跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合瑞舒伐他汀干預(yù)對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞活性、能量代謝及SPRED1蛋白的影響

李景輝 李婷婷 吳興森 曾丁鄰 ( 漳州正興醫(yī)院,福建 漳州 363000; 漳州市第三醫(yī)院)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠狀動(dòng)脈發(fā)生急性或持續(xù)性的缺血缺氧,從而引發(fā)的心肌壞死〔1〕。該疾病在歐美地區(qū)最為常見(jiàn),美國(guó)每年約有150 萬(wàn)人患AMI,目前中國(guó)急性心肌梗死的發(fā)病率也顯著上升,每年新增患者達(dá)20 萬(wàn)以上〔2〕。AMI 發(fā)病時(shí)患者梗死心肌呈凝固性壞死,病灶區(qū)伴充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)癥狀急性期結(jié)束后,梗死心肌將被纖維組織代替,誘發(fā)心室增大、心肌代償性肥厚,并影響心臟收縮和舒張功能,進(jìn)而影響患者的預(yù)后,而心肌收縮功能與心肌能量代謝密切相關(guān)〔3,4〕。能量代謝是心臟活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),三磷酸腺苷(ATP)是維持心臟正常生命活性的直接能量來(lái)源,改善梗死心肌的能量代謝可有助于減輕急性心肌缺血再灌注損傷〔5〕。SPRED1 蛋白是Sprouty 家族的相關(guān)蛋白,目前有研究證實(shí),SPRED1 蛋白在很多組織中均有表達(dá),可參與骨形態(tài)進(jìn)展,在造血的過(guò)程中同時(shí)SPRED1 會(huì)誘導(dǎo)氣道嗜酸細(xì)胞大量增多〔6〕。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),SPRED1 在胚胎的多個(gè)器官組織,如大腦,心臟和肺等均呈現(xiàn)低表達(dá),同時(shí)顯示出SPRED1 在胚胎發(fā)育期間占有重要地位〔7〕。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是心肌梗死后康復(fù)訓(xùn)練的重要方式之一,現(xiàn)有研究表明,適宜的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不僅可以提高心肌梗死后心臟的舒縮功能,而且可以減輕梗死后的心室重構(gòu)〔8〕。瑞舒伐他汀是一種新研究的他汀類藥物,對(duì)抗炎癥、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫力有顯著的作用,也因此受到臨床上的廣泛關(guān)注〔9〕。目前有研究證實(shí),瑞舒伐他汀對(duì)心肌梗死后心功能的作用,心肌細(xì)胞的凋亡情況和心室重塑均有明顯的改善,但對(duì)與瑞舒伐他汀對(duì)改善的作用機(jī)制尚不清楚〔10〕。本研究探討跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合瑞舒伐他汀對(duì)AMI 大鼠心肌細(xì)胞活性和能量代謝的作用機(jī)制及其對(duì)AMI 大鼠中SPRED1 蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性大鼠購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,共計(jì)50 只。體重250～300 g,常溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠7 d。

1.2 試劑和儀器 HX-100E 小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司);生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)(成都邀生電子有限公司);PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystems);DYY-6C 電泳儀(北京市六一儀器廠);BX41 顯微鏡(日本Olympus 公司);瑞舒伐他汀鈣片(阿斯利康制藥有限公司);水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)實(shí)際有限公司);ATP 酶試劑盒(南京建成公司);SPRED1 兔多克隆抗體(Santa Cruz 公司);DAB 顯色試劑盒(上海易利生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組與模型建立 把50 只大鼠分為5 組,每組10 只。假手術(shù)(sham)組;AMI 大鼠模型(AMI)組,AMI 大鼠給予跑臺(tái)訓(xùn)練進(jìn)行干預(yù)組(train組);AMI 大鼠給予瑞舒伐他汀干預(yù)組(Ros 組);AMI 大鼠模型給予跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合瑞舒伐他汀干預(yù)組(train+Ros 組)。把所有實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行麻醉處理,給大鼠氣管插管后,鏈接呼吸機(jī)和心電圖機(jī),對(duì)手術(shù)的部位進(jìn)行消毒,在第3～4 肋之間,從左到右把皮膚剪開(kāi),分離大鼠的肌肉后取出心臟,結(jié)扎大鼠的左冠狀動(dòng)脈前降支部位。當(dāng)大鼠左室前壁的心肌部分發(fā)白,收縮功能明顯變?nèi)?心電圖機(jī)上顯示ST 段有顯著升高時(shí),說(shuō)明成功造模。sham 組除了對(duì)左冠狀動(dòng)脈前降支不結(jié)扎外,其他的手術(shù)步驟和其余兩組相同。手術(shù)后各組連續(xù)注射3 d 的青霉素溶液,以防止術(shù)后有感染的情況發(fā)生。

造模成功后,sham 組、AMI 組及train 組給予等體積量蒸餾水灌胃,1 d/次;Ros 組及train+Ros 組每只大鼠給予0.5 mg 瑞舒伐他汀灌胃;train 組及train+Ros 組每天早晚各進(jìn)行1 次30 min 的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),每周運(yùn)動(dòng)5 d,跑步機(jī)的轉(zhuǎn)速為16 m/min;所有大鼠連續(xù)干預(yù)4 w。

1.4 標(biāo)本采集 分別測(cè)定每組大鼠的心功能。4 w后,開(kāi)胸后再次鉗夾左前降肢,于頸靜脈注射2%伊文思藍(lán)2～3 ml,確定未缺血區(qū)和缺血區(qū),并經(jīng)耳緣靜脈推注10%氯化鉀(KCl),使心臟停于舒張期,剪下心臟,摘取所有大鼠的心臟后,沿著左心室的長(zhǎng)軸把心臟的梗死區(qū)分為兩份,取出梗死區(qū)的組織,sham組取相同位置的組織,部分用于蘇木素-伊紅(HE)染色實(shí)驗(yàn),另一部分用液氮進(jìn)行保存,用于蛋白的檢測(cè)。

1.5 大鼠心功能指標(biāo)測(cè)定 給藥結(jié)束后麻醉所有大鼠,檢測(cè)大鼠的左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)的心功能指標(biāo),以上4 項(xiàng)指標(biāo)均測(cè)量3 次,取平均值。

1.6 TCC 法檢測(cè)心肌梗死面積 用生理鹽水洗凈心臟后,用保鮮膜包裹好置于-20℃冷凍30～60 min。取出心臟,使用刀片小心將心臟橫切5 片置于培養(yǎng)皿中,用1%TTC 溶液30℃避光染色10～15 min,取出心臟,小心將心臟翻面,繼續(xù)37℃避光染色10～15 min。用相機(jī)拍照后并計(jì)算梗死區(qū)域的面積。

1.7 心肌組織病理學(xué)形態(tài)觀察 制備心肌組織切片,每個(gè)樣本取不連續(xù)3 張切片,常規(guī)脫蠟至水,蘇木精液染色、75%鹽酸乙醇分化、氨水處理、酸化伊紅乙醇染色處理后水洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固,光鏡下觀察。

1.8 TUNEL 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 取出大鼠的心肌組織,分別切成0.5 cm 的塊狀,固定后石蠟包埋、把組織進(jìn)行切片。用TUNEL 法把石蠟切片進(jìn)行染色,所有的步驟按照試劑盒上的說(shuō)明嚴(yán)格進(jìn)行。每張石蠟切片選取5 個(gè)不交叉的視野進(jìn)行觀察,凋亡的心肌細(xì)胞為深棕色。細(xì)胞凋亡率=細(xì)胞凋亡的數(shù)量/細(xì)胞的總數(shù)×100%。

1.9 心肌ATP 酶活力檢測(cè) 每組取部分心臟,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗血跡,用組織勻漿機(jī)制備勻漿,離心機(jī)3 500 r/min,離心10 min 后取上清液,蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法定量,定磷法于660 nm 下檢測(cè)A 值,并計(jì)算ATP 酶活力(以每小時(shí)每克心肌組織蛋白產(chǎn)生mmol Pi 單位酶表示),實(shí)驗(yàn)步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。

1.10 Western 印跡檢測(cè)SPRED1 蛋白表達(dá) 將各組的心肌組織分別提取100 mg,組織裂解并提取核蛋白,分裝后,-20℃保存。將蛋白溶液與緩沖溶液按照4 ∶1比例進(jìn)行混均,然后將其煮沸,使其變性。在電泳板內(nèi)分別注入50 μm 的蛋白樣品,把電泳后的樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入脫脂奶粉,并進(jìn)行封閉,時(shí)常為1 h。加入1 抗后進(jìn)行TTBS 漂洗,每次漂洗10 min,一共進(jìn)行3 次漂洗,最后加入2 抗對(duì)溶液進(jìn)行稀釋,再在常溫的環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF 膜,TTBS 漂洗10 min×3,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后數(shù)碼相機(jī)照相。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組心功能指標(biāo)比較 與sham 組比較,AMI組LVEDD 和LVESD 均顯著升高,LVEF 和LVFS 顯著降低(P＜0.05);干預(yù)后train 組、Ros 組和train+Ros 組LVEDD 和LVESD 均低于AMI 組,而LVEF和LVFS 明顯高于AMI 組,并且3 組效果呈遞增排列,train+Ros 組心功能水平優(yōu)于train 組、Ros 組(P＜0.05),見(jiàn)表1。

2.2 各組心肌梗死面積比較 sham 組心肌組織無(wú)梗死情況。AMI 組、Train 組、Ros 組和Train 組+Ros組均出現(xiàn)了梗死的組織,并且心肌梗死面積呈遞減排列,AMI 組心肌梗死面積最大,train+Ros 組心肌梗死面積明顯低于train 組和Ros 組(P＜0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組心功能、心肌梗死面積比較(±s,n=10)

表1 各組心功能、心肌梗死面積比較(±s,n=10)

與sham 組比較:1)P＜0.05;與AMI 組比較:2)P＜0.05;與train 組比較:3)P＜0.05;與Ros 組比較:4)P＜0.05;下表同

組別LVEDD(mm)LVESD(mm)LVEF(%)LVFS(%)心肌梗死面積(%).00±0.00 AMI 組6.26±0.511)10.41±0.481)52.05±2.831)27.73±1.051)52.68±7.811)train 組5.31±0.481)2)8.72±0.431)2)58.17±2.561)2)31.54±1.111)2)38.31±5.121)2)Ros 組4.89±0.451)2)3)7.95±0.511)2)3)61.37±2.031)2)3)33.49±0.981)2)3)29.67±5.181)2)3)train+Ros 組4.21±0.321)2)3)4)6.77±0.641)2)3)4)69.62±1.961)2)3)4)38.21±0.721)2)3)4)23.51±6.711)2)3)4)F/P 值51.41/＜0.001133.20/＜0.001224.90/＜0.0014 sham 組3.92±0.215.57±0.6378.16±0.7643.62±0.430 74.20/＜0.001119.40/＜0.0001

2.3 各組心肌組織病理學(xué)形態(tài)比較 sham 組心肌細(xì)胞均整齊排列,心肌細(xì)胞的邊界也很清晰,細(xì)胞核及橫紋清楚可見(jiàn)。與sham 組比較,AMI 組、train組、Ros 組和train+Ros 組心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷,并且在細(xì)胞的梗死區(qū)均出現(xiàn)了炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),細(xì)胞的損傷程度從重到輕分別為AMI 組、train 組、Ros 組、train+Ros 組,并且train+Ros 組心肌細(xì)胞排列也趨于整齊,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,在梗死區(qū)周邊可見(jiàn)血管組織,明顯優(yōu)于AMI 組、train 組、Ros 組,見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織(HE 染色,×400)

2.4 各組心肌細(xì)胞凋亡TUNEL 檢測(cè)結(jié)果比較 和sham 組〔(5.12±0.46)%〕相比,AMI 組心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加〔(39.87±1.63)%,P＜0.05〕;和AMI組相比,train 組〔(34.18±1.21)%〕、Ros 組心肌細(xì)胞凋亡率〔(39.27 ± 1.35)%〕 和train + Ros 組〔(18.36±0.87)%〕均明顯降低(P＜0.05),且train+Ros 組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于train 組、Ros 組(P＜0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 各組心肌細(xì)胞凋亡(TUNEL 染色,×400)

2.5 各組心肌ATP 酶活力比較 和sham 組比較,AMI 組ATP 酶活力顯著降低(P＜0.05);干預(yù)后的train 組、Ros 組和train+Ros 組ATP 酶活力顯著高于AMI 組(P＜0.05),且train+Ros 組ATP 酶活力高于train 組和Ros 組(P＜0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組心肌ATP 酶活力比較(±s,n=10)

表2 各組心肌ATP 酶活力比較(±s,n=10)

組別Na+-K+-ATP 酶(mmol Pi/g Pro)Ca2+-Mg2+-ATP 酶(mmol Pi/g Pro)5.68±0.796.73±1.05 AMI 組4.22±0.801)5.40±0.761)train 組4.79±0.921)2)5.98±1.131)2)Ros 組4.85±0.441)2)3)6.19±0.901)2)3)train+Ros 組5.21±0.291)2)3)4)6.56±0.651)2)3)4)F/P 值sham 組6.119/0.000 53.267/0.019 6

2.6 各組SPRED1 蛋白表達(dá)比較 AMI 組SPERD1 蛋白表達(dá)(2.23±0.15)顯著高于sham 組(1.00±0.02,P＜0.05);與AMI 組比較,train 組、Ros 組和train+Ros 組SPERD1 蛋白表達(dá)均顯著降低(1.45 ± 0.11、1.03 ± 0.09、0.68 ± 0.06,P＜0.05),且蛋白表達(dá)呈逐漸遞減趨勢(shì),train+Ros 組心肌組織中SPERD1 蛋白低于train 組和Ros 組(P＜0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 各組SPRED1 蛋白表達(dá)

3 討 論

研究表明,藥物預(yù)處理和運(yùn)動(dòng)對(duì)受損的心肌組織均具有保護(hù)作用,可有效地降低心律失常發(fā)生率、改善心臟的收縮功能、增強(qiáng)心臟對(duì)損傷的耐受能力等〔11〕。前期有研究顯示,瑞舒伐他汀在急性冠狀動(dòng)脈綜合征中發(fā)揮抗氧化作用,有效降低氧化應(yīng)激水平及心肌損傷標(biāo)志物的水平〔12〕。研究指出,運(yùn)動(dòng)能夠增加機(jī)體氧容量,阻止一些代謝疾病的發(fā)生;運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練還能通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮通路,影響血管舒張,從而阻礙心臟疾病中內(nèi)皮細(xì)胞的死亡,適當(dāng)強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練還可減少心血管疾病的發(fā)生〔13〕。

瑞舒伐他汀對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成過(guò)程中限速酶的活性具有一定的抑制作用,即可抑制膽固醇的合成,膽固醇合成量降低將導(dǎo)致細(xì)胞表面低密度脂蛋白(LDL)受體上調(diào),血漿LDL 代謝加快〔14〕。瑞舒伐他汀還可抑制極低密度蛋白的生成,在高膽固醇血癥治療工作中具有極高療效。臨床研究發(fā)現(xiàn),對(duì)急性冠脈綜合征患者進(jìn)行大劑量瑞舒伐他汀治療后,患者心肌梗死、心絞痛、死亡等發(fā)生率下降20%左右,腦卒中發(fā)生率也顯著下降。本研究結(jié)果提示,跑臺(tái)訓(xùn)練和瑞舒伐他汀的聯(lián)合使用可明顯改善AMI大鼠的心功能,對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡也能進(jìn)行有效的抑制,但跑臺(tái)訓(xùn)練和瑞舒伐他汀聯(lián)合干預(yù)的效果最好。李丹等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),心肌梗死急性期即進(jìn)行中等強(qiáng)度的跑臺(tái)訓(xùn)練可提高大鼠的存活率,還能有效減小缺血心肌的梗死面積,改善左心室重構(gòu)。吳春濤等〔16〕對(duì)AMI 大鼠研究發(fā)現(xiàn),瑞舒伐他汀可改善AMI 大鼠心臟功能,可能通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2/9/10、Perionstin 蛋白及TGF-β1 的mRNA表達(dá)來(lái)調(diào)控其心肌重構(gòu)。

能量代謝是心臟活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),ATP 是維持心臟正常生命活動(dòng)的直接能量來(lái)源,有研究表明,心肌ATP 的水平與其收縮能量呈正相關(guān),而能量代謝的恢復(fù)能夠減輕細(xì)胞損傷也被證實(shí)〔17,18〕。本研究結(jié)果顯示,AMI 組大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生損傷,進(jìn)而導(dǎo)致ATP 生成不足,導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝障礙,跑臺(tái)訓(xùn)練和瑞舒伐他汀均可促進(jìn)ATP 大量生成,但跑臺(tái)訓(xùn)練和瑞舒伐他汀聯(lián)合使用的效果最佳,可見(jiàn)跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合瑞舒伐他汀干預(yù)可顯著增加ATP 的生成,恢復(fù)受損心肌細(xì)胞的能量代謝功能。劉媛媛等〔19〕通過(guò)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行8 w 的跑臺(tái)訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn),適度的運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌能量的代謝可進(jìn)行一定程度的優(yōu)化,并且使心肌代謝轉(zhuǎn)化糖酵解和葡萄糖,但對(duì)脂肪酸的利用無(wú)顯著的變化。本研究結(jié)果提示,跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合瑞舒伐他汀可對(duì)心肌組織血管新生負(fù)性調(diào)控因子SPRED1 進(jìn)行有效的調(diào)節(jié),進(jìn)而調(diào)節(jié)血管的新生。鄭瑞玲等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),活血益氣方可促進(jìn)AMI 大鼠梗死邊緣區(qū)血管的新生,治療效果較為顯著,其作用機(jī)制通過(guò)下調(diào)SPRED1 的表達(dá)發(fā)揮作用,這與本文研究結(jié)果相似。

綜上,跑臺(tái)訓(xùn)練聯(lián)合瑞舒伐他汀可有效減少急性心肌梗死細(xì)胞的凋亡,改善心肌能量代謝,同時(shí)對(duì)SPRED1 的表達(dá)有一定的抑制作用。