過增強(qiáng)術(shù)后疲勞綜合征大鼠骨骼肌中Na+-K+-ATPase和SDH的活性改善能量代謝[11],人參皂苷Rb3可提高SOD、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力,對大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血起明顯保護(hù)作用[12]。這種對能量代謝與物質(zhì)代謝各種酶和產(chǎn)物的上調(diào)作用反映了Rg3、Ro、Rf、Rb1與Rb3的溫?zé)崴幮浴Ｈ藚⒃碥誖d、Re對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖表現(xiàn)為抑制,為寒涼藥性,而人參皂苷Rc的抑制作用不明顯[13],從側(cè)面反映出Rc并非寒涼藥性,結(jié)合Na+-K+-ATPase實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Rc可能為溫?zé)崴幮?。而人參皂苷Rg1對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有治療作用,影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長和神經(jīng)干細(xì)胞分化等,也表現(xiàn)為溫?zé)崴幮訹14]。Rh2能通過抑制Na+/K+- ATPase促進(jìn)血液循環(huán)[15],Rd能通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的受體調(diào)控性及鈣通道介導(dǎo)的鈣內(nèi)流降低血壓[16],還能減少ROS的生成從而減輕過氧化氫對星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷,表現(xiàn)為寒涼藥性。此外,Rb2能降低總膽固醇,游離膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯水平及中樞鎮(zhèn)靜作用。Re能夠顯著抑制人宮頸癌細(xì)胞的增殖,降低細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶,琥珀酸脫氫酶,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶的活性。這些對物質(zhì)代謝的抑制作用可能與Rb2、Re藥性寒涼有關(guān)。以上文獻(xiàn)表明,三七皂苷R1與人參皂苷Rg2、Rf、Rg3、Ro、Rf 、Rb1與Rb3藥性溫?zé)?而Rh2、Rd、Rb2與Re藥性寒涼,該分析結(jié)果與本研究結(jié)論相符,進(jìn)一步從現(xiàn)有文獻(xiàn)的研究結(jié)果角度佐證了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性,也說明了本評價(jià)方法有一定的可行性和客觀性。

另外,通過計(jì)算5種中藥中人參皂苷平均含量,發(fā)現(xiàn)三七中Rg1、Rb1及三七皂苷R1含量較高；而紅參中主要含有Rg1、Rb1、Re及稀有皂苷Rg3等[17]；人參中主要皂苷含量Rb1>Rg1>Re；西洋參中主要皂苷含量Rb1>Re>Rd>Rg1,其Rg1含量遠(yuǎn)低于人參[18]；人參葉中主要含有Re、Rg1、Rd與Rb2,其中Re濃度較高(Fig 5)。另外根據(jù)《中國藥典》中含量測定標(biāo)準(zhǔn),并結(jié)合相關(guān)分析與人參皂苷對Na+/K+-ATPase活力影響結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)三七性溫可能與溫?zé)崴幮燥@著相關(guān)的Rb1和R1以及能夠促進(jìn)Na+/K+-ATPase活力的Rg1有關(guān),紅參性溫可能與Rb1、Rg1有關(guān),人參藥性可能與高含量的溫?zé)崴幮燥@相關(guān)的Rb1和促進(jìn)Na+/K+-ATPase活力的Rg1及相對含量較低的與寒涼藥性顯著相關(guān)的Re有關(guān),故表現(xiàn)為微溫。此外紅參中含有的稀有皂苷,如Rg3與溫?zé)崴幮燥@著相關(guān),故紅參溫性強(qiáng)于人參。西洋參性涼可能與高含量的寒涼藥性顯著相關(guān)的Re、Rd及與溫?zé)崴幮燥@著相關(guān)的Rb1有關(guān),其中Re與Rd在灰色關(guān)聯(lián)度中對藥性的貢獻(xiàn)程度均較高。而人參葉性寒可能與高濃度的與寒涼藥性顯著相關(guān)的Re、Rd與Rb2有關(guān)。因此可知溫?zé)崴幮匀藚僦兴幹泻琑b1、Rg1、R1較多,而寒涼藥性人參屬中藥中含Rb2、Rd、Re較多。以上結(jié)果一方面與匡海學(xué)等人提出的中藥性味可拆分性、可組合性理論相符合,進(jìn)一步作證了中藥單體成分與單味藥相類似的也具有對應(yīng)的藥性,并且其含量對人參屬各中藥的藥性產(chǎn)生一定影響,另一方面與本研究的結(jié)果相一致,說明本研究實(shí)現(xiàn)了從有效成分層面分析中藥藥性,為中藥藥性理論做出進(jìn)一步補(bǔ)充。

綜合以上結(jié)果,人參皂苷的藥性(氣)評價(jià)可以利用Na+/K+-ATPase活力結(jié)合人參皂苷含量與中藥藥性相關(guān)性分析,該方法具有一定可行性。