有機(jī)磷農(nóng)藥/有機(jī)磷神經(jīng)性毒劑的蛋白加合物及其加合機(jī)制研究進(jìn)展

王 瑾,孫鳳娟,王 飛,王紅梅,高潤(rùn)利

(1.國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205; 2.陸軍裝備部裝備項(xiàng)目管理中心，北京 100072)

有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides，OPP)和有機(jī)磷神經(jīng)性毒劑(organophosphorus nerve agents，OPNAs)屬于有機(jī)磷領(lǐng)域中重要的兩類(lèi)化合物，主要通過(guò)不可逆抑制膽堿酯酶(cholinesterase，ChE)活性，使神經(jīng)突觸內(nèi)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)過(guò)度蓄積，神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)功能受損，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的毒害作用。OPP的毒性較低，因具有高效、便宜、對(duì)植物安全等優(yōu)勢(shì)，用于殺蟲(chóng)、滅菌、除草等。OPNAs是由OPP發(fā)展而來(lái)的具有速效致死性的膦酸酯類(lèi)物質(zhì)，典型代表有G類(lèi)毒劑，如塔崩(GA)、沙林(GΒ)、梭曼(GD)、環(huán)沙林(GF)和V類(lèi)毒劑，如維?？怂?VX)，這些毒劑曾作為化學(xué)武器被應(yīng)用于一戰(zhàn)、二戰(zhàn)和多次恐怖活動(dòng)中[1-2]。

OPP和OPNAs可以通過(guò)呼吸道、皮膚黏膜、眼睛、胃腸道等多種途徑進(jìn)入生物體，經(jīng)過(guò)迅速的分布、代謝，最終以原體、代謝物、蛋白質(zhì)加合物3種形式存在，并對(duì)生物體的健康產(chǎn)生短期或長(zhǎng)期的影響，包括:①急性膽堿能毒性：蓄積的ACh對(duì)膽堿能受體(煙堿受體和毒蕈堿受體)過(guò)度刺激所產(chǎn)生的縮瞳、流涎、心動(dòng)過(guò)急或過(guò)緩等癥狀；②中間綜合征：急性或重度的OP中毒引發(fā)的神經(jīng)肌肉接頭功能障礙，如呼吸肌、骨骼肌麻痹；③遲發(fā)性神經(jīng)病(organophosphate delayed neuropathy，OPIDN)：?jiǎn)未位蚍磸?fù)暴露于OP毒物導(dǎo)致的遲發(fā)性中央-外周遠(yuǎn)端感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)多神經(jīng)病，有感覺(jué)障礙、共濟(jì)失調(diào)、肌無(wú)力等表現(xiàn)；④慢性神經(jīng)毒性：?jiǎn)未渭毙曰蚨啻蔚蛣┝勘┞队贠P毒物所引發(fā)的慢性神經(jīng)行為改變，如學(xué)習(xí)記憶能力下降、情感障礙等[3]。

鑒于OPP/OPNAs的原體、代謝物在生物體內(nèi)有穩(wěn)定性差、存續(xù)時(shí)間短、降解速度快等諸多不足，OP毒性機(jī)制的研究焦點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移至蛋白加合物。本文將諸多研究中涉及到的靶標(biāo)蛋白分為兩類(lèi)：內(nèi)源性清道夫(丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase，BChE)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白)和低劑量毒性的相關(guān)蛋白(細(xì)胞骨架蛋白、神經(jīng)病靶標(biāo)酯酶、泛素)，綜述OPP/OPNAs與這些靶蛋白之間的共價(jià)加合物、加合反應(yīng)機(jī)理、活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，旨在為OP毒物的確認(rèn)暴露、溯源歸因、精準(zhǔn)治療、合理預(yù)防等提供新的研究思路。

1 OPP/OPNAs中毒機(jī)制

OPP/OPNAs對(duì)生物體產(chǎn)生急性毒性作用的原因是AChE的活性被抑制。AChE主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸內(nèi)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)肌肉連接處，少量與血液中紅細(xì)胞的膜結(jié)合。它能夠快速水解神經(jīng)遞質(zhì)ACh，終止ACh對(duì)突觸后膜的興奮作用，從而保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞[4]。此過(guò)程依賴(lài)于AChE的活性位點(diǎn)：催化三聯(lián)體(Ser203-His447-Glu334)和外周陰離子位點(diǎn)，底物ACh的季銨離子通過(guò)靜電作用結(jié)合在AChE的陰離子結(jié)合位點(diǎn)，其羰基碳與AChE的絲氨酸殘基Ser203的羥基相互作用，經(jīng)乙酰化和去乙?；h(huán)水解ACh[5]。

作為ACh水解過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，OPP和OPNAs是AChE的高效抑制劑。OPP/OPNAs進(jìn)入生物體后，磷原子與絲氨酸側(cè)鏈的羥基共價(jià)結(jié)合生成磷/膦?；腁ChE，使AChE喪失水解ACh的功能。與乙?；腁ChE能夠快速水解不同，磷/膦酰化的AChE的水解非常緩慢，致使AChE的活性受到抑制，ACh在體內(nèi)過(guò)度蓄積并持續(xù)作用于膽堿能受體：毒蕈堿和煙堿受體，超過(guò)50%的AChE被抑制后會(huì)出現(xiàn)膽堿能危象，如嘔吐、腹痛、腹瀉、瞳孔縮小、多汗、流涎、心率減慢、肌肉痙攣等，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡[6]。

不同物種間或同一物種的不同部位間的AChE具有高度保守性，OP毒物對(duì)AChE的抑制作用與物種、年齡無(wú)關(guān)。OPP/OPNAs進(jìn)入生物體后會(huì)迅速分布于各個(gè)器官如腦、肺、心、肝、腎，并穩(wěn)定存在，其中肺的攝取率最高，這似乎間接解釋了為什么OP患者中毒死亡的直接原因是呼吸衰竭。此外，研究發(fā)現(xiàn)OP毒物的體循環(huán)量與AChE的濃度呈負(fù)相關(guān)，循環(huán)量過(guò)高會(huì)誘發(fā)膽堿能綜合征，伴有呼吸窘迫、高血壓等癥狀[7]。同時(shí)，神經(jīng)元的鈣瞬變?cè)黾雍外}的高表達(dá)會(huì)造成神經(jīng)元過(guò)度活化，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，出現(xiàn)癲癇或永久性認(rèn)知障礙。磷/膦?；腁ChE的重活化有兩種途徑：歷經(jīng)緩慢的自發(fā)水解或活化劑的重活化。肟類(lèi)重活化劑能夠復(fù)能磷/膦?；疌hE，與蓄積的ACh競(jìng)爭(zhēng)膈肌煙堿型乙酰膽堿受體，從而保護(hù)呼吸肌纖維免受OP毒物的損傷[8-9]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)其有擬膽堿酯酶作用，可水解ACh，但也存在諸多局限性：① 重活化作用具有選擇性：對(duì)敵敵畏、對(duì)硫磷、甲胺磷等中毒酶有較好的重活化作用，而對(duì)樂(lè)果、敵百蟲(chóng)和馬拉硫磷等中毒酶的重活作用較差，GD中毒酶的重活效果更差[8]；② OP-AChE老化后AChE的活性不能再恢復(fù)，OPP/OPNAs與絲氨酸殘基之間的共價(jià)加合物易發(fā)生脫烷基形成單陰離子加合物，與OP毒物的磷原子上的取代基帶電性一致，阻礙了AChE的再活化進(jìn)程；③ 常見(jiàn)的肟類(lèi)藥物為季銨化合物，不易透過(guò)血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，僅對(duì)外周組織中的AChE有重活化效果；④ 腎排泄快，需根據(jù)病情和半衰期重復(fù)給藥。目前，最有效的活化劑是親核吡啶鎓肟，但吡啶鎓環(huán)中的季氮原子帶有的永久性的正電荷會(huì)阻止肟穿過(guò)BBB，無(wú)法恢復(fù)大腦正常的膽堿能功能。研究發(fā)現(xiàn)[9]，叔肟單異亞硝基丙酮能激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的AChE，治療后患者具有更高的存活率和更低的發(fā)病率，但具體的活化作用還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

2 內(nèi)源性清道夫

在生物體內(nèi)有這樣的一類(lèi)蛋白：OPP/OPNAs的磷/膦?；揎椝坪醪](méi)有對(duì)其造成明顯的不良影響，它依舊保持最初的生物學(xué)功能，參與機(jī)體正常的代謝過(guò)程。隨著蛋白的自身降解，有毒的OPP/OPNAs排出體外，這類(lèi)蛋白包括BChE、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等，屬于內(nèi)源性清道夫，通過(guò)與OPP/OPNAs共價(jià)結(jié)合來(lái)幫助機(jī)體清除毒物。對(duì)這些內(nèi)源性清道夫的加合物進(jìn)行研究，深入理解其加合位點(diǎn)、作用機(jī)制、周?chē)h(huán)境，對(duì)OP毒性的預(yù)防和抗OP毒性藥物的研發(fā)具有一定的啟示作用。

2.1 OPP/OPNAs與BChE的加合反應(yīng)BChE主要分布于血清和肝臟中，肌肉和腦組織中也有少量存在[10]。因同屬于絲氨酸水解酶家族，BChE與AChE具有相似的結(jié)構(gòu)特征：氨基酸序列的高度同源性、活性部位催化三聯(lián)體(Ser198-His438-Glu325)和外周陰離子部位、相似的三維結(jié)構(gòu)、具有芳香氨基酸殘基。BChE催化水解丁酰膽堿(butyrylcholine，BCh)，其絲氨酸的羥基攻擊BCh的羰基碳，與丁?；矁r(jià)結(jié)合并釋放膽堿，隨后丁?；杆忉尫哦∷?，BChE恢復(fù)活性。

OPP/OPNAs對(duì)BChE的抑制作用與AChE類(lèi)似，即OP毒物的磷原子與Ser198的羥基共價(jià)結(jié)合生成OP-BChE加合物。不同的是，OP-BChE加合物僅起到中和毒物的作用，對(duì)機(jī)體沒(méi)有任何不良影響。研究表明，BChE與OP毒物的結(jié)合速率比AChE高，因血液中的高豐度、較長(zhǎng)的半衰期、高反應(yīng)性以及顯著的排毒功效，BChE被認(rèn)為是最有效的生物清除劑，而人血漿中BChE的濃度約50nmol/L，不足以抵消高濃度的OPP/OPNAs。因此，OP毒性的防治常常采用外源性的BChE來(lái)實(shí)現(xiàn)[11]。此外，BChE也能催化水解ACh，但由于底物特異性和水解能力的差異性，反應(yīng)進(jìn)行緩慢。當(dāng)AChE活性受到抑制時(shí)，BChE能代替AChE水解突觸后膜上過(guò)量的ACh或參與調(diào)節(jié)突觸前膜ACh的釋放過(guò)程。不足的是，這一過(guò)程只存在于周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中，無(wú)法降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ACh的含量，故AChE被抑制時(shí)仍會(huì)出現(xiàn)膽堿能功能異常。

OPP/OPNAs進(jìn)入生物體后，BChE的活性位點(diǎn)Ser198的羥基對(duì)OP毒物的磷原子進(jìn)行親核攻擊，生成磷/膦?；疊ChE。因此，可以通過(guò)鑒定體內(nèi)的BChE加合物來(lái)判斷OP的暴露。染毒后的BChE經(jīng)蛋白酶酶解獲得含有Ser198位點(diǎn)的肽段：胃蛋白酶酶解后的九肽加合物和胰蛋白酶酶解后的二十九肽加合物，兩種均可用于OP毒物的生物檢測(cè)，但相比于九肽加合物，二十九肽加合物因肽段分子量大，含有的氨基酸殘基多，觀察完整的y系列或b系列碎片離子以確定修飾位點(diǎn)的難度增加，所以修飾的FGESAGAAS肽段是檢測(cè)OP暴露的生物標(biāo)志物[12]。然而，BChE加合物的檢測(cè)存在局限性：① OP-BChE加合物存在老化現(xiàn)象，且老化速度比AChE加合物快。老化后的BChE加合物缺少烷氧基的信息，無(wú)法對(duì)去烷基化后具有相同結(jié)構(gòu)的OP毒物進(jìn)行溯源。例如GB、GF、VX、VM和VR均含有甲基膦鍵，與被修飾的BChE生成老化的甲基膦酸標(biāo)志物；VE的結(jié)構(gòu)中含有乙基膦鍵，VE-BChE生成老化的乙基膦酸標(biāo)志物；僅有甲基-、乙基-OPNAs類(lèi)似物，如丙基沙林與BChE生成老化的丙基膦酸標(biāo)志物。雖然甲基-、乙基-、丙基膦酸酯是OPNAs特有的，但仍無(wú)法對(duì)老化的OP毒物準(zhǔn)確溯源；而對(duì)于常見(jiàn)的OPP，BChE加合物的OP毒性溯源似乎格外高效：O-甲醇酸酯和敵敵畏分別形成磷酸單甲氧基-、磷酸二甲氧基-BChE加合物；二嗪農(nóng)生成二乙氧基硫代磷酸標(biāo)志物，經(jīng)硫醇-硫酮互變異構(gòu)獲得的二嗪農(nóng)異構(gòu)體，與BChE共價(jià)結(jié)合生成一乙-、二乙氧基磷酸加合物。② 磷/膦酰化的BChE可經(jīng)親核試劑(如肟)作用重新活化，加合物結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)影響對(duì)OP暴露的判斷，而肟無(wú)法恢復(fù)老化的BChE的活性，因此設(shè)計(jì)有效的烷基化劑是應(yīng)對(duì)BChE加合物老化的重要途徑之一，但該領(lǐng)域的相關(guān)研究尚少[13]。

2.2 OPP/OPNAs與白蛋白的加合反應(yīng)白蛋白是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，在血漿中的半衰期約20 d，是血漿中含量最高的蛋白質(zhì)，在維持膠體滲透壓、運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)和排除毒素等方面具有重要作用。1963年，桑格對(duì)標(biāo)記肽進(jìn)行氨基酸測(cè)序，證明二異丙氧基氟磷酸酯(diisopropoxy fluorophosphate，DFP)可以標(biāo)記人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的酪氨酸殘基。此后，除絲氨酸水解酶之外，白蛋白逐漸成為探究OP毒物生物標(biāo)志物的重要靶標(biāo)。

相比于BChE加合物，OP-白蛋白加合物具有諸多優(yōu)勢(shì)：①白蛋白的OP解毒作用強(qiáng)，同樣作為OP清道夫，血液中白蛋白的濃度是BChE的10000倍，彌補(bǔ)了反應(yīng)速度慢的不足，可以通過(guò)與磷原子共價(jià)結(jié)合清除體內(nèi)的OP毒物。②白蛋白的半衰期較長(zhǎng)，意味著OP-白蛋白加合物在體內(nèi)的保留時(shí)間比OP-BChE長(zhǎng)，為OP暴露提供更好的檢測(cè)窗。③OP-白蛋白加合物更穩(wěn)定，而OP-BChE易老化。BChE具有活性部位催化三聯(lián)體，其中絲氨酸殘基Ser198與OP上的磷原子共價(jià)結(jié)合，附近的組氨酸和谷氨酸會(huì)催化BChE加合物的老化過(guò)程，而白蛋白的活性部位不存在促進(jìn)衰老的氨基酸殘基。④OP-白蛋白加合物的應(yīng)用范圍廣。BChE加合物的研究沒(méi)有廣譜性，因?yàn)榕！⑸窖?、綿羊的血液中沒(méi)有BChE，大鼠血液中的BChE含量低，而所有哺乳動(dòng)物的血漿中都存在白蛋白，更具有研究?jī)r(jià)值。白蛋白與OPP/OPNAs發(fā)生親核反應(yīng)，共鑒定出3種磷/膦?；揎椀陌被釟埢豪野彼釟埢①?lài)氨酸殘基、絲氨酸殘基，它們的共性特征是具有親核側(cè)鏈，氨基酸殘基的ε側(cè)鏈進(jìn)攻OPP/OPNAs上的磷原子形成OP-白蛋白加合物。OPP/OPNAs與不同的殘基的ε側(cè)鏈共價(jià)連接時(shí)，插入的位點(diǎn)也不同，例如GB的O-異丙基甲基磷酸酯分別被加到了酪氨酸的ε-酚羥基、賴(lài)氨酸ε-氨基、絲氨酸的ε-羥基上[13-14]。

2.2.1OP-酪氨酸加合物 酪氨酸殘基可以被多種OP毒物磷/膦?；揎?，如DFP與菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋清溶菌酶上的酪氨酸殘基共價(jià)結(jié)合；OPP(對(duì)硫磷、敵敵畏、毒死婢、馬拉硫磷、丙胺磷、DFP)、OPNAs(GB、GD)與HSA、純小鼠白蛋白的酪氨酸(tyrosine，Tyr)411殘基共價(jià)連接。FP-生物素對(duì)牛血清白蛋白磷?；揎椀幕钚晕稽c(diǎn)Tyr410，相當(dāng)于HSA的Tyr411。對(duì)特殊標(biāo)記的Tyr411深入研究，發(fā)現(xiàn)其pKa值(7.9-8.3)明顯低于酪氨酸殘基的平均水平(pKa=10)，解析加合物的晶體結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該殘基與多個(gè)帶正電的基團(tuán)相鄰并處于非極性環(huán)境中，Tyr411的羥基臨近Arg410和Lys414的側(cè)鏈。將Tyr411定點(diǎn)突變?yōu)锳la時(shí)，白蛋白的活性消失，而將Arg410突變?yōu)锳la時(shí)，白蛋白的活性大大降低，說(shuō)明Tyr411是HSA的活性位點(diǎn)，Arg410對(duì)穩(wěn)定其高反應(yīng)性具有重要作用。據(jù)悉，Tyr411是最具高反應(yīng)性的殘基，分析蛋白加合物進(jìn)行OP溯源時(shí)，OP毒物中不同的離去基團(tuán)會(huì)影響OP檢測(cè)限，例如對(duì)硫磷、毒死婢很容易確定到1 μmol·L-1的暴露水平，丙胺磷在高水平(1 mmol·L-1)下可以檢測(cè)樣本，但預(yù)估能夠達(dá)到1 μmol·L-1的檢測(cè)水平，而馬拉硫磷的檢測(cè)限為1 mmol·L-1，提示相比于其余3種OPP的酚羥基離去基團(tuán)，馬拉硫磷的硫醇基團(tuán)與Tyr411有較低的反應(yīng)性。除Tyr411外，HSA中的Y263也具有高反應(yīng)性，能夠同時(shí)被6種OPNAs(GA、GB、GD、GF、VX及其異構(gòu)體)共價(jià)修飾。對(duì)Y263的空間結(jié)構(gòu)及電子效應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Y263較大的溶劑可及性(%SAS)，增加了與OPNAs發(fā)生碰撞的機(jī)會(huì)，離子對(duì)(與距離4.21 ?的K233形成的離子對(duì))和非共價(jià)相互作用(酚羥基與距離2.89 ?的E230形成氫鍵)在穩(wěn)定加合物中具有關(guān)鍵作用。HSA上有關(guān)活性位點(diǎn)Tyr411和Y263的研究啟示：OPP/OPNAs與殘基的共價(jià)結(jié)合與OP毒物的離去基團(tuán)、活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和周?chē)h(huán)境有關(guān)[15]。此外，殘基離子化也會(huì)影響加合反應(yīng)，F(xiàn)P-生物素在pH 8.0～8.3下高劑量染毒HSA并延長(zhǎng)染毒時(shí)間，發(fā)現(xiàn)90%結(jié)合在Tyr411，其余10%標(biāo)記在其它殘基上，如絲氨酸，研究其特殊反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)酪氨酸羥基的pKa低于絲氨酸羥基(pKa：10.1<16)，同時(shí)，由于周邊的精氨酸或賴(lài)氨酸對(duì)酪氨酸或絲氨酸的離子化羥基的穩(wěn)定作用，導(dǎo)致離子化的酪氨酸比例遠(yuǎn)高于絲氨酸，使酪氨酸更容易發(fā)生加合反應(yīng)且加合比例更大。

2.2.2OP-賴(lài)氨酸加合物 OPP/OPNAs對(duì)賴(lài)氨酸殘基的磷/膦?；揎検腔谫?lài)氨酸的ε-氨基對(duì)OP毒物上磷原子進(jìn)行親核攻擊，然后在ε-氨基上加一個(gè)有機(jī)磷部分，例如毒死婢和DFP與HSA發(fā)生親核反應(yīng)，分別得到二乙氧基-和二異丙氧基-磷?；?lài)氨酸[16]。GA對(duì)體外(牛、卵磷脂、大鼠、兔)純白蛋白和體內(nèi)(卵磷脂、大鼠、兔)白蛋白的膦?；揎棧l(fā)現(xiàn)體內(nèi)外有相似的被修飾的肽序列，且在不同物種中均保持穩(wěn)定。GA-卵磷脂加合物的形成是源于賴(lài)氨酸側(cè)鏈的氮原子對(duì)GA上磷原子的親核攻擊，膦?；臍埢ǔ４嬖谟诎椎鞍椎谋砻婊蚋浇目涨粌?nèi)，具有較低的PKa值和CDOCKER相互作用能。CDOCKER相互作用能越低表示加合物越穩(wěn)定，如體內(nèi)的活性位點(diǎn)K414與GA之間的加合物具有較強(qiáng)的結(jié)合能(-24.3242 kcal/mol)，穩(wěn)定性較強(qiáng)，而未標(biāo)記的賴(lài)氨酸殘基的CDOCKER相互作用能較高[17]。此外，膦?；馁?lài)氨酸殘基的反應(yīng)性同樣受到氫鍵、靜電作用、電子對(duì)的影響，如GA靠近HSA上的K525時(shí)，氮原子與K525和Y401的側(cè)鏈形成氫鍵，碳原子與F551的側(cè)鏈形成H-π共軛，這兩個(gè)因素有助于增強(qiáng)GA-K525的疏水性，降低親水性和GA與K525親核反應(yīng)能，使加合物更加穩(wěn)定[9]。提示可以通過(guò)誘變或化學(xué)修飾鄰位殘基來(lái)改變周?chē)h(huán)境，降低氨基酸殘基的pKa，從而增加OP與白蛋白的反應(yīng)性。不同物種的氨基酸序列顯示兔血清白蛋白(rabbit serum albumin，RSA)與HSA的序列同源性高達(dá)76.03%，高于常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大小鼠。GD對(duì)RSA、兔血漿染毒發(fā)現(xiàn)存在GD-賴(lài)氨酸加合物，而兔體內(nèi)膦?；臍埢鶅H發(fā)現(xiàn)賴(lài)氨酸，因體內(nèi)GD的暴露劑量遠(yuǎn)低于體外，在未使用過(guò)量毒物的情況下，賴(lài)氨酸殘基優(yōu)先被標(biāo)記，推斷RSA體內(nèi)賴(lài)氨酸殘基比酪氨酸、絲氨酸的反應(yīng)性更高，可能的原因有：①賴(lài)氨酸是堿性氨基酸，其側(cè)鏈易解離并帶有正電荷，增強(qiáng)了親核活性；②賴(lài)氨酸ε-氨基優(yōu)先與GD形成加合物，而非酪氨酸的ε-酚羥基、絲氨酸的ε-羥基，可能是其官能團(tuán)賦予其這種特性[7]。

2.2.3OP-其他氨基酸加合物 在沒(méi)有活性位點(diǎn)絲氨酸的蛋白中，酪氨酸和賴(lài)氨酸的反應(yīng)性比絲氨酸大。當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件加大，如增加OP毒物濃度、延長(zhǎng)染毒時(shí)間等，就會(huì)出現(xiàn)OPP/OPNAs與絲氨酸殘基的加合現(xiàn)象，但絲氨酸加合物的穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于酪氨酸加合物，同樣在pH8.3的條件下溫育，一個(gè)月后仍能觀察到被OP修飾的酪氨酸，而OP-絲氨酸加合物早已不見(jiàn)蹤影，這可能由于：①OP-絲氨酸容易進(jìn)行β消除以釋放有機(jī)磷部分，只剩下脫氫丙氨酸，而OP-酪氨酸并未發(fā)現(xiàn)釋放有機(jī)磷?；糠值淖C據(jù)。②OP-絲氨酸可以輕松去除有機(jī)磷部分，導(dǎo)致肽的質(zhì)譜圖中沒(méi)有特征性片段，而OP-酪氨酸相對(duì)穩(wěn)定的產(chǎn)生大量的特征性片段，為OP標(biāo)記的酪氨酸的存在提供證據(jù)[18]。膦?；慕z氨酸位點(diǎn)同樣有其結(jié)合特征，HSA上的K*VPQVSTPTLVEVSR肽段上的S419與結(jié)構(gòu)相似的GB和GF有較強(qiáng)的親和力，其中GB的磷原子與HSA中S419側(cè)鏈的氧原子形成共價(jià)鍵，同時(shí)，GB與HSA中K500側(cè)鏈的氮原子之間的氫鍵、與相鄰殘基之間較低的非共價(jià)結(jié)合能，均增加了GB-HSA的穩(wěn)定性。具有硫醇離去基團(tuán)的OP毒物，如V類(lèi)OPNAs(VX、VR、Vs)和OPP(氧化氫-甲基、樂(lè)果、氧化樂(lè)果)能與HSA中唯一的非二硫鍵橋接的半胱氨酸殘基(Cys34)形成二硫加合物，它是通過(guò)游離的硫醇離去基團(tuán)或二硫鍵二聚體與Cys34之間進(jìn)行硫醇-二硫鍵交換形成的。以VX為例，VX的含硫離去基團(tuán)2-(二異丙基氨基)乙硫醇(2-(diisopropylamino)ethanethiol，DPAEP)與Cys34形成二硫加合物，酶解后會(huì)以半胱氨酸-脯氨酸二肽或三肽的形式釋放。這些毒物與白蛋白會(huì)形成兩個(gè)中心的加合物，一個(gè)是含硫中心的二硫加合物，一個(gè)是含磷中心的磷/膦?；雍衔铮渲卸蚣雍衔锏陌邢虬被釣榘腚装彼?，而磷/膦?；雍衔锏陌袠?biāo)主要為酪氨酸或賴(lài)氨酸。有一種觀點(diǎn)：磷/膦?；睦野彼徉徑麮ys34時(shí)有助于二硫加合物的形成。但在HSA的三維結(jié)構(gòu)中，沒(méi)有一個(gè)反應(yīng)性的酪氨酸(包括高反應(yīng)性的Tyr411)與Cys34接近，僅有Tyr84、Tyr140在Cys34附近，提示這兩種酪氨酸可能是OP毒物的潛在靶點(diǎn)。

2.3 OPP/OPNAs與轉(zhuǎn)鐵蛋白的加合反應(yīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TRF)由肝細(xì)胞合成，是血漿中主要的含鐵蛋白，負(fù)責(zé)運(yùn)輸由消化管吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵。盡管轉(zhuǎn)鐵蛋白的半衰期僅有7 d，但因其胰蛋白酶酶解樣本在40℃的環(huán)境中可以保存一個(gè)月以上，同樣能作為檢測(cè)OP加合物的良好靶標(biāo)蛋白[19]。采用過(guò)量的OP毒物(GB、GA、VX、GD、GF、乙基塔崩、丙基塔崩)轉(zhuǎn)染人轉(zhuǎn)鐵蛋白，結(jié)合位點(diǎn)涉及3種類(lèi)型的殘基：酪氨酸-、賴(lài)氨酸-和絲氨酸殘基，其中Y515位點(diǎn)同時(shí)被GB、GD、VX標(biāo)記，是轉(zhuǎn)鐵蛋白中最具反應(yīng)性的殘基，處于暴露狀態(tài)并與其他殘基之間存在氫鍵相互作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)OP與酪氨酸的結(jié)合似乎更傾向于附近有帶正電的精氨酸或賴(lài)氨酸，結(jié)合白蛋白中的標(biāo)記肽進(jìn)行研究：在pH=8.3的條件下，采用0.1、0.2 mmol·L-1的DFP、毒死婢和敵敵畏染毒兩條合成肽段ArgTyrThrArg和SerTyrSerMet，在ArgTyrThrArg肽段上發(fā)現(xiàn)酪氨酸加合物，而另一條肽段上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒物標(biāo)記，將染毒濃度增加至1 mmol·L-1，質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)較弱的離子化肽，發(fā)現(xiàn)規(guī)律：位于帶正電荷的精氨酸或賴(lài)氨酸殘基附近的酪氨酸殘基通常具有高反應(yīng)性。當(dāng)轉(zhuǎn)鐵蛋白上的酪氨酸或賴(lài)氨酸被膦?；笕阅芘c三價(jià)鐵離子結(jié)合并發(fā)生氧化還原反應(yīng)，表明轉(zhuǎn)鐵蛋白的生理功能不受加合物的影響。

3 低劑量毒性的相關(guān)蛋白

AChE的快速磷/膦?；浞纸忉屃薕PP/OPNAs的急性毒性作用。然而，當(dāng)確認(rèn)低劑量的OP毒物在未抑制AChE的情況下仍能產(chǎn)生神經(jīng)毒性，如頭痛，記憶力減退，學(xué)習(xí)能力差，睡眠困難，疲勞和肌肉無(wú)力時(shí)，提示有除抑制ChE之外的機(jī)制參與其中，而磷/膦?；揎椀陌椎鞍谆蜣D(zhuǎn)鐵蛋白并不能解釋低劑量毒性的由來(lái)，說(shuō)明另有靶標(biāo)經(jīng)OPP/OPNAs修飾后對(duì)生物體的神經(jīng)功能造成損傷。但該領(lǐng)域進(jìn)展緩慢，目前尚不明確其發(fā)生機(jī)制。

3.1 OPP/OPNAs與細(xì)胞骨架蛋白的加合反應(yīng)據(jù)悉，低劑量的OP毒物干擾神經(jīng)發(fā)育的過(guò)程，如神經(jīng)元增殖、分化、凋亡、軸突發(fā)生、突觸形成，甚至神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化等。神經(jīng)元細(xì)胞骨架是由微管、微絲、中間絲構(gòu)成的蛋白纖維網(wǎng)架體系，在正常的神經(jīng)發(fā)育中至關(guān)重要，其骨架蛋白有望成為研究OP神經(jīng)毒性的重要靶標(biāo)[20]。

3.1.1OPP/OPNAs與微管蛋白的加合反應(yīng) 微管蛋白是微管的主要成分，包括3種：α-、β-、γ-微管蛋白，前兩種微管蛋白占總量的80%～95%，具有相似的三維結(jié)構(gòu)，能夠緊密結(jié)合形成二聚體并參與微管的組裝；γ-微管蛋白位于微管組織中心，對(duì)微管的形成、數(shù)量、位置及細(xì)胞分裂具有重要作用。微管蛋白聚合形成微管，參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從神經(jīng)細(xì)胞體到神經(jīng)突觸的運(yùn)輸。有報(bào)道稱(chēng)，易感動(dòng)物體在OP暴露后引起的OPIDN、認(rèn)知功能缺陷或與微管蛋白功能損壞、軸突運(yùn)輸中斷有關(guān)[21]。在FP-生物素染毒的活體小鼠的腦內(nèi)上清液中發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記的分子量為55KDa的蛋白，質(zhì)譜鑒定該蛋白的主要成分為微管蛋白。隨后研究發(fā)現(xiàn)，OPP(毒死婢、DFP、FP-生物素)和OPNAs(GB、GD)能與牛微管蛋白(α-、β-微管蛋白)上的酪氨酸殘基和賴(lài)氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，其中α-微管蛋白上的Tyr83和β-微管蛋白上的Tyr281暴露在微管蛋白二聚體的表面，與三磷酸鳥(niǎo)苷分子的鳥(niǎo)嘌呤部分具有π-π相互作用，二者的OP反應(yīng)性最高，且反應(yīng)速度也比其他氨基酸殘基快。同時(shí)，被標(biāo)記的微管蛋白聚合會(huì)形成異常短的微管，微管結(jié)構(gòu)改變，運(yùn)輸功能異常導(dǎo)致神經(jīng)傳遞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能受損[22]。

3.1.2OPP/OPNAs與角蛋白的加合反應(yīng) 皮膚是OP毒物進(jìn)入生物體的重要途徑。研究表明，暴露于14C-VX環(huán)境中的家豬，皮膚內(nèi)會(huì)殘留約20%的放射性，明確了皮膚在OP暴露中的研究?jī)r(jià)值，而VX對(duì)人類(lèi)皮膚的滲透性不及豬皮，會(huì)在更大面積的皮膚上擴(kuò)散，因此使用劑量的大部分會(huì)保留在施用部位的皮膚內(nèi)。FP-生物素與人角蛋白的加合物肽段THEN*FESFNNLR上的酪氨酸殘基Tyr230共價(jià)結(jié)合，肯定了皮膚內(nèi)蛋白加合物對(duì)檢測(cè)OP暴露、對(duì)OP歸因的可行性。皮膚中的角蛋白是中間絲的重要組成部分，主要存在于所有上皮細(xì)胞和部分非上皮細(xì)胞，用于維持細(xì)胞的形狀和抵抗外界的壓力。OPNAs(VX、DFP)和OPP(毒死婢、FP-生物素)與人足底的愈傷組織內(nèi)的角蛋白形成蛋白加合物，涉及酪氨酸殘基、絲氨酸殘基，而在毒死婢與角蛋白加合物的胰蛋白酶解片段中僅發(fā)現(xiàn)了被共價(jià)修飾的酪氨酸殘基，提示與酪氨酸相比，絲氨酸殘基對(duì)OP毒物的反應(yīng)性較低[23-24]。關(guān)于角蛋白的研究尚少，或許角蛋白的其他位點(diǎn)也被修飾，但因消化肽的含量太低、檢測(cè)水平有限而未發(fā)現(xiàn)。

3.1.3OPP/OPNAs與其他骨架蛋白的加合反應(yīng) 除微管蛋白、角蛋白外，微絲的主要構(gòu)成蛋白——肌動(dòng)蛋白加合物也被發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)P-生物素能夠標(biāo)記牛肌動(dòng)蛋白上的酪氨酸殘基(Tyr55、Tyr200)。據(jù)報(bào)道，大鼠重復(fù)暴露于閾值以下劑量的毒死婢或DFP中，其坐骨神經(jīng)中的順行性軸突運(yùn)輸受損。除微管蛋白外，與之相關(guān)的tau蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白分別參與軸突內(nèi)微管的組裝和穩(wěn)定、外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突運(yùn)輸，同樣具有研究?jī)r(jià)值，例如DFP處理的母雞中tau蛋白磷酸化；對(duì)氧磷、毒死婢會(huì)直接影響驅(qū)動(dòng)蛋白，破壞微管內(nèi)依賴(lài)驅(qū)動(dòng)蛋白的運(yùn)輸。

3.2 OPP/OPNAs與神經(jīng)病靶標(biāo)酯酶的加合反應(yīng)神經(jīng)病靶標(biāo)酯酶(neuropathy target esterase，NTE)是一種只催化經(jīng)CDP-膽堿途徑合成卵磷脂的磷脂酶B，表達(dá)主要受卵磷脂、環(huán)腺苷酸、泛素-蛋白酶體途徑的調(diào)節(jié)，主要存在于哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[25-27]。據(jù)報(bào)道，OPIDN是由OP毒物對(duì)NTE的磷/膦?；鸬摹TE屬于絲氨酸酯酶，與絲氨酸水解酶(AChE、BChE)的反應(yīng)機(jī)理相似，是OPs上的磷原子與NTE的活性位點(diǎn)絲氨酸Ser966共價(jià)結(jié)合抑制NTE的酶活性，隨后磷/膦?；腘TE發(fā)生老化：NTE上的OP部分的側(cè)鏈斷開(kāi)，或OP基團(tuán)的去質(zhì)子反應(yīng)，只留下一個(gè)帶負(fù)電的取代基結(jié)合到酶的活性位點(diǎn)上，NTE的活性被永久抑制。在神經(jīng)元中，NTE的活性被抑制會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂穩(wěn)態(tài)，而神經(jīng)軸突內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸都是靠?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)完成的，這一過(guò)程會(huì)不可避免的遭受擾亂。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，NTE的抑制也會(huì)影響膜磷脂代謝，破壞神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間正常的相互作用。正常情況下，神經(jīng)元被一層神經(jīng)膠質(zhì)膜緊密包被時(shí)，神經(jīng)元會(huì)向其下游神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)出停止包被的信號(hào)，而NTE抑制后，中斷二者之間的相互作用，神經(jīng)元會(huì)被多層神經(jīng)膠質(zhì)膜松散的包被，繼而導(dǎo)致兩種細(xì)胞凋亡，遠(yuǎn)端軸突發(fā)生退變。此外，NTE有溶血磷脂酶的活性，對(duì)磷脂代謝具有重要作用。當(dāng)酶抑制，脊髓等部位的磷脂代謝和信號(hào)通路中斷，可能會(huì)造成遲發(fā)性毒性的發(fā)生。總之，OPs引起的NTE活性抑制會(huì)誘發(fā)以外周神經(jīng)變性為主要特征的OPIDN，期間NTE的生物功能喪失，神經(jīng)毒性作用產(chǎn)生。

3.3 OPP/OPNAs與泛素的加合反應(yīng)泛素(ubiquitin，Ub)是所有真核細(xì)胞中的一種小蛋白，游離存在于細(xì)胞內(nèi)或共價(jià)綴合到各種胞質(zhì)、核和整合的膜蛋白上，通過(guò)單泛素化或多泛素化底物蛋白參與細(xì)胞中的多種代謝過(guò)程，如細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能、應(yīng)急反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)等。Ub的氨基酸序列中包含賴(lài)氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸殘基，是典型的磷酸化位點(diǎn)。然而，與V類(lèi)毒劑一同孵育時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅在賴(lài)氨酸殘基上形成蛋白加合物。正常PH條件下，暴露于蛋白表面的賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈上的氮原子會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，無(wú)法再與親核試劑發(fā)生反應(yīng)。而膦酰化的賴(lài)氨酸殘基附近存在酸性基團(tuán)谷氨酸，可以臨時(shí)接受其質(zhì)子，促進(jìn)加合物的生成[28]。事實(shí)上，暴露于蛋白表面的7個(gè)賴(lài)氨酸殘基中，至少有6個(gè)對(duì)Ub的生物學(xué)功能至關(guān)重要，這取決于賴(lài)氨酸殘基中游離的ε-氨基，它能與Ub分子中游離的C端G76殘基反應(yīng)，形成多聚泛素鏈，而被修飾的賴(lài)氨酸殘基會(huì)失去其生物學(xué)功能[29-30]。簡(jiǎn)言之，OPs與賴(lài)氨酸殘基的加合作用會(huì)破壞Ub正常的生理功能，進(jìn)而產(chǎn)生毒性作用。

4 小結(jié)

通過(guò)深度探究OP毒物與蛋白質(zhì)之間的加合反應(yīng)機(jī)制，了解活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，為之后的OP毒物的確認(rèn)暴露、溯源歸因、精準(zhǔn)治療、合理預(yù)防提供了新思路：(1)通過(guò)鑒定蛋白加合物的存在來(lái)實(shí)現(xiàn)OP的確認(rèn)暴露，與OP毒物原型、代謝產(chǎn)物相比，生物體內(nèi)的蛋白加合物為OP的暴露提供了更好的檢測(cè)窗。對(duì)OP毒物的檢測(cè)時(shí)間無(wú)需再限定于48 h之內(nèi)，研究者可以根據(jù)蛋白加合物在生物體內(nèi)的保留時(shí)間來(lái)選擇通過(guò)測(cè)定哪種蛋白加合物來(lái)判斷OP暴露；(2)通過(guò)分析蛋白加合物中與活性位點(diǎn)相結(jié)合的OP毒物的保留基團(tuán)對(duì)OP毒性進(jìn)行溯源歸因，為OP中毒提供更多有效信息，幫助醫(yī)生對(duì)OP中毒患者實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。目前，以蛋白加合物為基石對(duì)OP毒性溯源的文章較少，難以形成歸因溯源的完整體系，提示可以總結(jié)常見(jiàn)的物種體內(nèi)不同蛋白加合物對(duì)OPP/OPNAs的溯源情況，互為補(bǔ)充，進(jìn)而形成一張比較完善的溯源譜圖以供醫(yī)療參考；(3)充分掌握蛋白加合物的形成規(guī)律、活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征。蛋白加合物形成的影響因素較多，與結(jié)合蛋白的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)暴露情況、周?chē)h(huán)境(如空間結(jié)構(gòu)、電子效應(yīng)、靜電作用(氫鍵、共軛鍵))，氨基酸殘基的酸堿性、解離情況、帶電情況等因素相關(guān)，通常處于暴露狀態(tài)(具有較大的%SAS)、與鄰位殘基形成離子對(duì)或存在非共價(jià)相互作用、pKa值較小、周邊有帶正電的氨基酸殘基的活性位點(diǎn)，易于與OP毒物共價(jià)結(jié)合形成蛋白加合物。該規(guī)律可用于新藥研發(fā)，作為預(yù)防藥，通過(guò)預(yù)先與活性位點(diǎn)相結(jié)合來(lái)阻止有毒蛋白加合物的生成；或作為治療藥，通過(guò)改變加合物的結(jié)構(gòu)、加合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，破壞已生成的有毒蛋白加合物以達(dá)到解毒目的。