丹酚酸B治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制研究進(jìn)展

李 建，李 強(qiáng)，李延峰，王洪權(quán)

(1. 赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 北京 100050；3. 航天中心醫(yī)院、北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科/航天醫(yī)學(xué)中心， 北京 100049)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 是最常見的一種神經(jīng)變性病，以進(jìn)行性腦功能失調(diào)為特征的疾病，表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知、語(yǔ)言和行為障礙以及人格改變等[1]。AD的典型病理特征為由beta-淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ) 細(xì)胞外沉積形成的老年斑(senile plaques，SPs)和細(xì)胞內(nèi)由tau蛋白過(guò)度磷酸化引起的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)[2]。AD目前沒(méi)有確切有效的治療方法，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。

目前，AD中發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要的發(fā)病機(jī)制假說(shuō)包括淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、線粒體功能障礙學(xué)說(shuō)和膽堿能學(xué)說(shuō)等，另外還有興奮毒性損傷學(xué)說(shuō)、鈣學(xué)說(shuō)等[3]。近年來(lái)研究顯示，天然化合物通過(guò)多種機(jī)制能夠抑制AD的發(fā)生，在AD中顯示出多靶點(diǎn)治療特性，成為近年AD治療有益的探索。丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)是從丹參中提取的天然化合物，通過(guò)多種機(jī)制在AD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，本文將對(duì)近年來(lái)SAB在AD中的治療作用的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行總結(jié)，闡述其對(duì)AD治療的相應(yīng)機(jī)制，同時(shí)指出其臨床應(yīng)用和將來(lái)的應(yīng)用趨勢(shì)。

1 SAB的來(lái)源和藥理學(xué)特性

丹酚酸B為唇形科植物丹參(SalviaMiltiorrhizaBge) 的根及根莖提取而得。是丹參中含量最豐富、生物活性最強(qiáng)的水溶性化合物[4]。SAB分子式為C36H30O16，相對(duì)分子質(zhì)量為718.62，該品為棕黃色干燥粉末。SAB為3分子丹參素與1分子咖啡酸縮合而成，是研究較多的丹酚酸之一，對(duì)心、腦、肝、腎等器官均具有重要藥理作用[4]。SAB具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等藥理作用[5]。近年來(lái)研究顯示，SAB在AD中通過(guò)多種機(jī)制對(duì)AD具有治療作用(Tab 1)。

2 SAB在AD中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制

2.1 對(duì)Aβ的作用

2.1.1抑制Aβ產(chǎn)生 Aβ是由淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid-βprecursor protein，APP)經(jīng)不同的分泌酶相繼切割生成[15-16]。APP的加工方式有兩種，即非淀粉樣蛋白生成途徑(non-amyloidogenic pathway)和淀粉樣蛋白生成途徑(amyloidogenic pathway)(Fig 1)。其中非淀粉樣蛋白生成途徑是指α-分泌酶(α-secretase)在APP的Aβ肽段內(nèi)切割生成可溶性的胞外片段APPsα (soluble αAPP)和由99個(gè)氨基酸殘基組成的胞內(nèi)段 CTFα (C terminus fragment α，C83)，再由γ-分泌酶(γ-secretase)切割CTFα生成p3片段和APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域AICD (amyloid precursor protein intracellular cytoplasmic/C-terminal domain)片段。而淀粉樣蛋白生成途徑是指APP先由β-分泌酶(β-secretase)切割生成分泌到胞外的可溶性片段APPsβ (soluble βAPP)和由99個(gè)氨基酸殘基組成的胞內(nèi)段CTFβ (C terminus fragment β，C99)，再由γ-分泌酶切割CTFβ產(chǎn)生留在胞內(nèi)的大約50個(gè)氨基酸的AICD片段和釋放到胞外的不同長(zhǎng)度的Aβ肽段。其中，β-淀粉樣蛋白前體蛋白切割酶-1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE-1)即β-分泌酶是Aβ生成步驟中的限速酶。

Tab 1 Summary of neuroprotective effect of salvianolic acid B in experimental AD model

Fig 1 Schematic representation of amyloid precursor protein (APP) processing pathways

研究顯示，SAB (25～100 μmol·L-1)能夠在轉(zhuǎn)染APPsw (APP Swedish mutant)的SH-SY5Y細(xì)胞中，通過(guò)降低BACE1表達(dá)減少Aβ1-40和Aβ1-41的產(chǎn)生[13]。ADAM10(anti-disintegrin and metalloprotease 10)具有α-分泌酶活性，屬于ADAM家族(即一種去整合素和金屬蛋白酶家族酶)。SAB上調(diào)ADAM10和sAPPα，而對(duì)APP和PS1(Presenilin-1) 的表達(dá)不產(chǎn)生影響，這表明SAB具有促進(jìn)α-分泌酶的活性和抑制β-分泌酶的藥理學(xué)作用，具有調(diào)控α-分泌酶和β-分泌酶活性的雙重作用，從而減少Aβ的產(chǎn)生[13]。在轉(zhuǎn)染APPsw的N2a或H4細(xì)胞中，SAB劑量依賴性降低細(xì)胞外Aβ、APPsβ以及CTFβ (C99)生成，而不影響APP表達(dá)和α-分泌酶以及γ-分泌酶的表達(dá)[14]，進(jìn)一步驗(yàn)證了前人研究結(jié)果，即SAB是β-分泌酶抑制劑。體內(nèi)研究也顯示，SAB能夠通過(guò)抑制BACE1和PS1來(lái)抑制Aβ的產(chǎn)生[17]。以上研究表明，SAB是β-分泌酶抑制劑，能夠通過(guò)抑制β-分泌酶活性從而減少Aβ的產(chǎn)生。但是，關(guān)于SAB對(duì)α-分泌酶以及γ-分泌酶表達(dá)影響的體內(nèi)、外研究結(jié)果不統(tǒng)一，這可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇和檢測(cè)方法差異有關(guān)。

2.1.2抑制Aβ的聚集以及促進(jìn)纖維狀A(yù)β的降解 早期電鏡研究發(fā)現(xiàn)，SAB(10～100 nmol·L-1)與Aβ1-40共孵育，可以抑制纖維化Aβ1-40生成[18]。進(jìn)一步使用硫磺素T(thioflavin-T，Th-T)染色顯示，SAB抑制纖維化Aβ1-40的生成和促進(jìn)纖維化Aβ的解聚[7]。Th-T是一種與淀粉樣纖維特異性結(jié)合而熒光顯著增強(qiáng)的染料，因而常被用來(lái)定性和定量檢測(cè)蛋白質(zhì)和多肽纖維的生長(zhǎng)，以及淀粉樣纖維聚集過(guò)程的檢測(cè)，是最常用的淀粉樣蛋白熒光探針。在發(fā)射波長(zhǎng)482nm處，用ThT的方法檢測(cè)熒光強(qiáng)度，該熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱反映了Aβ的聚集程度，熒光越強(qiáng)說(shuō)明聚集越明顯。通過(guò)Th-T染色方法發(fā)現(xiàn)，SAB(10～100 μmol·L-1)與Aβ1-40和Aβ1-42共孵育，能夠減少熒光強(qiáng)度，表明SAB能夠抑制Aβ的聚集，進(jìn)一步透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)SAB(10～100 μmol·L-1)能夠抑制纖維狀A(yù)β1-40(Aβ fibril)的形成，并促進(jìn)纖維狀A(yù)β1-40的解聚[7]。而通過(guò)圓二色光譜(CD spectra)觀察顯示，SAB能夠抑制Aβ1-40片層結(jié)構(gòu)(β-sheet)的形成[7]。而主要成分為SAB(含有2.21%SAB)的丹參水提物能夠抑制Aβ聚集[19]。以上研究表明，SAB能夠抑制Aβ的聚集以及促進(jìn)纖維狀A(yù)β的降解，這也可能是其在AD中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一。

2.1.3抑制Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和凋亡發(fā)生 SAB在AD中的神經(jīng)保護(hù)作用研究最早源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所張均田教授組的研究，他們發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元中，SAB能明顯增加細(xì)胞活力，降低Aβ1-40誘導(dǎo)的LDH釋放率，并劑量依賴地減少NO釋放[20]。在PC12細(xì)胞中，SAB抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生增加[21]。在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中，SAB通過(guò)抑制前列腺凋亡反應(yīng)基因-4(prostate apoptosis response-4gene，par-4)的表達(dá)來(lái)抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12凋亡發(fā)生[8]。SAB通過(guò)抑制凋亡和ROS產(chǎn)生，抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[9]。SAB能夠抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生、鈣攝取增多和LDH釋放[10]。在體內(nèi)，SAB(20和40 mg·kg-1)能夠抑制牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis，Pg)導(dǎo)致的ROS產(chǎn)生，促進(jìn)抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的產(chǎn)生[17]。這表明在AD中，SAB具有抗氧化的藥理作用。

2.2 抗神經(jīng)炎癥作用近年來(lái)研究顯示，神經(jīng)炎癥(neuroinflammation)是AD的重要病理進(jìn)程，促進(jìn)Aβ和tau蛋白病理，參與AD發(fā)病機(jī)制[22]。許多細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子、化學(xué)趨化因子、炎性小體等參與AD相關(guān)神經(jīng)炎癥進(jìn)程，促進(jìn)AD發(fā)生[23]。而使用天然化合物通過(guò)抗炎機(jī)制對(duì)AD具有治療作用[24-25]。

SAB在AD同樣具有抗炎作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，不同于外周和其他組織駐留的巨噬細(xì)胞。作為對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如神經(jīng)元損傷或感染)的反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活以產(chǎn)生促炎因子(M1表型)或抗炎因子(M2表型)，在AD中，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，能夠?qū)е卵装Y加重和疾病進(jìn)展加速。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細(xì)胞類型，它們對(duì)環(huán)境高度敏感，對(duì)CNS損傷迅速做出反應(yīng)，它們還調(diào)節(jié)神經(jīng)元的成熟并幫助維持其功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子和趨化因子等炎癥分子產(chǎn)生反應(yīng)，并能夠感知如Aβ蛋白的聚集[26-28]。SAB能夠減少小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，另外，SAB能夠降低COX2和iNOS的表達(dá)以及TBARS產(chǎn)生[12]。最近的一項(xiàng)研究證明，SAB具有抗神經(jīng)炎癥作用，在AD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究顯示，AD病人腦中存在的牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgin givalis，Pg)能夠通過(guò)促進(jìn)Aβ聚集，參與AD發(fā)病[17]。SAB(20,40 mg·kg-1)能夠降低Pg引起的IL-1β 和IL-6生成，升高腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)的mRNA水平[17]。

2.3 SAB調(diào)控Nrf2/HO-1通路Nrf2系統(tǒng)與線粒體生物發(fā)生和線粒體質(zhì)量控制正相關(guān)，活化的Nrf2直接或間接上調(diào)線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活物1-α(PGC-1α)，從而促進(jìn)線粒體發(fā)生，保護(hù)線粒體功能。SAB在AD中神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與其對(duì)線粒體保護(hù)和激活Nrf2/HO-1通路有關(guān)[21]。SAB對(duì)Aβ誘導(dǎo)的線粒體異常具有保護(hù)作用。 SAB可顯著減輕Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi)谷胱甘肽(GSH)和脂質(zhì)氧化產(chǎn)生，并抑制線粒體過(guò)多的超氧化物生成。此外，SAB促進(jìn)膜電位的恢復(fù)和ATP生成的增加，以及恢復(fù)細(xì)胞色素C氧化酶和F1F0-ATP合酶的活性。SAB減輕Aβ誘導(dǎo)的軸突線粒體斷裂和降低線粒體動(dòng)力樣蛋白DLP1(dynamin-like protein 1) 的磷酸化。最后，SAB能夠恢復(fù)Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元突觸密度的減低?？傊?，SAB具有調(diào)控線粒體功能，在AD中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[29]。而在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中，SAB上調(diào)細(xì)胞核中Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)，下調(diào)Keap-1蛋白表達(dá)，表明SAB具有激活Nrf2/HO-1通路的作用。

2.4 改善AD認(rèn)知功能障礙最近研究顯示，SAB (10 mg·kg-1)口服給藥，能夠明顯改善Aβ25-35(10 nmol/5 μL)或東莨菪堿(scopolamine，SCO)誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知功能障礙[11]。SCO (1 mg·kg-1)型膽堿受體拮抗劑，可阻斷大腦皮層和海馬區(qū)乙酰膽堿對(duì)M受體的激動(dòng)作用，從而對(duì)記憶獲得產(chǎn)生阻抑效應(yīng)，誘導(dǎo)癡呆發(fā)生。目前SCO已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在評(píng)估神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物。腹腔給藥3 mg·kg-1后可造成動(dòng)物記憶功能障礙，東莨菪堿用于誘導(dǎo)動(dòng)物記憶障礙模型具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、方便等優(yōu)點(diǎn)，故常應(yīng)用于抗AD活性化合物的初步篩選。進(jìn)一步研究顯示，而GABAA型受體激動(dòng)劑(muscimol or diazepam)拮抗SAB對(duì)小鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用，這表明，SAB可以通過(guò)GABA能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)來(lái)改善膽堿能功能失調(diào)或Aβ25-35誘導(dǎo)的記憶損害[11]。最近研究顯示，SAB(10 mg·kg-1)能夠改善Aβ25-35誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知功能障礙[12]。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，SAB抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的降低有關(guān)[12,30]。總之，SAB能夠在AD模型中發(fā)揮對(duì)認(rèn)知的改善作用。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，SAB能夠通過(guò)抑制Aβ產(chǎn)生、聚集，促進(jìn)Aβ清除，抑制Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和凋亡發(fā)生機(jī)制對(duì)AD具有治療作用。同時(shí)其可以保護(hù)線粒體，調(diào)控Nrf2/ARE通路，進(jìn)而上調(diào)HO-1參與對(duì)AD的治療作用(Fig 2)。

Fig 2 Schematic representation of SAB-mediated neuroprotection in AD

目前臨床研究注冊(cè)網(wǎng)站(clinicaltrials.gov)有4項(xiàng)關(guān)于丹酚酸的臨床注冊(cè)研究，分別是對(duì)腦卒中、糖尿病、糖尿病周圍神經(jīng)病和健康受試者的研究，其中3項(xiàng)是關(guān)于丹酚酸A的研究。而中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心(https://www.chictr.org.cn/index.aspx) 目前還沒(méi)有關(guān)于丹酚酸的臨床注冊(cè)研究。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所杜冠華研究員課題組關(guān)于國(guó)家1類新藥丹酚酸A片治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的II期多中心臨床試驗(yàn)研究正在北京協(xié)和醫(yī)院開展之中。盡管目前研究顯示，SAB具有明確的抗AD作用，但是目前尚無(wú)關(guān)于SAB治療AD的臨床研究，鑒于丹酚酸的良好藥理作用，對(duì)于SAB在AD患者水平的治療探索研究值得期待。