睡眠剝奪導致小鼠行為異常及海馬小膠質細胞過度活化

劉明月，張洋銘，黃 鑫，成子碩，郭保霖，武勝昔，楊彥玲

(1延安大學醫(yī)學院生理教研室，陜西 延安 716099；2空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院神經生物學教研室，陜西 西安 710032)

睡眠不足是當今社會普遍存在的公共衛(wèi)生問題，長期睡眠不足導致癌癥、猝死、心血管等疾病[1]的發(fā)生率顯著增高，同時也會引發(fā)學習認知能力受損、焦慮抑郁情緒異常等。這些嚴重地影響人類的生活質量和工作效率，同時降低社會的生產效率。然而，目前睡眠不足導致相關行為異常的機制尚不清晰。既往研究發(fā)現(xiàn)6 h睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)誘發(fā)小鼠前額葉皮層小膠質細胞異?；罨鹭撔郧榫w發(fā)生[2]，然而其是否同樣介導長時程SD誘發(fā)的行為異常仍不清楚。因此，建立長時程SD模型、闡明其誘發(fā)的相關高級腦功能改變、探究關鍵腦區(qū)小膠質細胞的改變對于理解SD和找尋潛在的干預靶點具有重要的科學意義。

在本研究中，我們成功構建了72 h SD小鼠模型，通過高架十字迷宮實驗、曠場實驗和新物體識別實驗檢測SD在焦慮行為表型以及認知記憶中產生的負面影響[3]，進一步利用免疫組化染色結合小膠質細胞形態(tài)學分析的方式探究小膠質細胞在該過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性C57小鼠(20～25 g)16只，每4～6只一籠飼養(yǎng)于特定的無病原體實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，控制溫度為22～24 ℃，飼養(yǎng)環(huán)境保持12 h晝夜節(jié)律。本研究由空軍軍醫(yī)大學實驗動物福利與倫理委員會批準(許可證號：IACUC-20211053)，按照《實驗動物飼養(yǎng)和使用指南》(國家衛(wèi)生研究院出版物第80～123號，1996年修訂)進行，將小鼠隨機分為SD組和對照組，每組8只。

實驗儀器：恒冷冰凍切片機(Lecia CM3050S，德國)；改良多平臺SD平臺(實驗室定制)；曠場(實驗室定制)；高架十字迷宮(實驗室定制)；共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000，日本)；行為視頻分析軟件(Panlab SMART 3.0，西班牙)。

1.2 方法

1.2.1 SD動物模型的建立 SD動物模型構建采用改良多平臺SD法SD裝置[4]，SD裝置是一個大小為25 cm×35 cm×16 cm的聚丙烯材質水槽，內置12根間距相同，直徑為3 cm、高度為5 cm的木質圓柱，水槽內注有24 ℃溫水，水平面在圓柱頂端下1 cm處。小鼠能夠在圓柱平臺之間自由行動，但無法橫跨趴在兩根圓柱之間休息，當小鼠進入快速眼動睡眠時，由于四肢肌肉松弛，肌張力降低而觸水或落入水中被喚醒，使之保持清醒狀態(tài)。SD過程中小鼠能夠自由地從裝置頂端攝取水和食物。在本實驗中，SD組小鼠從第1日上午08∶30至第3日上午08∶30進行SD。實驗過程中每日更換2次裝置內的水以保持水質清潔。對照組小鼠置于沒有水的相同裝置。SD結束后，用吸水紙巾輕輕擦去小鼠身上的水跡，進行后續(xù)的行為學實驗。

1.2.2 動物行為學檢測

1.2.2.1 高架十字迷宮實驗及數(shù)據(jù)分析 將小鼠提前4 h放入實驗等待區(qū)適應環(huán)境。實驗區(qū)與外界隔音，光照均勻，亮度為20 lx，環(huán)境溫度維持在(22.0±0.5) ℃。實驗裝置由兩個開放臂(25 cm×8 cm×12 cm)和兩個封閉臂(25 cm×8 cm×12 cm)組成。實驗時輕柔地將小鼠從飼養(yǎng)籠子中取出，放入高架十字中心區(qū)域，確保小鼠頭部朝向開放臂的方向。釋放小鼠同時進行數(shù)據(jù)采集，視頻錄制5 min[5]。每只小鼠測試結束后清理糞便、尿液后使用750 mL/L乙醇去除氣味，待實驗設備完全干燥后進行下一個實驗，整個實驗過程保持環(huán)境安靜。采用頭-體-尾三點法分析小鼠運動軌跡，使用SMART 3.0統(tǒng)計開臂進入次數(shù)、開臂滯留時間。

1.2.2.2 曠場實驗及數(shù)據(jù)分析 曠場實驗在一個空曠的正方形箱體(50 cm×50 cm×50 cm)中進行。測試開始時，將每只小鼠放置在角落中，并通過位于曠場上方的攝像機記錄5 min[6]。每次實驗后，用750 mL/L乙醇清理小鼠排泄物，擦洗曠場內壁及縫隙。用SMART 3.0統(tǒng)計分析小鼠進入曠場中心區(qū)域的次數(shù)、在中心區(qū)探索滯留花費的時間以及運動的總距離。曠場的中心面積為總面積的25%(約25 cm×25 cm的正方形)。

1.2.2.3 新物體識別實驗及數(shù)據(jù)分析 72 h SD后，我們對小鼠進行新物體識別實驗。將兩個相同但對于小鼠完全陌生的物塊放至距正方形箱體測內壁10 cm處[7]。物塊在放入前用750 mL/L乙醇噴洗干凈并晾干。實驗包括適應、學習和測試三個階段。適應階段將小鼠放入曠場中對曠場的環(huán)境進行5 min的適應；學習階段讓小鼠對兩個形狀以及顏色相同的物塊進行10 min的學習；測試階段將學習階段的一個物塊用形狀、顏色均不相同的新物塊進行替代。實驗在20∶00～23∶00區(qū)間(夜晚周期)進行，輕柔地將小鼠放置在曠場的一角后開始錄制。利用SMART 3.0軟件分析小鼠對物塊探索時間。

1.2.3 組織處理及免疫熒光染色

1.2.3.1 動物組織獲取及處理 行為學實驗結束后，利用50 mL/L異氟烷對小鼠進行氣體麻醉，同時用手術剪刀剪開其胸腔，暴露心臟。用一次性注射器吸取0.01 mol/L PBS 15 mL，將針尖插入小鼠心臟左心室，剪開右心耳后推入PBS置換血液。待小鼠肝臟泛白后，換成預冷的40 mL/L多聚甲醛，灌注約100 mL。待小鼠全身僵硬后，小心剪開其頭皮及顱骨，暴露鼠腦，用鑷子完整取出大腦組織放入裝滿40 mL/L多聚甲醛的離心管中，并于4 ℃冰箱過夜。固定結束后，將組織轉移至配好的300 g/L蔗糖溶液中脫水，置于4 ℃冰箱保存。從蔗糖中取出鼠腦，用冰凍包埋劑包埋，在恒冷冰凍切片機中，進行連續(xù)冠狀切片，片厚50 μm，將包含海馬腦區(qū)的組織切片收集入0.01 mol/L PBS中備用。用PBS漂洗組織3次后，將其轉移入冰凍保護液中，置于-20 ℃保存。

1.2.3.2 免疫熒光染色 從冰凍保護液中取出切片，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。將組織切片挑出放入抗體孵育板中，加入50 mL/L驢血清，室溫下封閉2 h。而后轉移至Goat-anti-Iba1(# 011-27991，1∶500，Wako)一抗中，4 ℃孵育過夜。孵育結束后使用PBS漂洗3次，每次10 min。而后在室溫下將組織切片轉移至Alexa 594-conjugated Donkey-anti-Goat(A-11058，1∶500，Invitrogen)二抗中避光孵育3 h。結束后用PBS漂洗3次，每次10 min。染色后將腦片裱在載玻片上，而后利用防淬滅熒光封片劑進行封片保存。

1.2.4 小膠質細胞面積分析 使用40倍共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus公司)采集小膠質細胞圖像(Z軸方向每0.5 μm拍攝1張)。每組共追蹤到海馬背側CA1腦區(qū)細胞帶臨近區(qū)域的10個完整小膠質細胞。采集圖片后使用ImageJ軟件的NeuronJ插件對神經元形態(tài)進行描繪。細胞面積測量方法同之前的研究，利用插件進行計算[8]。進一步對小膠質細胞數(shù)量計數(shù)并進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 SD導致小鼠焦慮樣行為改變

為了探究SD是否會導致小鼠出現(xiàn)焦慮樣情緒，在小鼠進行SD后對其進行高架十字迷宮檢測和曠場實驗檢測。在高架十字迷宮實驗中(圖1A)，使用SMART 3.0軟件中的頭-體-尾三點法分析小鼠運動軌跡，并繪制出小鼠運動軌跡圖(圖1B)。結果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠在開放臂區(qū)域存在一定的探索行為，而SD組小鼠進入開放臂的時間顯著少于對照組小鼠(P<0.05,圖1C～D)。同時，SD組小鼠進入開放臂的次數(shù)較對照小鼠顯著降低(P<0.01,圖1E)。

A：72 h SD示意圖及高架十字迷宮行為實驗示意圖；B：小鼠在高架十字迷宮中的典型軌跡圖；C:小鼠在高架十字迷宮實驗中滯留在開放臂的時間柵狀圖；D：兩組小鼠開放臂探索停留時間比較兩組小鼠進入開放臂探索次數(shù)比較睡眠剝奪。圖1 成年SD小鼠在高架十字迷宮中的行為學改變

在曠場實驗中(圖2A)，同樣利用SMART 3.0軟件對錄像結果進行分析，使用4×4分割法，將曠場等分為16個區(qū)域，界定中間4個區(qū)域為曠場的中心區(qū)域(圖2B)，并繪制出小鼠在曠場實驗中的運動軌跡圖(圖2C)，結果顯示，SD組小鼠進入曠場中間區(qū)域探索的時間顯著少于對照組小鼠(P<0.01,圖2D)；SD組小鼠進入曠場中間區(qū)域的次數(shù)顯著少于對照組小鼠(P<0.01,圖2E)；SD組小鼠在曠場的運動總路程降低(圖2F)；兩組小鼠進入曠場中間區(qū)域探索行為存在差異(圖2G)。以上行為學實驗證明，SD會導致小鼠出現(xiàn)明顯的焦慮樣行為。

A：72 h SD示意圖及曠場行為實驗流程圖；B：4×4分析法中曠場中心區(qū)域示意圖；C：小鼠在曠場實驗中的典型軌跡圖；D：SD小鼠進入中間區(qū)域探索停留的時間小鼠進入中間區(qū)域探索的次數(shù)F：SD小鼠在曠場運動的總路程降低小鼠在曠場中心區(qū)域的探索情況。SD：睡眠剝奪。圖2 成年SD小鼠在曠場實驗中的行為學改變

2.2 SD導致小鼠出現(xiàn)認知記憶功能的改變

為了探究SD對認知功能的影響，我們對小鼠進行了新物體識別實驗檢測(圖3A～B)。結果發(fā)現(xiàn)，在第2日測試階段，對照組小鼠對新物體出現(xiàn)了明顯的識別偏好，探索時間明顯高于舊物體(P<0.01)；而SD組小鼠則對新物體無明顯偏好，且對新、舊物體的探索時間無明顯差異(圖3C)。計算其偏好指數(shù)發(fā)現(xiàn)，SD組小鼠對新物體的偏好指數(shù)明顯低于對照組小鼠(P<0.01,圖3D)。以上結果證明，SD損傷了小鼠對新事物的認知功能。

A：新物體識別實驗流程圖；B：新物體識別實驗模式圖；C：小鼠對新舊物體探索的時間識別指數(shù)(小鼠探索新物體時間/新舊物體時間之和)睡眠剝奪。圖3 成年SD小鼠在新物體識別實驗中的行為學改變

2.3 SD誘導海馬區(qū)域小膠質細胞異常激活

海馬是情緒及認知編碼的重要腦區(qū)。72 h SD后，我們對兩組小鼠進行灌注取材，而后進行了海馬區(qū)域免疫組織熒光染色，標記表達Iba1的小膠質細胞并進行三維重塑及形態(tài)學分析(圖4A)。通過分析小膠質細胞樹突分支與不同半徑同心圓的交叉點數(shù)顯示，總體交叉點數(shù)SD組顯著高于對照組(P<0.01,圖4B～C)，平均交叉點數(shù)SD組也顯著高于對照組(P<0.01,圖4D)；且通過分析小膠質細胞的面積和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)域SD組小膠質細胞的細胞數(shù)量及細胞面積均相較于對照組出現(xiàn)了明顯增高(P<0.05，P<0.01，圖4E～F)。上述結果初步證實了SD能夠誘發(fā)海馬區(qū)域小膠質細胞出現(xiàn)異常激活，可能參與了SD誘發(fā)情緒及認知異常的發(fā)生發(fā)展。

A：小膠質細胞的三維重建(標尺為20 μm)；B～C：Sholl分析中小膠質細胞樹突分支與不同半徑同心圓的交叉點數(shù)分析結果中小膠質細胞突起的平均分支數(shù)海馬中Iba1陽性細胞的數(shù)量(每組n=10個細胞/8只小鼠)小膠質細胞面積的定量(每組n=10個細胞/8只小鼠)睡眠剝奪。圖4 SD對小鼠海馬中的小膠質細胞形態(tài)的影響

3 討論

SD嚴重影響身心健康。臨床研究和動物實驗發(fā)現(xiàn)睡眠不足會誘發(fā)負性情緒及認知功能不可逆的損害，然而相關機制尚未完全闡明[9-10]。研究表明，SD對機體的影響與免疫炎癥反應密切相關。其主要通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經系統(tǒng)，引起機體炎癥反應。在嚙齒類相關研究中發(fā)現(xiàn)，SD能夠打破機體促炎及抗炎平衡穩(wěn)態(tài)，同時大量的炎癥因子如TNF-α、IL-1β等表達增加[11]。因此從神經免疫炎癥角度入手是探尋SD潛在神經機制的重要方向。

睡眠在調節(jié)認知和情緒方面發(fā)揮著重要作用。早在1983年研究者就提出了睡眠對記憶鞏固過程至關重要，隨著研究的不斷深入，睡眠和記憶的關系被廣泛證實。海馬和額葉與情緒認知有很大的關系[12]，海馬是調節(jié)記憶的經典腦區(qū)，額葉與情緒調節(jié)有關。大量研究表明，睡眠不足會導致認知功能的損害，同時會導致學習、記憶能力下降[13-16]。據(jù)ESTRADA等[17]研究報道，SD對機體的空間學習記憶有一定的損傷。TUAN等[18]通過新物體識別實驗發(fā)現(xiàn)SD對小鼠短期記憶同樣有不良的影響。在本研究中，SD后的小鼠同樣表現(xiàn)出記憶能力的降低，即在新物體識別實驗中，SD組的小鼠無法區(qū)分出新舊物體，這與以往的報道相一致[19]。另外，既往研究表明SD與焦慮等情緒相關，SD會導致動物出現(xiàn)明顯的焦慮狀態(tài)，且在完全SD的狀態(tài)下也有相似的結果[20]。本研究中的結果與其報道一致，72 h SD后，SD組小鼠在高架十字迷宮中進入開放臂的次數(shù)及其滯留于開放臂的時間均低于對照組小鼠，提示SD小鼠表現(xiàn)出了明顯的焦慮樣行為。此外，72 h SD后的小鼠，在曠場實驗中進入曠場中心區(qū)域的次數(shù)、滯留于中心區(qū)域的時間以及運動的總距離顯著低于對照組小鼠。

研究表明，大鼠認知功能的損傷與PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達上調有關[21]。SD加重小鼠海馬區(qū)域Aβ斑塊沉積和小膠質細胞激活，降低了海馬區(qū)PSD-95的表達，導致小鼠的短期工作記憶、長時程空間參考記憶和恐懼記憶等多種類型的認知損傷加重[22]。在本研究中，我們從形態(tài)學角度驗證了SD會導致海馬小膠質細胞的過度活化，而活化的小膠質細胞是否會進一步通過對神經突觸的異常修剪等過程影響局部神經環(huán)路功能穩(wěn)態(tài)，進而造成行為異常仍需要進一步探索。

本研究存在一定的局限性：①相關認知檢測僅限于空間位置記憶，后續(xù)還需對SD導致恐懼、文字等記憶形式認知受損進行進一步的探索驗證；②對小膠質細胞的觀察僅限于形態(tài)學，后續(xù)需從信號通路、膠質細胞-神經元交互等角度做進一步的機制研究。

綜上所述，本研究結果表明，72 h SD會導致小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為的改變以及認知功能的障礙，海馬CA1小膠質細胞發(fā)生了過度活化。探明小膠質細胞參與SD誘發(fā)行為異常發(fā)生的機制、建立靶向過度活化的小膠質細胞干預策略將對未來防治SD對高級腦功能的影響具有重要意義。