右美托咪定對(duì)原位肝移植大鼠VEGFR-3/VEGF-C通路及缺血再灌注損傷的影響

張昆 夏建國(guó) 陳群 (武漢市第三醫(yī)院 麻醉科,湖北 武漢 43006; 燒傷科)

原位肝移植(SOLT)是指將病肝連同后下腔靜脈一并切除,植入肝與受體同名血管相吻合的一種手術(shù)方式,為治療肝臟惡性腫瘤和終末期肝病的主要方法,但該過(guò)程中易導(dǎo)致缺血再灌注損傷(IRI)且無(wú)法避免,是導(dǎo)致移植物早期肝功能喪失、器官排斥的主要因素之一〔1,2〕。炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)是肝臟IRI 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素〔3,4〕,而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)-3 及其配體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-C上調(diào)表達(dá)可抑制炎癥通路,增加抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,改善肝移植IRI〔5,6〕。因此探究VEGFR-3/VEGF-C 通路在SOLT 過(guò)程中調(diào)控作用,對(duì)闡明肝移植IRI 機(jī)制具有一定臨床意義。右美托咪定(Dex)是一種新的重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)鎮(zhèn)靜藥,已證實(shí)Dex 可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激達(dá)到對(duì)肝癌、肝移植、肝IRI 的保護(hù)效果〔7,8〕。但Dex 保護(hù)肝移植過(guò)程中避免IRI 的具體分子生物學(xué)機(jī)制還不甚明確,Dex 對(duì)肝移植過(guò)程中VEGFR-3/VEGF-C 通路的影響也不清楚。本研究通過(guò)建立SOLT 大鼠模型,對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探究,旨在闡明Dex 抑制肝移植過(guò)程中IRI 的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性同遺傳背景Sprague Dawley 大鼠,清潔級(jí),200～220 g,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SCXK(粵)2018-0002〕。所有大鼠于武漢市第三醫(yī)院動(dòng)物房中飼養(yǎng)。本試驗(yàn)符合3R 原則,且經(jīng)武漢市第三醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及儀器 Dex 購(gòu)自南京賽泓瑞生物公司(規(guī)格:100 mg,貨號(hào):T2524);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司(貨號(hào):G1120);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào):JK-ELISA-12191,購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司);總膽紅素(TBIL)ELISA試劑盒(貨號(hào):MM1005R2,購(gòu)自廣州市超博科技有限公司);白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA 試劑盒(貨號(hào):YS04528B,購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司);腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA 試劑盒購(gòu)自上海三抒生物公司( 貨號(hào): ss301254);VEGFR-3 抗體( 貨號(hào):ab243432)、VEGF-C 抗體(貨號(hào):ab32152)、促細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子(SOCS)1 抗體(貨號(hào):ab62584)、磷酸化糖原合成酶激酶(p-GSK)3β 抗體(貨號(hào):ab75745)、Toll 樣受體(TLR)4 抗體(貨號(hào):ab217274)購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司;胰蛋白酶(貨號(hào)P0231)、BCA 蛋白定量試劑盒(貨號(hào)P0768)購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司。SMZ745 光學(xué)顯微鏡(尼康,日本);RM2125RTS 手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica,德國(guó));1659001 型蛋白電泳儀、Trans-Blot SD 半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad,美國(guó));GIS-500 凝膠成像儀(米歐儀器有限公司,杭州)等。

1.2 SOLT 大鼠造模及分組給藥 50 只SD 大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)(Sham)組、自體原位肝移植模型( SOLT) 組、Dex 低(25 μg/kg)、中(50 μg/kg)、高(100 μg/kg)劑量組,每組10 只;除Sham 組僅行開(kāi)腹、暴露肝臟、關(guān)腹外,其余4 組大鼠均采用自體肝臟原位移植法建立SOLT 模型〔9〕:戊巴比妥鈉麻醉大鼠,呈仰臥姿勢(shì),固定四肢,于腹部自劍突下到恥骨聯(lián)合上方正中切口,離斷左三角韌帶、肝鐮狀韌帶,向左翻轉(zhuǎn)肝臟,打開(kāi)右側(cè)后腹膜,分離肝上腔靜脈(SHVC)、肝下腔靜脈(IHVC);剪開(kāi)肝十二指腸韌帶,充分分離和顯露門(mén)靜脈(PV)、肝固有動(dòng)脈,從而獲得自體供肝,依次阻斷上述肝臟血管后,無(wú)肝期開(kāi)始。經(jīng)PV 向肝臟灌注4℃乳酸鈉林格液,剪開(kāi)小部分IHVC 排出肝內(nèi)液體,冷灌注30 min。灌注后的肝臟逐漸變?yōu)橥咙S,且觸之冰冷。然后去掉血管夾,恢復(fù)PV、SHVC、IHVC 及肝固有動(dòng)脈血流。肝臟轉(zhuǎn)為鮮紅色,用溫生理鹽水沖洗腹腔后關(guān)閉腹腔。術(shù)后24 h 大鼠成活,即為造模成功。各組大鼠均于術(shù)前24 h 和術(shù)前1 h 經(jīng)尾靜脈注射給藥,Sham 組和SOLT 組注射10 ml/kg 的生理鹽水,Dex 各劑量組參照文獻(xiàn)〔10〕設(shè)置射低、中、高劑量,并用生理鹽水稀釋成2.5、5.0、10.0 μg/ml 的Dex 溶液,10 ml/kg經(jīng)尾靜脈注射給藥。各組大鼠均于術(shù)后24 h麻醉處死,取材進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 標(biāo)本采集 各組大鼠術(shù)后24 h 麻醉處死,取下腔靜脈血3 ml,然后取肝臟組織,部分組織立即用4%多聚甲醛固定24 h;其余組織則凍存?zhèn)溆?。下腔靜脈血在4℃條件下放置30 min,3 000 r/min離心10 min,取上清液,冷凍保存。

1.4 肝臟組織HE 染色 將1.3 中固定的肝臟組織進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋后,切成4 μm 厚的切片,按HE 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,在顯微鏡下觀(guān)察各組大鼠的肝臟組織變化。

1.5 血清肝功能指標(biāo)ALT、TBIL 及肝組織炎性因子TNF-α、IL-6 含量檢測(cè) 依據(jù)ELISA 試劑盒檢測(cè)1.3 凍存的血清樣本中的ALT、TBIL 含量;于4℃冰箱中解凍1.3 凍存的肝臟組織,勻漿后離心,取上清液,分成3 份,依據(jù)ELISA 試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6含量。

1.6 qRT-PCR 檢測(cè)肝組織VEGFR-3、VEGF-C mRNA 水平 取1.5 剩余的其中1 份組織上清液,Trizol 試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,共36 個(gè)循環(huán),引物由生工生物公司合成,引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算VEGFR-3、VEGF-C mRNA 表達(dá)水平,GAPDH 為內(nèi)參。

表1 q-RT-PCR 引物序列

1.7 Western 印跡檢測(cè)肝臟組織VEGFR-3、VEGFC、SOCS1、p-GSK3β、TLR4 蛋白表達(dá) 取1.5 的最后一份肝臟組織上清液,提取蛋白后經(jīng)BCA 試劑盒測(cè)定濃度。取50 μg 蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,加入VEGFR-3、VEGFC、SOCS1、p-GSK3β、TLR4、β-actin 抗體,除β-actin稀釋倍數(shù)為1 ∶2 000 外,其他抗體的稀釋倍數(shù)均為1 ∶1 000;4℃搖床過(guò)夜孵育,加入HRP 羊抗兔二抗(1 ∶2 000),37℃搖床孵育1 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色后,使用凝膠成像儀觀(guān)察蛋白條帶并拍照,并用Image-J 軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組肝臟組織HE 染色結(jié)果 Sham 組肝臟組織正常。SOLT 組肝臟組織出現(xiàn)肝細(xì)胞空泡樣變性,細(xì)胞核固縮、溶解、壞死,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷。與SOLT 組相比,Dex 各劑量組可見(jiàn)肝血竇輕度擴(kuò)張、肝細(xì)胞空泡樣變性、肝細(xì)胞核固縮、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷逐漸減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肝臟組織(HE 染色,×200)

2.2 各組血清肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 與Sham 組相比,SOLT 組血清ALT、TBIL 含量顯著上升(P＜0.05);Dex 低、中、高劑量組與SOLT 組相比,ALT、TBIL 含量顯著下降(P＜0.05),且各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴(lài)性(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組肝組織炎性因子檢測(cè)結(jié)果 與Sham 組相比,SOLT 組肝組織TNF-α、IL-6 含量顯著增高(P＜0.05);Dex 低、中、高劑量組與SOLT 組相比,TNF-α、IL-6 水平呈劑量依賴(lài)的方式下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 各組肝臟組織VEGFR-3、VEGF-C mRNA 水平檢測(cè)結(jié)果 與Sham 組相比,SOLT 組肝臟組織VEGFR-3 mRNA、VEGF-C mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05);與SOLT 組相比,Dex 低、中、高劑量組肝臟組織VEGFR-3 mRNA、VEGF-C mRNA均呈劑量依賴(lài)的方式增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清肝功能指標(biāo)ALT、TBIL 含量和肝組織炎性因子TNF-α、IL-6 含量及VEGFR-3、VEGF-C mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較(±s,n=10)

表2 各組血清肝功能指標(biāo)ALT、TBIL 含量和肝組織炎性因子TNF-α、IL-6 含量及VEGFR-3、VEGF-C mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較(±s,n=10)

與Sham 組比較:1)P＜0.05;與SOLT 組比較:2)P＜0.05;與Dex 低劑量組比較:3)P＜0.05;與Dex 中劑量組比較:4)P＜0.05;表3 同

組別ALT(U/L)TBIL(μmol/L)TNF-α(pg/L)IL-6(pg/L)VEGFR-3 mRNAVEGF-C mRNA Sham 組112.26±20.0210.06±1.4922.32±5.0212.06±3.491.09±0.121.06±0.10 SOLT 組9 98.91±30.441)39.28±2.041)198.91±9.441)125.96±5.041)1.31±0.141)1.35±1.011)Dex 低劑量組759.85±27.571)2)33.85±1.981)2)129.34±7.481)2)83.62±4.581)2)1.69±0.151)2)1.63±1.121)2)Dex 中劑量組597.13±26.261)2)3) 26.07±1.861)2)3) 84.89±6.851)2)3) 56.24±4.031)2)3)1.91±0.131)2)3)1.89±1.161)2)3)Dex 高劑量組303.18±23.681)2)3)4)18.28±1.681)2)3)4) 53.18±6.081)2)3)4) 31.02±3.531)2)3)4) 2.36±0.151)2)3)4) 2.28±0.181)2)3)4)

2.5 各組肝臟組織VEGFR-3、VEGF-C、SOCS1、p-GSK3β、TLR4 蛋白表達(dá)結(jié)果 與Sham 組相比,SOLT 組肝臟組織蛋白VEGFR-3、VEGF-C、SOCS1、p-GSK3β、TLR4 水平均顯著增高(P＜0.05);Dex 低、中、高劑量組與SOLT 組相比,VEGFR-3、VEGF-C、SOCS1、p-GSK3β 蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05),TLR4 水平顯著降低(P＜0.05),且呈劑量依賴(lài)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

圖2 各組肝臟組織VEGFR-3、VEGF-C、SOCS1、p-GSK3β、TLR4 蛋白表達(dá)

表3 各組肝臟組織VEGFR-3、VEGF-C、SOCS1、p-GSK3β、TLR4 蛋白表達(dá)比較(±s,n=10)

表3 各組肝臟組織VEGFR-3、VEGF-C、SOCS1、p-GSK3β、TLR4 蛋白表達(dá)比較(±s,n=10)

組別VEGFR-3/β-actinVEGF-C/β-actinSOCS1/β-actinp-GSK3β/β-actinTLR4/β-actin Sham 組0.26±0.100.21±0.110.29±0.100.26±0.120.26±0.10 SOLT 組0.45±0.121)0.43±0.121)0.41±0.111)0.46±0.131)1.46±0.121)Dex 低劑量組0.76±0.131)2)0.75±0.131)2)0.79±0.131)2)0.78±0.121)2)1.08±0.131)2)Dex 中劑量組1.06±0.141)2)3)1.02±0.121)2)3)1.09±0.121)2)3)1.03±0.131)2)3)0.73±0.121)2)3)Dex 高劑量組1.32±0.151)2)3)4)1.31±0.141)2)3)4)1.36±0.131)2)3)4)1.39±0.141)2)3)4)0.59±0.131)2)3)4)

3 討 論

肝移植為目前治療終末期肝病的唯一手段,也是國(guó)內(nèi)外器官移植領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一〔11〕。但肝移植過(guò)程中,切除受體肝臟,原位植入供肝而引起的IRI 是導(dǎo)致肝功能損傷、肝移植失敗和患者死亡的主要原因之一〔12,13〕,因此尋找降低肝移植過(guò)程中IRI 的方法,是廣大學(xué)者探究方向之一。本研究提示肝移植過(guò)程中出現(xiàn)IRI 現(xiàn)象,表明造模成功。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Dex 對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用。王清平等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)Dex 減輕自體SOLT 術(shù)大鼠IRI的機(jī)制與抑制肝臟程序性壞死有關(guān);陳貴珍等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)在肝腫瘤切除術(shù)過(guò)程中,Dex 可降低肝臟氧化應(yīng)激及炎性損傷,減輕肝臟IRI。本研究結(jié)果提示Dex 能緩解自體SOLT 術(shù)大鼠肝臟IRI 損傷,與上述文獻(xiàn)〔14〕研究結(jié)果一致,但Dex 可緩解自體SOLT術(shù)大鼠肝臟IRI 損傷的具體分子生物學(xué)機(jī)制還不甚明確,本研究對(duì)此進(jìn)行繼續(xù)探討。

VEGFR-3/VEGF-C 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)淋巴管生成和血管生成的關(guān)鍵通路之一〔16〕,VEGFR-3 與VEGF-C 結(jié)合不僅可抑制炎癥通路TLR4-核因子(NF)-κB 通路激活,增加抗炎因子的表達(dá),還可能上調(diào)SOCS1 和p-GSK3β 表達(dá),調(diào)控磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路,影響細(xì)胞增殖等一系列生物活動(dòng)進(jìn)程〔17,18〕。研究發(fā)現(xiàn),VEGFR-3/VEGF-C 信號(hào)通路也參與肝移植IRI 損傷過(guò)程,研究發(fā)現(xiàn)〔5〕外源性VEGF-C 通過(guò)上調(diào)SOCS1 和p-GSK3β 表達(dá),調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、改變庫(kù)普弗細(xì)胞(KCs)的極化作用,保護(hù)肝臟移植物免受IRI 的侵害。Zhang 等〔19〕發(fā)現(xiàn)VEGFR-3 與VEGF-C 結(jié)合后通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號(hào)通路和SOCS1 表達(dá),抑制TLR4/NF-κB 的激活,進(jìn)而抑制內(nèi)毒素休克癥的發(fā)生。Ren 等〔20〕發(fā)現(xiàn)p-GSK3β 可抑制GSK3β 活性,增加IL-10 產(chǎn)生,并改善肝臟IRI。本研究提示肝移植IRI過(guò)程中機(jī)體內(nèi)源性VEGF-C/VEGFR-3 通路激活,可能促進(jìn)SOCS1、p-GSK3β 表達(dá),抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路激活,進(jìn)而保護(hù)機(jī)體抵抗炎癥損傷,然而VEGF-C/VEGFR-3 激活對(duì)NF-κB 炎癥通路的抑制作用有限,肝移植后大鼠肝組織中TLR4 及下游炎性因子表達(dá)均增高,導(dǎo)致肝炎性損傷;Dex 可進(jìn)一步激活 VEGF-C/VEGFR-3 通路, 上調(diào) SOCS1、p-GSK3β 表達(dá),進(jìn)而抑制機(jī)體TLR4 炎癥通路激活,可能是其改善肝移植IRI 的作用機(jī)制。

綜上所述,Dex 可激活SOLT 肝組織VEGF-C/VEGFR-3 通路,減輕肝組織炎癥,改善肝移植IRI。這可能為闡明Dex 保護(hù)肝移植IRI 的機(jī)制提供一定參考,但VEGF-C/VEGFR-3 通路靶標(biāo)分子及調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,本研究未設(shè)置通路抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證,具體生物學(xué)機(jī)制仍需繼續(xù)研究。