兩種精子優(yōu)化處理方法對體外受精-胚胎移植結局的影響

王惠潔 余秋鋒 高松城 黃智勇 葉秀云

（1 韶關市婦幼保健院，廣東 韶關 512000；2 翁源縣婦幼保健院，廣東 翁源 512600）

體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）即俗稱的“試管嬰兒”，是現(xiàn)階段對于不孕不育治療的一個重要方式，對于不孕不育患者來講是個福音。精液優(yōu)化處理是該項技術中的一個重要環(huán)節(jié)，其目的是將精液中的精漿分離出，將其他有害物質、死精子、畸形精子、細胞碎片去除，進而將一定數(shù)量成熟，同時存在受精潛能的前線運動精子優(yōu)選出來[1]。現(xiàn)階段，臨床以密度梯度離心法、上游法等為常用的兩種優(yōu)選方式。本中心在2019年前，IVF-ET周期中用于精液優(yōu)化處理的方法大多為梯度離心合并上游法。自2019年始，我中心才大規(guī)模的增加單純上游法用于精液處理方法。于是將我中心2019—2021年標準人群IVF-ET第一周期人群，不同精液處理方法胚胎結局的進行如下比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年12月我院輔助生殖治療IVF標準患者結局進行研究。本研究不違反國家法律法規(guī)，符合醫(yī)學倫理原則。促排方案選擇：長效長方案，減少促排卵方案對結局的影響。納入標準：IVF-ET第一周期；女方年齡＜35歲；確定移植日內膜≥7 mm，獲卵數(shù)為5～15個。排除標準：男方處理后精子濃度＜3.0×106/L；子宮肌瘤肌瘤、畸形等形態(tài)異常；女方存在全身性疾病。妊娠判斷標準：胚胎移植后28～35 d超聲提示宮內探及孕囊回聲為臨床妊娠。本研究課題時間較長，納入周期可統(tǒng)持續(xù)妊娠率，活產(chǎn)率還未完全出齊。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 男方禁欲2～7 d后經(jīng)手淫法收集精液，根據(jù)WHO人類精子檢測手冊（第5版）記錄精子體積、性狀、pH值、濃度、活力等；女性患者則實施促排卵方案，在體內的卵泡發(fā)育成熟后對其進行人絨毛促性腺激素注射，劑量為10 000 U或5 000 U，35～36 h 后，通過陰道超聲的引導下實施卵泡穿刺取卵。

1.3.2 精液處理方法 ①上游法：將收集液化完全精液緩慢注入含有3.0 mL Plus-IVF液體的10 mL規(guī)格試管底部，45 ℃靜置15～20 min，之后緩慢吸取最上層液體0.4 mL于5 mL小試管，放入培養(yǎng)箱待用。②密度梯度合并上游法：將收集液化完全精液緩慢滴入盛有由PremGad配成1.5 mL 40%、1.5 mL 80%梯度液離心管的上方，離心300 g，15 min。將離心后沉淀加入盛有1.5 mL Plus-IVF液體5 mL小試管中混勻。離心 300 g，3 min，棄上清。沿管壁緩慢滴入1.0 mL plus-IVF放入37 ℃培養(yǎng)箱上游15 min，之后吸取最上層液體0.4 mL液體至小試管中。

1.3.3 體外受精、陪同培養(yǎng)和移植 在取卵后4 h左右，在存在卵子的培養(yǎng)皿中加入經(jīng)過優(yōu)化處理過的精子，對精子濃度合理調整，在35.5 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進行為期16～20 h的培養(yǎng)后，顆粒進行機械法脫掉，對受精情況進行觀察，第3日對卵裂情況進行觀察，同時進行準確記錄，對胚胎進行評分后進行胚胎冷凍或胚胎移植。

1.3 觀察指標

1.3.1 胚胎結局 對比兩組患者正常受精率、優(yōu)胚率、多PN率、可用胚胎囊胚形成率、正常卵裂率、可用囊胚形成率、妊娠率、著床率、流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率。

1.3.2 胚胎的評分標準 按照細胞數(shù)、細胞大小是否均勻、多少碎片等情況評價卵裂期胚胎質量。見表1。

表1 胚胎的評分標準

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同分組周期一般情況比較 回顧分析2019年 1月至2021年12月符合試驗條件：男方處理后精子濃度≥3.0×106/L 35歲以內、獲卵5～15個、內膜≥ 7 mm、IVF-ET第一周期的助孕移植的女性患者，不同精液處理前一般情況：上游法、梯度離心合并上游法分組的患者中年齡、血清抗苗勒管激素、Gn時間、Gn總數(shù)、子宮內膜厚度、獲卵數(shù)均無差別（P＞0.05）。見表2。

表2 不同精液處理方法一般資料比較（）

表2 不同精液處理方法一般資料比較（）

注：各組方差均齊，使用方差分析，P＞0.05，兩組樣本來自同一標準人群。

2.2 兩組精液處理法胚胎結局比較 經(jīng)一般資料比較發(fā)現(xiàn)，上游法和梯度離心合并上游法具有樣本選擇的隨機性、同質性。接下來進行正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚胎囊胚形成率、可用囊胚形成率、著床率、妊娠率、流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率的比較。兩種精液處理方法在優(yōu)胚率方面差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上游法優(yōu)胚率45.85%大于梯度離心法40.42%。兩種精液處理方法在正常受精率、多PN率、正常卵裂率、可用胚胎囊胚形成率、可用囊胚形成率、著床率、妊娠率、流產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但上游法可用囊胚形成率高于梯度離心法4.01%、上游法著床率高于梯度離心法3.02%、上游法妊娠率高于梯度離心法4.04%、上游法持續(xù)妊娠率高于梯度離心法4.71%，而流產(chǎn)率上游法比梯度離心法低1.64%?？赡苡捎跇颖玖可?，沒有統(tǒng)計學意義，并不代表沒有實際差別。見表3。

表3 兩種精液處理對胚胎結局比較

3 討論

人工方法在輔助生殖技術中將染色質完整性好、核成熟度、形態(tài)正常、活力好的精子是IVF-ET取得成功的關鍵因素。處理精液的目的是將精漿中的碎片、畸形精子、抗精子抗體、細菌、免疫活性細胞、死亡精子、前列腺素等其他有害物質。這可能對精子的活力或其受精能力產(chǎn)生影響或抑制，引起子宮痙攣，還可能對卵細胞產(chǎn)生損傷，對于早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生組織作用。將精漿除去的目的是因為精漿可能將艾滋病等傳染性疾病風險去除；將精液的黏稠性減少；達到合乎要求的活動精子密度；對精子獲能促進，對精子受精能力改善。但因為精漿存在對精子功能保護的主要抗氧化物質，將精漿去除的同時也會導致精子的氧化應激損傷，使DNA斷裂的概率增加。有學者指出，精液處理技術應用期間的反復離心會使活性氧類物質顯著增加，引起精子出現(xiàn)氧化應激性DNA損傷，利用該類精子實施ART治療，會降低妊娠率、受精率，同時易引起反復的自然流暢[2]。理想的精子分離技術需要包括如下幾點：①操作簡單、費用低、快速。②獲得多量活動精子。③不損傷精子或分離后的精子并沒有出現(xiàn)生理性改變。④盡量將其他細胞和死精子去除，包括細菌、白細胞。⑤去除ROS或其他活性物質或有毒的物質。⑥可以對多體積的精液處理。但是現(xiàn)有的技術對于全部的要求常常不能滿足，現(xiàn)階段臨床以密度梯度離心法、上游法為臨床常用方法。上游法的原理：活動精子能經(jīng)過液界面而到不同的培養(yǎng)液中，可以使精子與無用物質自行分離而重新分布，無用物質包括其他有害成分、凝集精子、雜質、畸形精子、活力差的精子、白細胞、死精子、雜質。但是該種方法獲得了高質量的精子，但是存在較低的精子回收率。有學者指出，上游法優(yōu)選出的精子存在很好的運動參數(shù)，活率也較高，但是對于完整精子頂體的比例并不能提升[3]。而上游法可得到很多的存在完整頂體區(qū)域的橢圓形精子[4]。上游法也可以不成熟以及染色體異常的精子，同時也有學者指出，用精子染色質結構分析法的過程中檢測了Percoll梯度離心法和上游法對精子優(yōu)選，都獲得了正常形態(tài)、活動良好的精子，但是后者可以將精子DNA完整性提升，但是前者卻不能[5]。同Ixa Prep梯度離心法、Pure Sperm相比，上游法可以將一氧化氮產(chǎn)量有效降低，前者可以將精子的運動特性，繼而將其作為精子毒物，是因為鳥苷酸環(huán)化酶的激活使cGMP的產(chǎn)生增加，且該物質會對精子的運動性產(chǎn)生抑制作用。密度梯度離心法的原理：采取密度梯度不同液體放在試管中，保證其無毒、無菌，試管底部為密度最大者，依次向上遞減，表面密度最小，則構成了不連續(xù)的密度梯度，在密度最底層的上方放置液化后的精液，離心后，所需要的活動力強的精子在試管最底部[6]。同上游法對比，密度梯度離心法對于更多形態(tài)正常的精子可以得到，會顯著增加精子的活力、體外生存能力，特別是那些畸形精子癥狀、弱精癥、少精癥等存在更高的因回收率，此法更加合適。Percoll梯度離心法在優(yōu)選精子中的歷史已經(jīng)超過20年，該種方式不但簡便，同時存在較高的活動精子回收率。但是Percoll液中存在PVP可導致女性生殖道內膜乃至腹膜出現(xiàn)炎性反應，美國自1996年起，該種方式只在試驗室中應用，對于臨床中禁用，之后便將不含PVP的替代液Pure Sperm等開發(fā)出來[7]。Pure Sperm離心法同Percoll離心法存在的優(yōu)選精子的效果相近，同時對于精子來勁并沒有毒性作用[8]。有研究報道，密度梯度離心法可以將染色體濃縮差、DNA斷裂的精子分離出來[9]。有學者認為，密度梯度離心法對異常精子處理后，獲得的精子的低滲腫脹試驗陽性率、頂體反應率同成熟的精子比例同上游法相比更佳[10]。

上述很多的研究結果都不同，可能同進行優(yōu)選處理的精子樣本質量存在聯(lián)系。而本中心摸索出的上游法+密度梯度離心法是以傳統(tǒng)的密度梯度離心法為基礎采取了不含離心操作的上游過程，在理論上，將兩種精子處理方法的優(yōu)點結合在一起；精子存在加工的回收率，同時可以二次對回收的精子篩選，同時對于損傷精子DNA的程度并不增加，進而確保了用于受精的精子的質量。本文分析我中心2019—2021年IVFET周期標準患者472例，比較不同精液處理方法對標準人群胚胎結局的差別。通過上游法與梯度離心合并上游法胚胎結局的比較發(fā)現(xiàn)，上游法在優(yōu)胚率方面有統(tǒng)計學優(yōu)勢，在可用囊胚形成率、著床率、妊娠率、持續(xù)妊娠率均有數(shù)據(jù)優(yōu)勢；在流產(chǎn)率方面數(shù)據(jù)也是最低。分析原因可能是梯度離心合并上游法可以篩選核成熟的精子，但是經(jīng)過離心又增加了氧化應激，造成DNA斷裂損傷，染色質交聯(lián)異常，影響精子受精后胚胎結局；也可能是樣本量不夠大，沒有得出統(tǒng)計差別，今后研究繼續(xù)增加樣本量，繼而獲得更加準確的研究結果。

總而言之，對于精子的處理方法可以結合臨床的具體情況進行優(yōu)化處理，進而獲得更加優(yōu)質的精子，提升妊娠率，改善妊娠結局。