黃土丘陵區(qū)垂直陡壁表面不同類型生物土壤結(jié)皮養(yǎng)分與微生物養(yǎng)分限制特征

張尚鵬, 王百群, 王香香, 黃倩雪, 喻佳洛, 徐明哲

(1.中國(guó)科學(xué)院 水利部 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 楊凌 712100; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院,陜西 楊凌 712100; 4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院, 陜西 楊凌 712100)

在植被恢復(fù)的過(guò)程中，生物土壤結(jié)皮成為干旱和半干旱地區(qū)最具特色的微自然景觀[1-2]，也是干旱荒漠區(qū)、極地地區(qū)等生態(tài)脆弱區(qū)植被演替的重要基礎(chǔ)[3]。生物土壤結(jié)皮在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分、穩(wěn)定表層土壤、為土壤生物提供棲息地等方面起著至關(guān)重要的作用[4-6]。生物土壤結(jié)皮按照藻結(jié)皮—地衣結(jié)皮—苔蘚結(jié)皮的順序演替[7-8]，在某些特定環(huán)境條件下，可以跳躍地衣階段，直接由藻結(jié)皮發(fā)育為苔蘚結(jié)皮[9]。隨著生物結(jié)皮的演替，生態(tài)系統(tǒng)中的群落組成也在發(fā)生變化，處在不同的發(fā)育演替階段時(shí)期具有不同的生態(tài)價(jià)值，在土壤性能、抗減壓力、水文過(guò)程以及固碳(C)、氮(N)效能等方面也有較大差別[10-11]。生物結(jié)皮的發(fā)育類型會(huì)影響到微生物的代謝，而微生物代謝的變化也被認(rèn)為是影響土壤養(yǎng)分循環(huán)的最大不確定因素之一[12-13]。因此明確生物結(jié)皮發(fā)育過(guò)程中微生物的代謝至關(guān)重要。

碳、氮、磷(P)代謝是土壤微生物最重要的代謝過(guò)程，并且營(yíng)養(yǎng)化學(xué)計(jì)量是控制微生物代謝的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力[14]。生物結(jié)皮在不同發(fā)育階段下養(yǎng)分狀況會(huì)存在差異[15]，當(dāng)養(yǎng)分化學(xué)計(jì)量處于不平衡時(shí)，微生物代謝就會(huì)受到限制[16]。生物土壤結(jié)皮在不同發(fā)育階段下微生物受到何種養(yǎng)分限制以及限制如何變化尚不明確。而生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量可用于估計(jì)微生物養(yǎng)分需求和土壤養(yǎng)分供應(yīng)之間的平衡[17]，用于揭示以碳、氮或磷為代表的微生物代謝限制的特征[18]。另外，在黃土垂直節(jié)理發(fā)育的陡壁上所生長(zhǎng)的生物結(jié)皮更為集中。因此，本研究選擇黃土丘陵區(qū)垂直斷面上所發(fā)育的不同類型生物結(jié)皮為研究對(duì)象，探究其發(fā)育過(guò)程中的養(yǎng)分與生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量特征，進(jìn)一步明確在生物結(jié)皮發(fā)育過(guò)程中微生物的限制性養(yǎng)分與影響因素，為科學(xué)認(rèn)識(shí)生物結(jié)皮的生態(tài)功能以及微生物代謝狀況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點(diǎn)位于陜西省安塞縣的紙坊溝(109°15′E，36°44′N)、馬家溝(109°16′E，36°50′N)和腰鼓山(109°18′E，36°51′N)3個(gè)地區(qū)。該地區(qū)是典型的黃土丘陵溝壑區(qū)，平均海拔1 200 m左右。該區(qū)年均溫8.8℃，年均降水量300～650 mm，年日照時(shí)數(shù)約2 400 h，屬于暖溫帶半干旱季風(fēng)氣候。土壤類型以黃綿土為主，分布的地帶性植被主要有沙棘(Hippophaerhamnoides)、長(zhǎng)芒草(Stipabungeana)、茵陳蒿(Artemisiacapillaries)、胡枝子(Lespedezabicolor)等。

1.2 樣品采集

本研究于2020年8月對(duì)生物土壤結(jié)皮樣品進(jìn)行采集。在紙坊溝、馬家溝和腰鼓山3個(gè)地區(qū)選擇海拔一致，生物結(jié)皮發(fā)育完整的垂直陡壁為采樣點(diǎn)并作為樣地重復(fù)，樣地的坡度均接近90°。在每個(gè)樣地中，按照蘚的蓋度[19]采集4種類型的生物結(jié)皮：淺色藻結(jié)皮(LA)、深色藻結(jié)皮(DA)、藻蘚混合結(jié)皮(AM)和蘚結(jié)皮(M)(蘚蓋度分別為0，0%～30%，30%～70%和70%～100%)。其平均厚度分別為2.76，4.03，5.70，7.58 mm。每個(gè)采樣斑塊中的生物結(jié)皮應(yīng)均勻分布且每個(gè)斑塊間距離在2 m以上。在每個(gè)樣地中，按照隨機(jī)采樣和多點(diǎn)混合的原則采集每種類型的生物結(jié)皮層，每種類型的結(jié)皮分5～7點(diǎn)采樣，最終混合作為一個(gè)分析樣。另外，采集垂直面上沒(méi)有生物結(jié)皮發(fā)育的裸土作為對(duì)照處理(CK)。每個(gè)樣本分為兩個(gè)子樣本，一份樣本立即放在4℃冰箱中保存，兩周內(nèi)用于分析酶活性和微生物量，其他樣本風(fēng)干后用于理化性質(zhì)分析。

1.3 樣品測(cè)定

用烘干法測(cè)定土壤含水量；pH用電位法(水土比為2.5∶1)測(cè)定；采用重鉻酸鉀—外加熱法測(cè)定土壤有機(jī)碳(SOC)的含量；凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮(TN)含量(KjeltecTM2399，瑞典)；可溶性有機(jī)碳(DOC)和可溶性有機(jī)氮(DON)提取后由Multi C/N 3100測(cè)定。分別用濃硫酸—高氯酸和0.5 mol/L的碳酸氫鈉處理土壤，用鉬銻抗—紫外分光光度法測(cè)定全磷(TP)和速效磷(Olsen-P)含量(Hitachi UV2300)。采用氯仿熏蒸法測(cè)定微生物生物量[20](MBC，MBN，MBP)，將未熏蒸和熏蒸樣品間的差異作為微生物量，MBC，MBN和MBP的轉(zhuǎn)化系數(shù)分別為0.45，0.54，0.40。保存在4℃中的樣品用來(lái)測(cè)定參與碳氮磷循環(huán)的水解酶活性。包括：β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)，β-D-纖維二糖水解酶(CBH)，β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)，L-亮氨酸氨肽酶(LAP)，堿性磷酸酶(AP)。5種酶活性均采用微孔板熒光法進(jìn)行測(cè)定[21-22]，所有酶活性均以nmol/(g SOM h)來(lái)表示。

1.4 計(jì)算方法

胞外酶活性的計(jì)算公式為：

Ab=FV/(eV1tm)

F=(f-fb)/q-fs

e=fr/(csV2)

q=(fq-fb)/fr

式中:Ab為樣品酶活性[nmol/(g干土h)];F是校正后樣品熒光值;V是懸濁液的總體積;e為熒光釋放系數(shù);V1為微孔板每個(gè)孔中加入的樣品懸濁液體積;t為培養(yǎng)時(shí)間;m為干土樣的質(zhì)量;f是酶標(biāo)儀所讀取樣品的熒光值;fb為空白對(duì)照孔的熒光值;q為淬火系數(shù);fs為陰性對(duì)照微孔的熒光值;fr為參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值;cs是參考標(biāo)準(zhǔn)孔的濃度;V2為所加入?yún)⒖紭?biāo)準(zhǔn)物體積;fq為淬火標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值。

利用酶計(jì)量的矢量模型計(jì)算向量長(zhǎng)度與角度來(lái)量化微生物的養(yǎng)分限制特征[23]，計(jì)算公式如下：

Length= SQRT(x2+y2)

Angle(°)=Degrees[Atan2(x,y)]

式中:Length表示向量長(zhǎng)度,值越大表示微生物相對(duì)C限制越大;Angle表示向量角度,角度小于45°表示微生物受到土壤的N限制,反之受到土壤P限制,微生物N限制隨角度減小而增加,P限制隨角度增加而增大。x為(BG+CBH)/(BG+CBH+AP),y為(BG+CBH)/(BG+CBH+LAP+NAG)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey test多重比較檢驗(yàn)各處理間的差異性。采用廣義線性模型來(lái)確定微生物相對(duì)C限制和相對(duì)P限制間的關(guān)系。利用R軟件的“Vegan”包進(jìn)行冗余分析(RDA)，利用“plspm”包中的“innerplot”函數(shù)進(jìn)行偏最小二乘路徑模型(PLS-PM)分析結(jié)皮類型，土壤性質(zhì)和微生物量對(duì)微生物養(yǎng)分限制的直接和間接效應(yīng)。所有分析和繪圖分別在軟件R(v.3.6.3)和軟件Origin 2021中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型生物土壤結(jié)皮性質(zhì)特征

不同結(jié)皮類型下的土壤理化性質(zhì)存在顯著差異(表1)。4種結(jié)皮類型(LA，DA，AM和M)的土壤總有機(jī)碳、全氮、全磷、可溶性有機(jī)碳、可溶性有機(jī)氮和土壤含水量均顯著高于CK處理(p<0.05)，CK的速效磷含量(1.29 ± 0.08 mg/kg)在數(shù)值上也小于各個(gè)結(jié)皮類型。盡管pH在各處理間的差異不顯著，但在數(shù)值上CK的pH最高(8.13±0.10)。除了DOC和pH外，蘚結(jié)皮的SOC，TN，TP，DON，Olsen-P和含水量均為最高(p<0.05)，分別為(9.78 ± 0.41)g/kg，(0.87±0.02)g/kg，(0.51±0.01)g/kg，(118±6.09)mg/kg，(4.32±0.52)mg/kg，19.3%±0.75%，并且在大小順序上均表現(xiàn)為M>AM>DA>LA。DOC與其他不同，DA處理最高(p<0.05)，為(304±8.07)mg/kg?？偟膩?lái)說(shuō)，生物土壤結(jié)皮的生長(zhǎng)促進(jìn)了土壤中養(yǎng)分含量以及含水量的增加，并且隨著裸土、淺色藻結(jié)皮、深色藻結(jié)皮、藻蘚混合結(jié)皮和蘚結(jié)皮的順序逐漸增加。

表1 不同類型生物土壤結(jié)皮理化性質(zhì)特征

圖1為不同類型結(jié)皮的微生物量特征。CK的微生物量碳、氮、磷均為最低(p<0.05)，分別是(127±4.32)mg/kg，(6.84±1.21)mg/kg，(2.02±0.71)mg/kg。與理化性質(zhì)的結(jié)果類似，蘚結(jié)皮的微生物量最高(p<0.05)，其微生物量碳、氮、磷分別是CK處理的18.3，27.6，14.1倍。各處理微生物量在數(shù)值上均表現(xiàn)為M>AM>DA>LA>CK?？梢?jiàn)，生物結(jié)皮的發(fā)育促進(jìn)了微生物量的逐漸增加。

注：CK表示裸土；LA表示淺色藻結(jié)皮；DA表示深色藻結(jié)皮；AM表示藻蘚混合結(jié)皮；M表示蘚結(jié)皮。不同小寫(xiě)字母表示不同類型的生物結(jié)皮之間差異顯著(p<0.05)。下圖同。

2.2 不同類型生物土壤結(jié)皮胞外酶活性特征

生物結(jié)皮類型對(duì)土壤胞外酶活性具有顯著影響(表2)。結(jié)皮下土壤胞外酶活性均顯著高于裸土(p<0.05)。BG，CBH和NAG的酶活性均表現(xiàn)為隨著LA，DA，AM和M的順序逐漸增加，其中，M處理的CBH顯著高于AM，DA和LA處理，分別是其1.83，2.14，2.19倍。LAP的最大值出現(xiàn)在AM處理(p<0.05)，為(1 852±125)nmol/(g SOM h)。DA處理的AP酶活性最大，為(7 387±251)nmol/(g SOM·h)，但與其他結(jié)皮類型間沒(méi)有顯著差異。

表2 不同類型生物土壤結(jié)皮酶活性

2.3 矢量模型分析微生物代謝特征

利用酶計(jì)量的矢量模型計(jì)算不同類型結(jié)皮的向量長(zhǎng)度和角度來(lái)量化微生物的相對(duì)C限制與相對(duì)P限制(圖2A和2B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CK處理表現(xiàn)為最低的相對(duì)C限制(0.72±0.03)與最高的相對(duì)P限制(61.0±1.19)，而M處理相反，表現(xiàn)為最高的相對(duì)C限制(0.89±0.03)與最低的相對(duì)P限制(55.1±1.29)。其他3種類型結(jié)皮的相對(duì)C和P限制處于二者之間且差異不顯著。通過(guò)線性回歸分析了向量長(zhǎng)度與向量角度的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，二者存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖2C)，其回歸方程為y=-0.02x+1.98(R2=0.61，p<0.001)。

圖2 不同類型生物土壤結(jié)皮的向量長(zhǎng)度與夾角特征及其二者關(guān)系

2.4 環(huán)境因子對(duì)生物土壤結(jié)皮酶活性及微生物養(yǎng)分限制的影響

利用RDA分析了生物土壤結(jié)皮下的土壤性質(zhì)與土壤C，N，P獲取酶的關(guān)系(圖3)，土壤性質(zhì)能夠解釋酶活性59.2%的變異，其中軸1與軸2的解釋率分別為56.1%和3.10%。微生物C獲取酶與土壤養(yǎng)分(SOC，TN，TP)和微生物量(MBC，MBN，MBP)存在正相關(guān)，P獲取酶相反，N獲取酶與pH間存在較強(qiáng)正相關(guān)。

注：C獲取酶包括β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)和β-D-纖維二糖水解酶(CBH)，N獲取酶包括β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和L-亮氨酸氨肽酶(LAP)，P獲取酶為堿性磷酸酶(AP)。

通過(guò)偏最小二乘路徑模型(PLS-PM)確定各因素對(duì)微生物C，P限制的直接和間接效應(yīng)(圖4A和4B)。生物結(jié)皮類型直接影響?zhàn)B分含量、微生物量和含水量，進(jìn)而對(duì)微生物的相對(duì)C，P限制造成影響。結(jié)皮類型(+0.75)、養(yǎng)分含量(+0.43)和微生物量(+0.60)對(duì)微生物的相對(duì)C限制影響最大(圖4C)，對(duì)微生物相對(duì)P限制影響最大的是結(jié)皮類型(-0.71)和養(yǎng)分含量(-0.72)(圖4D)。

注：實(shí)線和虛線分別表示正向和負(fù)向影響(p<0.05)，箭頭上方的數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)化路徑系數(shù)，R2表示每個(gè)變量解釋的方差。其中，養(yǎng)分含量包括：DOC，DON和Olsen-P；微生物量包括：MBC，MBN和MBP。

3 討 論

3.1 生物土壤結(jié)皮的性質(zhì)

生物土壤結(jié)皮的發(fā)育改善了土壤的養(yǎng)分狀況。在本研究結(jié)果中，4種生物土壤結(jié)皮類型(LA，DA，AM和M)的總有機(jī)碳、全氮、全磷、可溶性有機(jī)碳、可溶性有機(jī)氮和土壤速效磷含量均高于裸土(表1)，與以往的研究結(jié)果類似。Elbert等[24]研究表明每年由生物結(jié)皮對(duì)C的吸收約為3.9 Pg，相當(dāng)于陸地植被凈初級(jí)生產(chǎn)力的7%，同時(shí)生物結(jié)皮顯著增加了表層土壤有機(jī)碳的含量[25]。生物結(jié)皮對(duì)氮元素的固定起著重要作用，Russow等[26]通過(guò)研究生物結(jié)皮和大氣氮沉降的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大氣中84%以上的氮可以通過(guò)生物結(jié)皮進(jìn)行固定；而生物結(jié)皮中的藍(lán)藻和藍(lán)藻共生地衣，能夠?qū)⒋髿庵械腘2固定為可被植物利用的氮進(jìn)入土壤，增加了表層土壤N的輸入[27]；此外，明姣等[28]研究發(fā)現(xiàn)生物結(jié)皮的形成顯著的提高了土壤全氮的含量，并且對(duì)土壤中氮素的貢獻(xiàn)主要集中在結(jié)皮層。生物結(jié)皮的發(fā)育也可以加速土壤有效磷的積累，一方面生物結(jié)皮分泌的有機(jī)酸能夠溶解磷酸鹽而釋放磷；另一方面，生物結(jié)皮通過(guò)提高結(jié)皮層土壤堿性磷酸酶的活性和有機(jī)質(zhì)含量，降低土壤pH，進(jìn)而提高了土壤磷素有效性[29-30]。盡管在本研究中各處理間的pH沒(méi)有顯著差異，但是各結(jié)皮處理的pH均小于裸土，這與上述結(jié)果是一致的。

與裸土相比，4種類型的生物結(jié)皮生長(zhǎng)顯著增加了微生物生物量碳氮磷(p<0.05，圖1)。這與本研究中土壤養(yǎng)分和土壤含水量的變化是一致的，在適宜的養(yǎng)分與水分條件下，可以為微生物的生長(zhǎng)提供有利的條件[14]，偏最小二乘路徑模型結(jié)果也展示出養(yǎng)分含量對(duì)微生物量的直接作用更為顯著(圖4)。當(dāng)然，微生物的生長(zhǎng)也可以促進(jìn)養(yǎng)分的積累和水分的涵養(yǎng)[31]。生物結(jié)皮一般會(huì)按照藻結(jié)皮—地衣結(jié)皮—苔蘚結(jié)皮的順序演替[7-8]，在本研究中土壤養(yǎng)分、水分和微生物量均隨裸土、淺色藻結(jié)皮、深色藻結(jié)皮、藻蘚混合結(jié)皮和蘚結(jié)皮的順序逐漸增加，反映出在生物結(jié)皮發(fā)育過(guò)程中有助于土壤性質(zhì)的改善。

3.2 生物土壤結(jié)皮的酶活性和微生物養(yǎng)分限制

參與C，N和P循環(huán)的相關(guān)酶活性均表現(xiàn)為結(jié)皮的酶活性顯著大于裸土(p<0.05，表2)，這表示微生物在生物結(jié)皮中的C，N，P代謝速率更快，與微生物量的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。此外，以往的研究表明，土壤酶活性受到土壤養(yǎng)分狀況影響較大[32]，并且在養(yǎng)分匱乏時(shí)微生物可以分泌酶到環(huán)境中來(lái)獲取所需的養(yǎng)分[33]。本研究中，RDA結(jié)果表明土壤的養(yǎng)分狀況(SOC，TN和TP)與酶活性存在較強(qiáng)的相關(guān)性，并且能夠解釋酶活性大部分的變異(圖3)。因此不同結(jié)皮類型間的養(yǎng)分差異會(huì)影響到土壤酶的活性。

酶計(jì)量的矢量模型結(jié)果表示在各個(gè)類型下微生物均受到相對(duì)C限制和相對(duì)P限制，并且微生物相對(duì)C，P限制間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖2)。其中裸土的相對(duì)C限制低于各結(jié)皮處理，而相對(duì)P限制高于各結(jié)皮處理(圖2A和2B)。這可能是由于土壤本身的P元素較為匱乏，不能滿足微生物生長(zhǎng)需求，并且從裸土發(fā)育到淺色藻結(jié)皮、深色藻結(jié)皮和藻蘚混合結(jié)皮的過(guò)程中，土壤速效磷含量并沒(méi)有顯著變化(p>0.05)。P元素的限制也會(huì)影響到微生物對(duì)其他養(yǎng)分的吸收和微生物代謝[34]。為了緩解P限制，微生物群落在分泌與P代謝相關(guān)的酶時(shí)會(huì)消耗掉一定的C[35]；有機(jī)質(zhì)分解也會(huì)釋放P供微生物利用[36]，微生物需要分泌更多的C獲取酶水解有機(jī)質(zhì)來(lái)緩解自身P的限制，這些過(guò)程都會(huì)導(dǎo)致微生物相對(duì)C限制的增加。此外，從裸土發(fā)育到結(jié)皮的過(guò)程中，微生物量顯著增加，微生物間對(duì)資源的競(jìng)爭(zhēng)也會(huì)造成相對(duì)C限制的加劇。

在淺色藻結(jié)皮發(fā)育到蘚結(jié)皮的過(guò)程中，盡管相對(duì)C限制在各類型間差異不顯著，但是數(shù)值上表現(xiàn)為先降低后增加的趨勢(shì)。DA處理的相對(duì)C限制最低，其可溶性有機(jī)碳含量在此時(shí)是最高的(表1)。Sinsabaugh等[33]指出速效養(yǎng)分對(duì)微生物生長(zhǎng)影響更大，高的養(yǎng)分可利用性一定程度上能夠緩解微生物的養(yǎng)分限制[18]。同理，蘚結(jié)皮的速效磷含量最高而P限制最低，與此觀點(diǎn)是一致的。并且偏最小二乘路徑模型結(jié)果也展示出速效養(yǎng)分含量對(duì)相對(duì)C，P限制均有較大影響。另外，土壤水分在低水平時(shí)的微生物代謝活性會(huì)受到抑制[37]，在裸土和結(jié)皮發(fā)育初期的水分含量很低，微生物對(duì)有機(jī)物質(zhì)的分解較慢也會(huì)造成較高的磷限制。結(jié)合偏最小二乘路徑模型的結(jié)果來(lái)看，生物結(jié)皮的類型會(huì)直接影響到土壤中的養(yǎng)分狀況、水分和微生物量進(jìn)而間接影響微生物的代謝限制。本文主要基于酶活性及其計(jì)量模型對(duì)于微生物代謝情況進(jìn)行判斷和分析，在后續(xù)工作中需要結(jié)合微生物的群落特征以及參與碳氮磷循環(huán)的功能基因特征進(jìn)行更全面以及深入的探討。

4 結(jié) 論

(1)從裸土到生物土壤結(jié)皮各發(fā)育階段，結(jié)皮養(yǎng)分、水分和微生物量均逐漸增加，表明生物結(jié)皮發(fā)育過(guò)程對(duì)土壤性質(zhì)的改善起到積極作用。

(2)參與C，N和P循環(huán)的相關(guān)酶活性增加，反映出微生物在生物土壤結(jié)皮中的C，N，P代謝速率加快，并且受到不同結(jié)皮類型間養(yǎng)分差異的影響。

(3)生物土壤結(jié)皮的發(fā)育造成微生物相對(duì)碳限制的增大與相對(duì)磷限制的減小，受到養(yǎng)分可利用性的影響。另外，生物土壤結(jié)皮的類型會(huì)直接影響到其中的養(yǎng)分狀況、水分和微生物量進(jìn)而間接影響微生物的代謝限制。