miR-142-3p 在感染后腸易激綜合征中的表達(dá)及意義

林湫泠 張定國(guó) 熊鋒 姚君

感染后腸易激綜合征（PI-IBS）， 是腸易激綜合征（IBS）的重要類型和研究熱點(diǎn)［1］。PI-IBS 的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確，報(bào)道表明腸道感染引起的黏膜炎癥反應(yīng)和免疫功能激活可能是PI-IBS發(fā)病的重要因素［2-4］。微RNA（miR）-142-3p 是一種在結(jié)直腸等多種組織器官中高表達(dá)的miRNA，對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。我們對(duì)miR 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)差異顯著的miR-142-3p 可能可以作為PI-IBS 的生物學(xué)標(biāo)志物。前期臨床實(shí)驗(yàn)表明，與正常人群的樣品相比，PI-IBS患者樣品中miR-142-3p 水平明顯下調(diào)，提示miR-142-3p 與PI-IBS 發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。本研究擬進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面探討miR-142-3p 在PI-IBS中的表達(dá)及意義，闡明miR-142-3p 調(diào)控PI-IBS 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為PI-IBS 的臨床治療提供理論依據(jù)和治療手段。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

miR-142-3p、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和Toll 樣受體4（TLR4）引物（北京擎科生物科技有限公司），HMGB1 小干擾RNA（siRNA）及陰性對(duì)照（廣州艾基生物技術(shù)有限公司），脂多糖（LPS）、胃蛋白酶（美國(guó) Sigma 公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）， 原代腸上皮細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），TRIzol 試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），轉(zhuǎn)染試劑（深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）。

二、 PI-IBS 大鼠模型建立

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10 只SD 雄性大鼠由深圳市人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供，鼠齡6～7 周，體質(zhì)量23～26 g，所有大鼠飼養(yǎng)在恒溫、恒濕的清潔級(jí)動(dòng)物房，光線調(diào)整為12 h日/夜循環(huán)。采用旋毛蟲感染建立PI-IBS 大鼠模型，采用旋毛蟲造模過(guò)程如下：將旋毛蟲保種大鼠乙醚麻醉后，頸椎脫臼處死，剔取四肢及膈肌肌肉。將肌肉盡量剪碎后置于500 mL 含有2.5%胃蛋白酶和0.5%鹽酸的消化液中，置于37 ℃水浴消化 12～20 h。反復(fù)將消化后混合液經(jīng) 200 目濾布過(guò)濾收集旋毛蟲幼蟲。將濾液收集 500 r/min，10 min 離心，棄上清，重 懸 于pH 為7.2～7.4 的PBS，計(jì)數(shù)調(diào)整濃度至1500 只/mL。給予每只大鼠0.2 mL 含350～400 條幼蟲的瓊脂懸液灌胃，感染后飼養(yǎng)8 周，建立PI-IBS 模型。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)深圳市人民醫(yī)院審批通過(guò)（醫(yī)院倫理編號(hào)：LLKY-2021248）。

2. siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

原代腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)于12 孔板中。細(xì)胞達(dá)到60%～80%匯合度時(shí)，用jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑開展siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。首先取10 μL 的HMGB1 siRNA（10 nmol）及陰性對(duì)照 siRNA（10 nmol）添加到100 μL jetPRIME?buffer 中，渦旋10 s，離心10 s，隨后向混合液中加入3 μL jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑，渦旋振蕩后，室溫靜置10 min。隨后將混懸液滴加到細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后用LPS （500 ng/mL）及miR-142-3p 處理細(xì)胞24 h，最后收集腸上皮細(xì)胞總RNA。

3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

檢 測(cè) 細(xì) 胞 中miR-142-3p、HMGB1 和TLR4 mRNA 的表達(dá)水平：提取腸上皮細(xì)胞細(xì)胞總RNA：使用TRIzol 試劑盒進(jìn)行提取。cDNA 合成：根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作。miR-142-3p 引物序列：正 向 引 物 為5′-GGGTGTAGTGTTTCCTAC-3′，反向 引 物 為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3′。HMGB1引物序列：正向引物為5′-AGGATCCCAATGCACC CAAGAG-3′，反向引物為5′-TTCGCAACATCACCA ATGGACAG-3′。

TLR4 引物序列：正向引物為5′-GGTCAGAC GGTGATAGCGAG-3′，反向引物為5′-GGTCCAGGT TCTTGGTTGAG-3′。qRT-PCR 反應(yīng)：a 反應(yīng)條件：SYBR Green（2×）5 μL/孔，cDNA 2 μL/ 孔，正反向引物各 0.5 μL/ 孔， ddH2O 2 μL/ 孔；b 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（35次循環(huán)）。反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-142-3p、HMGB1 和TLR4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U 檢驗(yàn)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-142-3p 在腸上皮細(xì)胞中具有抗炎作用

基于miR-142-3p 可能與HMGB1-TLR4 有潛在的相關(guān)性，筆者將在大鼠腸上皮細(xì)胞上考察miR-142-3p 對(duì)HMGB1-TLR4 靶基因的作用。炎癥基因NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α 均為HMGB1-TLR4 的靶基因。使用LPS 刺激后，施加miR-142-3p 大大抑制了NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α 的表達(dá)，這表明miR-142-3p 具有抗炎作用（圖1）。

圖1 miR-142-3p 在LPS 處理的腸上皮細(xì)胞中對(duì)炎癥基因的影響

二、HMGB1 是miR-142-3p 的靶基因

TargetScan 預(yù)測(cè)軟件分析表明miR-142-3p 在HMGB1 的3′UTR 上有潛在的結(jié)合位點(diǎn)（CACUAC），表明miR-142-3p 很有可能調(diào)控HMGB1 的表達(dá)（圖2A）。此外，此結(jié)合位點(diǎn)在不同種屬之間有良好的 保 守 性。miR-142-3p 可 抑 制HMGB1 3′UTR 活性，miR-142-3p 濃度越高，HMGB1 3′UTR 活性越低（F = 10.86，P ＜0.05，其中miR-142-3p 濃度為50 nmol vs. 25 nmol，P = 0.0102 ；miR-142-3p 濃度100 nmol vs. 25 nmol，P = 0.0001）（圖2B）。然而當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)锳CGCGA，miR-142-3p 不再調(diào)控HMGB1 3′UTR 的 活 性，這 表 明miR-142-3p 調(diào)控HMGB1 依賴結(jié)合位點(diǎn)CACUAC（圖2C）。

圖2 miR-142-3p 在HMGB1 的潛在結(jié)合位點(diǎn)

三、miR-142-3p 的抗炎作用依賴于HMGB1

為驗(yàn)證HMGB1 在miR-142-3p 抗炎中的介導(dǎo)作用，筆者團(tuán)隊(duì)用siRNA 對(duì)腸上皮細(xì)胞中的HMGB1 進(jìn)行靶向敲低。siRNA 可以使細(xì)胞中的HMGB1 表達(dá)降低超過(guò)80%，這證明敲低效率高，結(jié)果可靠（圖3A，P ＜0.05）。敲低細(xì)胞中HMGB1后，miR-142-3p 失去抗炎作用（圖3B）。這表明miR-142-3p 通過(guò)抑制HMGB1 來(lái)達(dá)到抗炎效果。

圖3 HMGB1 在miR-142-3p 抗炎中的作用

討 論

IBS 是一種以復(fù)發(fā)性腹部不適或疼痛為特征的臨床綜合征［5-6］。在全球范圍內(nèi)，IBS 在男性中的發(fā)病率為4%，在女性中為14%，且發(fā)病年齡多集中于青壯年，并具有慢性、易復(fù)發(fā)性等特點(diǎn)，已成為嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的主要疾患之一［5-6］。臨床研究顯示，急性胃腸道感染與IBS 發(fā)病關(guān)系密切，3%～36%的急性腸道感染患者最終會(huì)發(fā)展為IBS［7］。這種在感染性胃腸炎發(fā)生后形成的IBS 又稱PI-IBS， 是IBS 的重要類型和研究熱點(diǎn)［4］。PIIBS 的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確，有研究認(rèn)為細(xì)胞因子失衡、腸道菌群失調(diào)，特別是腸道免疫應(yīng)答的異常激活是導(dǎo)致PI-IBS 發(fā)生的關(guān)鍵因素［2-4］。筆者團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn)PI-IBS 患者體內(nèi)抗炎和促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平存在失衡，其導(dǎo)致低度炎癥和免疫激活最終導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。通過(guò)恢復(fù)PIIBS 患者體內(nèi)細(xì)胞因子的穩(wěn)態(tài)，可以有效預(yù)防和緩解PI-IBS 的癥狀。由于免疫細(xì)胞因子和應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，因此發(fā)掘更多調(diào)節(jié)PI-IBS 腸道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)于闡明PI-IBS 發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新型治療方法至關(guān)重要。

miR 是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的多種生理過(guò)程，其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。得益于核酸藥物和靶向遞送理論和轉(zhuǎn)化研究的迅猛發(fā)展，目前已有靶向miR 的藥物進(jìn)入到臨床研究。miR-142-3p 是一種在結(jié)直腸等多種組織器官中高表達(dá)的miR，對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。Zhai 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p 通過(guò)靶向自噬基因ATG16L1 緩解炎癥反應(yīng)。筆者對(duì)miRNA 靶基因測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)差異明顯的miR-142-3 可能可以作為PIIBS 的生物學(xué)標(biāo)志物。HMGB1 是一種重要的晚期致炎因子，參與多種組織和細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。HMGB1 可通過(guò)與TLR 家族受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路（如核因子κB）和炎癥小體（如NLRP3），促進(jìn)細(xì)胞因子的合成和釋放，調(diào)控免疫應(yīng)答反應(yīng)，并參與多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生［9-10］。HMGB1 是一種炎癥性蛋白，其廣泛分布于各種組織中，并可通過(guò)與多種受體結(jié)合促進(jìn)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，參與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。TLR是HMGB1 的重要受體，參與多種感染和機(jī)體損傷機(jī)制。HMGB1 可以和TLR4、TLR2 受體結(jié)合，引起核因子κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)［11-12］。有 研 究 顯示，HMGB1 在NSAID 誘導(dǎo)的PI-IBS 中起到重要作用。使用NSAID 誘導(dǎo)PI-IBS 后，大鼠腸道和血清中的HMGB1 表達(dá)提高，施加人重組HMGB1 蛋白會(huì)加重NSAID 誘導(dǎo)的腸道損傷，激活核因子κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)腸道TNF-α 等促炎因子的表達(dá)，并同時(shí)降低抗炎因子IL-10 的水平，而HMGB1 抗體則能部分阻斷NSAID 誘導(dǎo)的腸道損傷［13］。另外，敲除HMGB1 的TLR4 后，明顯緩解HMGB1 的加重腸道損傷，證明HMGB1-TLR4 信號(hào)通路在調(diào)控NSAID 誘導(dǎo)的PI-IBS 中發(fā)揮重要作用［13］。

筆者團(tuán)隊(duì)前期收集PI-IBS 患者及健康人群的樣品各10 例進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)miR-142-3p、HMGB1 和 TLR4 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與正常人群相比，PI-IBS 患者中miR-142-3p 水平明顯下調(diào)，而HMGB1 和TLR4 的mRNA 水平明顯上調(diào)。這說(shuō)明miR-142-3p 可能與HMGB1-TLR4 有潛在的相關(guān)性。之后在大鼠腸上皮細(xì)胞中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-142-3p 可 降 低HMGB1-TLR4- 核 因 子κB 的 靶 炎癥 基 因 如NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α的表達(dá)，并且此抗炎作用依賴于HMGB1。這提示miR-142-3p 對(duì)HMGB1 的調(diào)節(jié)可能與PI-IBS 的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步的軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明miR-142-3p 可以與HMGB1 的3′-UTR 直接結(jié)合?；谝陨献C據(jù)，筆者團(tuán)隊(duì)預(yù)測(cè) miR-142-3p 可能通過(guò)抑制晚期促炎因子HMGB1 的表達(dá)，下調(diào)TLR4-NFκB/NLRP3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而減輕腸道黏膜的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，最終防止PI-IBS 的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)筆者將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)解析miR-142-3p 在PI-IBS 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，并對(duì)其下游炎癥反應(yīng)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行探索和驗(yàn)證，以揭示并闡明miR-142-3p 調(diào)控PI-IBS 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為PI-IBS 的臨床治療提供理論依據(jù)和治療手段。