煙酸對高膽固醇血癥大鼠NO/cGMP/cGK通路及血管內(nèi)皮功能障礙的影響

王麗 王瑩 黃一聆 梁明慧 宋沛然 康文藝( 商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)院,河南 商丘 476000;河南大學(xué) 附屬南石醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)科; 藥學(xué)院天然藥物研究所)

高膽固醇血癥是引起冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓等疾病的危險(xiǎn)因素〔1〕,各種損傷刺激和心血管危險(xiǎn)因素作用血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷、功能紊亂,造成血管內(nèi)皮功能障礙〔2〕。因此,治療高膽固醇血癥從緩解血管內(nèi)皮功能障礙開始。煙酸作為B 族維生素,具有調(diào)節(jié)血脂功效,可降低總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,且對血管內(nèi)皮功能有一定影響〔3〕,但具體機(jī)制尚不清楚。血管的舒張和收縮又主要靠內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性物質(zhì)實(shí)現(xiàn),最主要的活性物質(zhì)是內(nèi)皮衍生性舒張因子,即一氧化氮(NO),血管內(nèi)皮受損會導(dǎo)致NO 合成分泌減少從而影響內(nèi)皮功能〔4〕,NO/環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)/cGMP 依賴性蛋白激酶(cGK)通路又是調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能的重要通路,損傷NO/cGMP/cGK 通路即損傷內(nèi)皮功能,造成血管內(nèi)皮功能障礙〔5〕。煙酸是否通過NO/cGMP/cGK 通路影響血管內(nèi)皮功能障礙尚不明確。本文建立高膽固醇血癥大鼠模型,煙酸治療后添加NO 合酶(NOS)抑制劑觀察其對NO/cGMP/cGK 通路的影響,為煙酸的治療機(jī)制提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康SD 大鼠,SPF 級、體重(210±10)g,均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司〔許可證號:SCXK(京)-2018-0103〕。在河南大學(xué)附屬南石醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心溫度(24±1)℃、濕度(55±5)%、光照、黑暗各12 h,通風(fēng)良好的環(huán)境中自由飲水?dāng)z食,暫養(yǎng)1 w 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究均經(jīng)河南大學(xué)附屬南石醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

1.2 試劑 煙酸(北京市永康藥業(yè)有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H11020595);L-NMMA(總NOS 抑制劑)、NOS 試劑盒(碧云天科技有限公司,貨號:S0011、S0025);TC、TG 酶法測定試劑盒(廣州東林生物科技有限公司, 批號分別為: 粵械注準(zhǔn)20181300160、粵械注準(zhǔn)20172400942);高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、LDL-C 試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,批號分別為:2018-66-8、2019-05-6);NO 測定試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司,批號:20190361);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海生工生物技術(shù)公司,貨號:E607318);一抗兔抗鼠磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(p-VASP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH),二抗羊抗兔(英國abcam 公司,貨號分別為:ab109541、ab181602、ab6721)。

1.3 動物分組及給藥處理 基礎(chǔ)飼料配方:魚肝油、骨粉、鹽、酵母粉各1%,豆粉10%、麥麩15%、面粉35%、玉米面36%。高脂飼料配方:膽酸鈉0.5%、豬油5%、蛋黃粉10%、基礎(chǔ)飼料85%。大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、煙酸組、煙酸+NOS 抑制劑組,每組8 只。除對照組采用基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)外,其余各組高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)4 w,建立高膽固醇血癥大鼠模型〔6〕,煙酸組根據(jù)人與動物等效計(jì)量換算法〔7〕灌胃150 mg/kg 煙酸〔8〕,煙酸+NOS 抑制劑組灌胃150 mg/kg 煙酸+0.5 g/kg L-NMMA〔9〕,煙酸和L-NMMA 均溶解至飲用水中灌胃,對照組和模型組灌胃等體積飲用水,1 次/d,連續(xù)4 w。

1.4 樣品采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠禁食12 h,靜脈取血,取各組腹主動脈樣本部分置于4%多聚甲醛中固定,部分置于-80℃冰箱保存待用。

1.5 體重水平檢測 實(shí)驗(yàn)前、高脂飼料處理4 w后、藥物處理4 w 后稱量各組大鼠體重。

1.6 血脂水平檢測 靜脈血室溫放置2 h,3 000 r/min離心10 min,取上清為血清置于新的離心管中,氧化酶法測定TC、TG 水平,免疫比濁法測定HDL-C、LDL-C 水平。

1.7 血管內(nèi)皮功能檢測 硝酸還原酶法檢測血清中NO 水平,酶促反應(yīng)法檢測血清中NOS 水平。

1.8 HE 染色觀察大鼠腹主動脈形態(tài)學(xué)變化 腹主動脈經(jīng)4%多聚甲醛中固定后制備常規(guī)石蠟切片,切片脫蠟后HE 復(fù)染,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察腹主動脈形態(tài)學(xué)情況。

1.9 Western 印跡檢測大鼠腹主動脈組織中磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(p-VASP)水平 -80℃冰箱中取部分腹主動脈組織,加入蛋白裂解液冰上研磨,4℃13 400 r/min 離心20 min,上清即為總蛋白。凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉;加入一抗p-VASP、GAPDH,4℃孵育過夜;加入對應(yīng)二抗,室溫孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad8.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 煙酸對大鼠體重水平的影響 實(shí)驗(yàn)前,各組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。高脂飼料處理4 w后,與對照組相比,模型組、煙酸組、煙酸+NOS 抑制劑組體重顯著升高(P＜0.05)。藥物處理4 w 后,與對照組相比,模型組體重顯著升高(P＜0.05);與模型組相比,煙酸組體重顯著降低(P＜0.05);與煙酸組相比,煙酸+NOS 抑制劑組體重顯著升高(P＜0.05)。與對照組相比,模型組血清中NO、NOS 水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,煙酸組血清中NO、NOS 水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與煙酸組相比,煙酸+NOS 抑制劑組血清中NO、NOS 水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 4 組實(shí)驗(yàn)前、干預(yù)4 w 后體重及血清中NO、NOS 水平比較(±s,n=8)

表1 4 組實(shí)驗(yàn)前、干預(yù)4 w 后體重及血清中NO、NOS 水平比較(±s,n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與煙酸組比較:3)P＜0.05;表2 同

組別實(shí)驗(yàn)前體重(g)高脂飼料處理4 w 后體重(g) 藥物處理4 w 后體重(g)NO(μmol/L)NOS(U/ml)2±3.1582.36±5.18模型組208.59±6.87434.15±12.151)468.18±15.191)19.92±2.321)63.45±6.081)煙酸組211.31±7.45433.19±13.491)405.48±13.422)36.56±4.682)78.18±3.152)煙酸+NOS 抑制劑組209.96±5.18434.69±13.191)427.27±16.993)21.33±3.423)52.48±4.583)F/P 值0.254/0.858128.235/0.00046.185/0.00038.對照組209.78±5.16316.15±15.69389.16±10.5529.1 798/0.00063.801/0.000

2.2 煙酸對大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 及腹主動脈組織p-VASP 水平的影響 與對照組相比,模型組血清中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高,HDL-C 及腹主動脈組織p-VASP 水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,煙酸組血清中TC、TG、LDL-C水平降低,HDL-C 及腹主動脈組織p-VASP 水平顯著升高(P＜0.05);與煙酸組相比,煙酸+NOS 抑制劑組血清中TC、TG、LDL-C 水平顯著升高,HDL-C及腹主動脈組織p-VASP 水平顯著降低(P＜0.05)。見表2、圖1。

表2 4 組血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平及腹主動脈組織p-VASP 水平比較(±s,n=8,mmol/L)

表2 4 組血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平及腹主動脈組織p-VASP 水平比較(±s,n=8,mmol/L)

組別TCTGHDL-CLDL-Cp-VASP對照組1.39±0.190.44±0.050.42±0.030.24±0.040.86±0.06模型組1.81±0.161)0.76±0.111)0.31±0.041)0.36±0.041)0.13±0.021)煙酸組1.28±0.182)0.51±0.042)0.43±0.042)0.25±0.032)0.57±0.042)煙酸+NOS 抑制劑組1.63±0.153)0.69±0.063)0.35±0.033)0.34±0.043)0.29±0.043)F/P 值15.595/0.00036.310/0.00021.067/0.00021.099/0.000459.074/0.000

圖1 4 組腹主動脈組織中p-VASP 蛋白水平

2.3 煙酸對大鼠腹主動脈組織形態(tài)學(xué)的影響 對照組腹主動脈內(nèi)膜光滑、平整,內(nèi)皮細(xì)胞扁平狀且排列規(guī)則,細(xì)胞核排列均勻;模型組腹主動脈內(nèi)膜凹凸不平,細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞核出現(xiàn)明顯散落,部分細(xì)胞出現(xiàn)大面積與基底膜脫離現(xiàn)象;煙酸組細(xì)胞核排列整齊,細(xì)胞核散落現(xiàn)象不明顯;煙酸+NOS 抑制劑組相較于煙酸組,細(xì)胞核散落明顯。見圖2。

圖2 4 組腹主動脈形態(tài)學(xué)變化(HE 染色,×200)

3 討 論

高膽固醇血癥促進(jìn)血管內(nèi)皮功能障礙,促進(jìn)動脈粥樣硬化,加重血管類疾病發(fā)生〔10〕。本研究提示,高膽固醇血癥中持久的高脂飼料造成動物血脂異常,造成肥胖,肥胖會促進(jìn)血管內(nèi)皮功能下降,造成腹主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞核散落,細(xì)胞出現(xiàn)大面積與基底膜脫離嚴(yán)重,誘發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙〔11〕。目前一旦發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥應(yīng)控制飲食,增加身體活動;在治療上以他汀藥物為首選,使用劑量由低劑量到高劑量,若不能滿足要求,則采用聯(lián)合用藥方式治療〔12〕。煙酸作為聯(lián)合使用藥物,在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為煙酰胺,添加煙酸可降低輔酶A 水平,從而抑制環(huán)磷酸腺苷的形成和脂肪的分解,降低血液中游離的脂肪酸和甘油含量,降低血清中TC、TG 濃度;同時(shí)可以抑制LDL-C 的合成從而降低膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)過程且能保持HDL-C 結(jié)構(gòu)和功能〔13〕。本研究提示,煙酸可通過抑制環(huán)磷酸腺苷的形成和脂肪的分解,從而降低血液中游離脂肪酸和甘油含量,在降低TC、TG、LDL-C 的同時(shí)維持HDL-C 水平,緩解血脂水平,從而緩解肥胖,達(dá)到治療疾病目的。

NO 作為體內(nèi)信號分子,前體是L-精氨酸,NO生成后激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶,在鳥苷酸環(huán)化酶作用下,三磷酸鳥苷生成大量cGMP,從而激活cGK,促使肌球蛋白輕鏈去磷酸化,并降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平,從而導(dǎo)致收縮蛋白和鈣離子結(jié)合減少,導(dǎo)致平滑肌松弛,血管擴(kuò)張〔14,15〕。在高膽固醇血癥中NO 水平降低導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙〔16〕。NO 是由3 種NOS〔內(nèi)皮(e)NOS、神經(jīng)型(n)NOS、誘生型(i)NOS〕催化L-精氨酸生成,L-NMMA 作為NOS 總抑制劑,可競爭性抑制NOS 結(jié)合位點(diǎn),從而降低NOS 水平,導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙〔17〕。p-VASP 是肌動蛋白相關(guān)的多功能蛋白,能直接或間接與單體或肌動蛋白絲結(jié)合,從而促進(jìn)肌動蛋白絲的成核、成束和延長,作為血管內(nèi)皮損傷中NO/cGMP/cGK 通路的重要標(biāo)志,血管內(nèi)皮損傷中血管微觀穩(wěn)定受到破壞,p-VASP 影響血管穩(wěn)定〔18,19〕。NOS 激活通過上調(diào)p-VASP 可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)過程〔20〕。本研究提示,高膽固醇血癥中NOS水平降低可以減少L-精氨酸的生成,從而降低NO的合成,降低cGMP、cGK 水平,降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平,從而導(dǎo)致收縮蛋白和鈣離子結(jié)合減少,導(dǎo)致平滑肌松弛,血管擴(kuò)張,體現(xiàn)在蛋白表達(dá)水平上表現(xiàn)為p-VASP 水平降低,血管穩(wěn)定性受到影響,血管微觀受到破壞,造成血管內(nèi)皮功能障礙。煙酸可緩解高膽固醇血癥大鼠上述癥狀,促進(jìn)NO、NOS 水平,從而維持血管內(nèi)皮穩(wěn)定。煙酸+NOS 抑制劑可逆轉(zhuǎn)煙酸緩解的大鼠癥狀,降低NOS 水平,從而降低p-VASP 蛋白表達(dá),影響血管穩(wěn)定,造成血管內(nèi)皮功能障礙。NOS 抑制劑可逆轉(zhuǎn)煙酸對NO/cGMP/cGK 通路的激活作用,證明煙酸通過激活NO/cGMP/cGK 通路發(fā)揮作用。

綜上所述,煙酸可激活NO/cGMP/cGK 通路實(shí)現(xiàn)對高膽固醇血癥血管內(nèi)皮功能障礙的緩解作用,從而實(shí)現(xiàn)對疾病的治療。本文首次驗(yàn)證煙酸治療高膽固醇血癥的信號通路是NO/cGMP/cGK 通路,但煙酸作為輔助治療藥物,對疾病的耐藥性的影響是否影響藥效需進(jìn)一步驗(yàn)證。