基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的丹參飲抗結(jié)腸癌作用機制

趙 歡，開國銀，韓 冰

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

結(jié)腸癌作為常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增加，且其死亡率更是高居惡性腫瘤第四位[1]。西醫(yī)對于結(jié)腸癌的治療手段單一，以手術(shù)、放療和化療為主，后期副作用較大。中醫(yī)對結(jié)腸癌的認(rèn)識在古今有兩種不同的看法，《黃帝內(nèi)經(jīng)》將結(jié)腸癌命名為“積證”，主要原因是衛(wèi)氣停留于結(jié)腸不能返回，積液久停，合而為腸瘤，以氣滯為主要原因[2]。現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，癌毒源于內(nèi)，在腸道瘀結(jié)，臟腑通降失常，無力抗癌毒，以血瘀為主[3-4]。中醫(yī)對于結(jié)腸癌的治療復(fù)方有多種，如四君子湯、加味烏梅湯、黃芩湯等[5]。丹參飲符合古今病因辯證，丹參有活血祛瘀之功，檀香具行氣溫中之效，可能對結(jié)腸癌的治療有一定效果。

丹參飲由中藥丹參(SalviamiltiorrhizaBge)、檀香(SantalumalbumL)和砂仁(Amomum villosum Lour)組成，具有活血行氣止痛的功效，主治氣滯血瘀證，目前臨床上主要用于心血管和胃腸道系統(tǒng)的治療[6]。王程等[7]建立CT-26結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，丹參飲(1 g生藥/mL)干預(yù)該模型可抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移，其機制可能與抑制肝臟腫瘤中端粒酶的表達(dá)有關(guān)。王學(xué)良[8]采用丹參飲干預(yù)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，發(fā)現(xiàn)丹參飲對腫瘤轉(zhuǎn)移過程有明顯的抑制作用，其作用機制與調(diào)節(jié)NF-κB和EGFR的表達(dá)有關(guān)。盡管當(dāng)下對丹參活性成分的研究較多，但對中藥復(fù)方丹參飲的研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用網(wǎng)上平臺大數(shù)據(jù)分析，通過藥物有效成分對應(yīng)靶點和疾病靶點，構(gòu)建中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并以分子對接檢驗結(jié)合效果，進(jìn)而分析潛在的治療機制。

1 材料與方法

1.1 丹參飲活性成分和結(jié)腸癌靶點篩選丹參飲作用靶點篩選：在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中查找，得到復(fù)方丹參飲中丹參、檀香、砂仁的所有有效活性成分，以生物利用度OB值≥30%，類藥性DL≥0.18為篩選條件，分選出中藥復(fù)方丹參飲的主要活性成分。以TCMSP 數(shù)據(jù)庫查找丹參飲各味藥的相關(guān)作用靶點，再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http//www. Uniprotorg/)將target name轉(zhuǎn)化為symbol name。

結(jié)腸癌作用靶點篩選：在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中查找Colon Cancer疾病相關(guān)靶點，以得分≥1.0為篩選條件，得到相應(yīng)疾病靶點。

1.2 藥物與疾病相關(guān)靶點交集的構(gòu)建為了進(jìn)一步剖析復(fù)方丹參飲與結(jié)腸癌的關(guān)系，依托R4.0.2軟件，繪制丹參飲與結(jié)腸癌靶點的韋恩圖。再以共同靶點為篩選條件，找出丹參飲中主要的相關(guān)活性成分。并以Cytoscape3.7.0軟件為依托，結(jié)合上述得到的各靶點、疾病以及中藥有效成分的關(guān)系，構(gòu)建中藥-活性成分-靶點-疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的構(gòu)建在STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)中，將疾病和中藥成分共有的靶點導(dǎo)入進(jìn)行搜索，物種選擇為“Homo sapiens”，隱藏蛋白網(wǎng)絡(luò)中游離的節(jié)點，設(shè)置最低互作分值為0.4，構(gòu)建靶點蛋白的可視化互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO功能與KEGG通路富集分析通過Biocondoctor數(shù)據(jù)庫(http://www.bioconductor.org/)下載安裝基因本體論富集分析(Gene Ontology，GO)和信號通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的語言包到R4.0.2軟件，然后依托R4.0.2繪制出GO功能和KEGG通路富集氣泡圖、柱狀圖以及相應(yīng)的信號通路圖。

1.5 重要靶點和主要活性成分的分子對接通過PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載通路中重要蛋白AKT1的3D蛋白結(jié)構(gòu)，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載主要活性成分木犀草素(Luteolin)和丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)的3D結(jié)構(gòu)，通過Sybyl X2.0軟件進(jìn)行Surflex-Dock分析，Total score為輸出構(gòu)象的總打分函數(shù), 涉及碰撞打分(crash)、極化打分(polar)。本文將Total score打分高于5.000的輸出構(gòu)象判定為較好的輸出構(gòu)象，并用Pymol軟件處理對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 丹參飲中活性成分與靶點篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺，查找得到丹參飲的所有化學(xué)成分。其中丹參有202個化學(xué)成分，檀香有70個，砂仁有165個。以O(shè)B>30%，DL>0.18為篩選條件過濾，共得到丹參飲中藥物的活性成分78個，其中丹參65個，檀香3個，砂仁10個(Tab 1)。

Tab 1 Information on chemical composition of Danshen decoction

續(xù)Tab 1

2.2 藥物-疾病有效成分靶點篩選將TCMSP數(shù)據(jù)庫中丹參飲有效成分對應(yīng)的靶點蛋白通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行轉(zhuǎn)化，共得到基因靶點142個。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫，以得分>1為篩選條件，得到3 239個結(jié)腸癌靶點。利用R4.0.2軟件，繪制丹參飲-結(jié)腸癌靶點韋恩圖(Fig 1)，獲得中藥有效成分和疾病共同靶點105個，根據(jù)靶點篩選獲得含有相應(yīng)靶點的中藥有效成分69個。

Fig 1 The Venn diagram of Danshen decoction and colon cancer targets

2.3 中藥-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建將疾病和復(fù)方中共有靶點作為研究對象，再將相應(yīng)靶點與復(fù)方中的有效成分和單味藥對應(yīng)關(guān)系，有效成分與相關(guān)靶點關(guān)系，以及靶點與疾病關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件。對藥物及其對應(yīng)的有效成分，靶點以及疾病進(jìn)行優(yōu)化，獲得中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)由178個節(jié)點，888條邊組成，其中木犀草素是丹參和檀香的共有成分，重要性最強。在丹參中，與靶點關(guān)聯(lián)度居前三的是丹參酮ⅡA、丹參新醌D和二氫丹參內(nèi)酯。在檀香中，除木犀草素外，與靶點關(guān)聯(lián)最強的是異鼠李素。在砂仁中，β-谷甾醇作為丹參和砂仁的共有成分，其與靶點關(guān)聯(lián)度最強，其次是豆甾醇。總結(jié)來說，木犀草素和丹參酮ⅡA與靶點相互作用最多，研究價值相對較大。

Fig 2 PPI protein interaction network diagram

2.4 PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入藥物和共有的105個有效靶點，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，得到PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(Fig 2)。并分選出鏈接節(jié)點最多的 20個靶點基因，根據(jù)其連線數(shù)做出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心基因的柱狀圖(Fig 3)。其中主要受影響的靶點基因有AKT1、Tp53、IL-6等，這為探尋中藥復(fù)方丹參飲治療結(jié)腸癌的機制提供深遠(yuǎn)的參考價值。

Fig 3 Core gene of protein interaction network

2.5 GO功能與KEGG通路富集分析以Biocondoctor數(shù)據(jù)庫中GO和KEGG相應(yīng)的語言包，依托R語言，得出主要的GO功能柱狀圖(Fig 4)和KEGG富集通路氣泡圖(Fig 5)。其中GO功能分析結(jié)果從高到低為DNA-binding transcription factor binding、RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding、ubiquitin-like protein ligase binding、ubiquitin protein ligase binding、cytokine receptor binding。KEGG通路富集分析結(jié)果從高到低為PI3K/AKT signaling pathway、Hepatitis B、Human cytomegalovirus infection、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection。同時以PI3K/AKT信號通路為主要影響對象，得出相應(yīng)通路蛋白變化情況的通路圖(Fig 6)。根據(jù)中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系、PPI蛋白互作和KEGG通路富集的結(jié)果，選擇AKT1作為后續(xù)分子對接的靶點蛋白。

Fig 4 The bar diagram of GO function analysis

Fig 5 The bubble diagram of KEGG pathway

2.6 AKT1與木犀草素和丹參酮ⅡA分子對接利用SybylX2.0軟件，將木犀草素和丹參酮ⅡA分別與AKT1進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)木犀草素與AKT1對接的Total score、crash、polar分別為8.649 2、-0.945 2、6.543，有強烈的結(jié)合活性。丹參酮ⅡA與AKT1對接的Total score、crash、polar分別為5.250 7、-0.107 8、1.294 7。通過Pymol軟件將分子對接結(jié)果優(yōu)化，如圖可知木犀草素和AKT1中的GLU-17、ARG-15、THR-87、ASN-54和GLN-79這5個氨基酸存在較強的氫鍵作用(Fig 7A)。丹參酮ⅡA與AKT1中的LYS-268和SER-205兩個氨基酸有較強的氫鍵作用(Fig 7B)。說明木犀草素和丹參酮ⅡA對丹參飲藥效作用的發(fā)揮有重要影響，為研究丹參飲對結(jié)腸癌的作用機制提供了理論參考。

Fig 6 Map of PI3K/AKT signaling pathway

Fig 7 The docking diagram of AKT1 with Luteolin (A)

3 討論

近年來，隨著人們飲食多脂化和人口老齡化的加劇，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年提升。值得注意的是，我國城鎮(zhèn)化的發(fā)展對結(jié)腸癌的發(fā)病率同樣影響重大。城市人群脂肪相對攝入量遠(yuǎn)高于農(nóng)村，因此其發(fā)病率高于農(nóng)村人群[9]。本研究結(jié)合結(jié)腸癌的古今病因辨證，預(yù)測丹參飲可能對結(jié)腸癌起著一定的治療作用。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，將丹參飲的有效化學(xué)成分和疾病的對應(yīng)靶點進(jìn)行整合，建立有效的中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并通過PPI蛋白互作確定主要核心靶點蛋白，依托R語言完成通路的預(yù)測，最后用分子對接確定結(jié)果的有效程度。

其中，PPI蛋白互作結(jié)果中核心蛋白主要包括AKT1、Tp53、IL-6、VEGFA、MAPK1、CASP3、JUN、MYC、EGFR、STAT3、CCND1、TOS等。H?ggblad等[10]通過研究AKT1、AKT2和AKT1/2基因敲除的結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AKT1和AKT2敲除可以減弱腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長。證實核心蛋白AKT1在結(jié)腸癌中的重要作用，說明丹參飲可能通過調(diào)節(jié)上述核心蛋白發(fā)揮抗結(jié)腸癌活性，然而還需要后續(xù)進(jìn)一步的體內(nèi)外驗證。

從中藥-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中可以發(fā)現(xiàn)木犀草素和丹參酮ⅡA是丹參飲中的重要活性成分，進(jìn)一步通過分子對接證實其與關(guān)鍵蛋白AKT1具有相互作用。Kang等[11]發(fā)現(xiàn)木犀草素可以抑制轉(zhuǎn)錄抑制因子DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，降低Nrf2啟動子區(qū)域的甲基化，增加5-甲基胞嘧啶雙加氧酶與Nrf2啟動子的結(jié)合，確定了木犀草素抗結(jié)腸癌的作用機制。此外，Cyanidin-3-葡萄糖氯化物與木犀草素可協(xié)同抑制結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞的生長[12]。Xue等[13]發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響與下調(diào)mTOR和VEGF表達(dá)有關(guān)。另有學(xué)者[14]發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可以抑制COX-2的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號通路，進(jìn)而下調(diào)VEGF的表達(dá)水平，最終抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長。從中可以看出木犀草素和丹參酮ⅡA對結(jié)腸癌細(xì)胞有顯著的抑制作用，而目前關(guān)于兩者靶向AKT1的抗腫瘤機制鮮有報道，因此可能是潛在的候選抗結(jié)腸癌藥物。

此外，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路可能是丹參飲治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵信號通路。Bishnupuri等[15]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腫瘤上皮中PI3K/AKT信號激活顯著促進(jìn)β-catenin核轉(zhuǎn)位、細(xì)胞增殖和抗凋亡。Ma等[16]發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞來源的趨化因子可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞分泌趨化因子CXCL6和CXCL12，并通過PI3K/AKT/mTOR信號通路，協(xié)同調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移，因此阻斷該途徑是結(jié)腸癌患者潛在的抗轉(zhuǎn)移治療靶點之一。此外，趨化因子CXCL12調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)，并通過PI3K/AKT信號調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[17]，暗示PTEN或PI3K功能的修飾是抑制結(jié)腸癌侵襲性擴散的原因所在。人參皂苷Rh2誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡也與抑制PI3K/AKT/GSK-3β信號通路有關(guān)，其機制可能是通過激活p53和caspase-3活化，下調(diào)Bcl-2/Bax比例[18]?？偨Y(jié)以上研究可知，PI3K/AKT信號通路可能是丹參飲治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵通路。

綜上所述，丹參飲具有活血行氣、祛濕止痛的功效，其對結(jié)腸癌的治療或許可以起到一定的積極意義，作用機制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路有關(guān)。在世界文化交流日益頻繁的大背景下，在中西醫(yī)結(jié)合治療的大潮流下，中藥多靶點、多途徑給藥的優(yōu)勢彰顯無遺。隨著各種癌癥發(fā)病率的日益增多，中藥的地位日益顯著。然而，對于疾病的攻克和治療，仍然需要廣大研究者的努力探究和挖掘。