• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    巨噬細胞耗竭及其在肝損傷中的應(yīng)用

    2022-12-27 13:00:06劉亮明
    臨床肝膽病雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:酸鹽脂質(zhì)體轉(zhuǎn)基因

    于 倩,趙 賽,劉亮明

    南京醫(yī)科大學(xué)上海松江臨床醫(yī)學(xué)院,上海 201615

    巨噬細胞是先天性免疫系統(tǒng)的組成部分,具有促進損傷愈合、產(chǎn)生活性氧物質(zhì)和吞噬異物的作用,其功能異??梢饳C體免疫反應(yīng)失調(diào)或組織病理性損傷。巨噬細胞有組織駐留型和非組織駐留型兩種細胞群體,其共有的顯著特征主要是具有分泌功能,包括分泌具有廣泛生物學(xué)功能的細胞因子、生長因子、免疫炎癥因子和趨化因子等。巨噬細胞的另一特征是能夠表達特定的細胞表面標志物如F4/80、CD68、iNOS和CD206等[1]。非組織駐留的巨噬細胞主要分布于循環(huán)系統(tǒng)內(nèi),而駐留型巨噬細胞則主要存在于各個組織器官中,如神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞、肝臟Kupffer細胞、皮膚朗格漢斯細胞和腹腔的巨噬細胞等。巨噬細胞的分化、增殖和極化依賴于特定的生長因子及其受體。巨噬細胞的表型受到其周圍微環(huán)境的影響,目前已鑒定出兩類極化表型的巨噬細胞:M1和M2表型細胞。M1表型細胞,也被稱為經(jīng)典激活的巨噬細胞,表達iNOS,釋放促炎細胞因子,如TNFα、IL-1b、IL-6和IL-12;而M2型巨噬細胞,即交替激活的巨噬細胞,表達CD206和Arg-1,負責釋放抗炎細胞因子,如IL-10[2]。

    巨噬細胞表型與功能活性的這種多樣性和復(fù)雜性,使得巨噬細胞的體內(nèi)生物學(xué)研究存在一定困難。為解決這一問題,近年采用了一種稱為巨噬細胞耗竭的方法來進行研究。巨噬細胞耗竭實際上是一種采用理化或遺傳學(xué)技術(shù)將巨噬細胞去除的方法。這種方法現(xiàn)已廣泛用于研究巨噬細胞在動物疾病模型中的作用和免疫病理或炎癥損傷機制,也開始用于某些疾病模型如移植排異[3]、腸腫瘤[4]和心功能不全[5]等的治療研究。在本文中,主要介紹了近年應(yīng)用較多的幾種巨噬細胞耗竭方法及其在肝損傷中的應(yīng)用。

    1 巨噬細胞耗竭方法

    1.1 氯膦酸鹽脂質(zhì)體法 脂質(zhì)體是具有雙層磷脂結(jié)構(gòu)的納米級囊泡[6],生物相容性好,不會引起抗原、熱原、過敏和毒性反應(yīng),易被生物降解,能夠封裝活性藥物,因此被作為載體廣泛地應(yīng)用于藥物遞送[7]。其中,氯膦酸鹽脂質(zhì)體法是目前最常用的巨噬細胞耗竭方法。

    在體內(nèi),脂質(zhì)體封裝形式的氯膦酸鹽可被巨噬細胞吞噬并攝入細胞內(nèi),此時細胞內(nèi)的溶酶體磷脂酶會消化磷脂雙層,釋放其中的氯膦酸鹽分子。細胞內(nèi)的氯膦酸鹽達到某一閾值濃度時,可抑制ATP依賴性酶,損害并破壞細胞能量代謝,導(dǎo)致巨噬細胞凋亡[8]。此外,氯膦酸鹽半衰期很短,也難以透過細胞膜,對非吞噬細胞無明顯毒性作用,故通過選擇給藥途徑可以獲得器官特異性的巨噬細胞消耗。例如,皮下注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體能夠耗竭小鼠引流淋巴結(jié)中的巨噬細胞[8];靜脈注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體可以耗竭肝臟、脾、骨髓和血液中的巨噬細胞[9]。

    脂質(zhì)體包封藥物對巨噬細胞耗竭維持時間較短。肝內(nèi)Kupffer細胞耗盡后,新的Kupffer細胞會在1周左右重新出現(xiàn)[6]。為了達到較長時間去除巨噬細胞的目的,現(xiàn)多采用多次用藥的方式解決。該方法中首次注射脂質(zhì)體封裝的氯膦酸鹽劑量為200μL,之后每隔4 d減量至100μL注射[10]。但是重復(fù)使用可導(dǎo)致中性粒細胞增多、貧血以及促炎因子IL-6和IL-1β的表達增加[11]。

    1.2 GdCl3注射方法 GdCl3酸性溶液靜脈注射時在溶酶體中被解離成游離的Gd3+,這些游離的Gd3+顆粒能夠被Kupffer細胞吸收并促使其自身凋亡[12]。Bloomer等[13]證實GdCl3可減少巨噬細胞特異性標志物如CD206的表達,并損害肝臟中巨噬細胞的吞噬功能。GdCl3溶液腹腔給藥可以耗盡Kupffer細胞以及靜脈途徑給藥可以抑制巨噬細胞在肝臟的浸潤和活化[14-15]。然而,GdCl3對結(jié)腸黏膜巨噬細胞無明顯的耗竭作用[16]。長期給予GdCl3對肝功能或動物存活的影響很小,這表明它是一種安全的實驗試劑,可為巨噬細胞耗竭提供一種有前途的策略。

    1.3 阻斷集落刺激因子-1及其受體(CSF-1/CSF-1R)信號方法 CSF-1是由c-fms基因編碼的巨噬細胞特異性生長因子[17],主要產(chǎn)生于中性粒細胞、肝星狀細胞、胸腺基質(zhì)細胞、脂肪組織源性和肝源性間皮細胞、成骨細胞和神經(jīng)元[18-20]。巨噬細胞的產(chǎn)生、增殖和存活依賴于CSF-1,并在其細胞表面高水平表達CSF-1R(CD115)。CSF-1能夠通過CSF-1R酪氨酸激酶的自身磷酸化和隨后下游分子的磷酸化來發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此,以CSF-1/CSF-1R為靶點的方法也成為巨噬細胞耗竭的一種重要手段。

    GW2580是一種選擇性CSF-1R酪氨酸激酶抑制劑,常被用來研究小膠質(zhì)細胞在疾病中的作用。CSF-1能夠與小膠質(zhì)細胞表達的CSF-1R結(jié)合,導(dǎo)致酪氨酸受體激酶二聚化和自磷酸化,并觸發(fā)調(diào)節(jié)生存的ERK和AKT通路的激活。GW2580對小鼠的治療誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細胞中增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄和炎癥相關(guān)基因的下調(diào),這可能是減少脊髓損傷后的神經(jīng)炎癥和促進功能恢復(fù)的原因[21]。除此之外,GW2580還能夠耗竭腎臟、脾臟及腹膜腔的巨噬細胞,但是對循環(huán)中的單核細胞沒有影響[22]。類似地,CSF-1R的小分子抑制劑PLX3397和SU11248也可有效去除巨噬細胞[23-24]。

    巨噬細胞特異性基因敲除和點突變模型是全面了解單核吞噬細胞群在宿主組織穩(wěn)態(tài)及病理條件下功能的重要工具。Kupffer細胞是完全依賴于CSF-1的組織駐留巨噬細胞[25],因此,Csf基因自發(fā)突變小鼠(Csf1op/Csf1op)模型是研究Kupffer細胞在體內(nèi)功能的有效工具。即使是在CSF-1缺失的情況下,巨噬細胞的分化和存活也能由IL-34通過其共同的受體CSF-1R代償[26],這可能也是相比于Csf1op/Csf1op小鼠,Csf-1r基因敲除小鼠(Csf1r-/Csf1r-)表現(xiàn)出更嚴重的巨噬細胞耗竭的原因[27-28]。

    1.4 巨噬細胞耗竭轉(zhuǎn)基因模型 轉(zhuǎn)基因小鼠通過特定方法在其基因組中引入外源DNA,并驅(qū)動表達具有特定功能的基因以達到某種生物學(xué)功能。因此,巨噬細胞耗竭也可以通過轉(zhuǎn)基因動物模型實現(xiàn)?;诎缀矶舅厥荏w(DTR)的轉(zhuǎn)基因小鼠是目前應(yīng)用最多的用于巨噬細胞耗竭的轉(zhuǎn)基因模型。小鼠細胞由于缺乏對白喉毒素(DT)的功能性細胞表面受體,因此對DT具有天然的抵抗力。通過人DTR轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)能夠在體內(nèi)通過DT給藥實現(xiàn)對特定類型的小鼠細胞的有效誘導(dǎo)消融[29]。例如,施用DT使得CD11b-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠選擇性地耗盡巨噬細胞及其他髓系細胞如單核細胞、破骨細胞、小膠質(zhì)細胞和樹突狀細胞等[30]。

    目前,尚沒有任何理化手段可以達到在不干擾整個單核巨噬細胞系統(tǒng)的情況下選擇性地只耗竭組織駐留的巨噬細胞,因此,研究人員提出了基于細胞特異的基因設(shè)計靶向耗竭組織駐留巨噬細胞的方案。Clec4f是Kupffer細胞特異性表達的基因,參與Kupffer細胞的糖脂呈遞過程[31]。Scott等[32]設(shè)計了基于Clec4f基因的KC-DTR巨噬細胞耗竭模型,旨在排除其他單核巨噬細胞系統(tǒng)細胞耗竭對實驗的影響。不僅如此,由于基因的特異性,該模型還實現(xiàn)了對Kupffer細胞100%的耗竭效率[32]。類似地,Slco2b1-flox/DTR轉(zhuǎn)基因小鼠被設(shè)計用于間質(zhì)巨噬細胞的耗竭[33]。

    M2型巨噬細胞由于具有強大的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用,在過去十年引起了越來越多的關(guān)注。Mrc1是表達于M2亞群的特異性標記基因[29],因此,Kambara等[2]建立了Mrc1基因啟動子控制下表達人DTR的轉(zhuǎn)基因小鼠。CD206,又稱甘露糖受體,主要表達于M2型巨噬細胞和未成熟樹突狀細胞表面[34]。實驗結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因小鼠上給予DT可以引起CD206陽性細胞的條件性消融,這意味著在體內(nèi)平衡條件下M2極化的巨噬細胞可以被有效地耗盡[2]。

    另一個應(yīng)用較為廣泛的轉(zhuǎn)基因模型是Fas誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡(macrophage Fas-induced apoptosis,MAFIA)轉(zhuǎn)基因小鼠模型。MAFIA轉(zhuǎn)基因小鼠的巨噬細胞表達在Csf1r啟動子的控制下驅(qū)動自殺基因Fas的表達[35]。轉(zhuǎn)基因插入物包含突變的人FK506結(jié)合蛋白1A(FKBP12),它能夠優(yōu)先結(jié)合小分子耦合物AP20187,激活caspase-8途徑并且使得巨噬細胞Fas結(jié)構(gòu)域交叉連接,從而誘導(dǎo)程序性巨噬細胞凋亡[36]。盡管MAFIA轉(zhuǎn)基因小鼠的脊髓小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞也表達FKBP12,但由于AP20187不能通過血腦屏障,該轉(zhuǎn)基因模型不能用于小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞相關(guān)疾病的研究[37]。

    研究[38]表明,MAFIA轉(zhuǎn)基因小鼠巨噬細胞耗竭模型可獲得95%以上的巨噬細胞耗竭效率。目前,該模型所耗竭的巨噬細胞亞型以M2型為主。Bailey等[39]研究表明在巨噬細胞耗竭的MAFIA小鼠中,關(guān)節(jié)內(nèi)巨噬細胞短暫地耗竭顯著增加了M1型巨噬細胞的數(shù)量,M2型巨噬細胞的數(shù)量則呈現(xiàn)下降趨勢。目前對于巨噬細胞耗竭模型中極性變化的機制尚不明了。

    2 巨噬細胞耗竭與肝損傷

    肝巨噬細胞包括組織駐留巨噬細胞和由趨化因子招募的循環(huán)單核細胞。Kupffer細胞是肝臟駐留的巨噬細胞,是肝臟微環(huán)境中細胞因子和生長因子的主要來源,因此,在調(diào)節(jié)肝臟免疫及炎癥中具有重要作用。Kupffer細胞是肝臟的主要免疫細胞,通過去除該細胞或抑制其功能可以探索其在肝損傷中的作用。

    大多數(shù)研究證明,Kupffer細胞耗竭或抑制其功能在肝臟中發(fā)揮保護性作用(圖1)。Schümann等[40]的研究表明,在去除Kupffer細胞的情況下,肝損傷僅限于少數(shù)幾個小壞死區(qū)。Guo等[15]發(fā)現(xiàn)GdCl3處理的小鼠口服氨芐西林可降低門靜脈血中的內(nèi)毒素水平,并減輕肝損傷。Kupffer細胞的早期激活促進了活性氧物質(zhì)和促炎介質(zhì)的形成。GdCl3對Kupffer細胞激活的抑制作用在體內(nèi)肝臟再灌注損傷的大鼠模型中顯示出潛在的肝臟保護作用[41]。

    圖1 巨噬細胞耗竭的肝保護作用機制Figure 1 Liver protective mechanisms of macrophage depletion

    慢性肝損傷經(jīng)常導(dǎo)致肝星狀細胞的激活和肝纖維化的進展。大量研究[6]證明,抑制Kupffer細胞能明顯降低肝酶活性,改善肝纖維化。因此,Kupffer細胞在與肝纖維化相關(guān)的炎癥中起著關(guān)鍵作用。相關(guān)光電子顯微鏡下可見Kupffer細胞與位于竇周隙的肝星狀細胞相互作用[20],證明Kupffer細胞在調(diào)節(jié)肝星狀細胞以及促進肝纖維化中具有重要作用。TNFα和IL-1是激活肝星狀細胞的主要細胞因子[20]。研究[40,42]表明,巨噬細胞耗竭能夠顯著降低Kupffer細胞來源的促炎性細胞因子,如IL-1和TNFα的水平,提示Kupffer細胞耗竭通過旁分泌作用調(diào)節(jié)肝星狀細胞,從而改善肝纖維化。LncRNA-H19被證明能夠抑制肝細胞膽汁酸失調(diào)以及激活肝星狀細胞促進肝纖維化[43]。Tian等[44]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞耗竭能夠顯著降低肝臟中LncRNA-H19的表達,從而抑制膽管結(jié)扎所誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷和纖維化。此外,Pradere等[45]研究發(fā)現(xiàn),肝巨噬細胞以一種依賴于NF-κB的方式增強肝星狀細胞的存活。相反,體內(nèi)纖維化形成過程中巨噬細胞的耗盡會導(dǎo)致肝星狀細胞中的NF-κB活性受到抑制。

    肝臟的纖維間隔存在豐富的膠原和成熟的彈性蛋白。彈性蛋白的降解能夠促進肝纖維化的進展,而MMP-12在調(diào)節(jié)彈性蛋白中具有重要作用。巨噬細胞耗竭實驗[46]表明,巨噬細胞是MMP-12的唯一來源,這提示巨噬細胞可能通過產(chǎn)生MMP-12介導(dǎo)彈性蛋白降解從而加重肝纖維化。CD206作為模式識別受體調(diào)節(jié)巨噬細胞吞噬作用,它能夠內(nèi)化巨噬細胞和肝竇細胞中的膠原蛋白,這在纖維化中起著至關(guān)重要的作用。GdCl3處理后,CD206在小鼠肝臟中的表達下調(diào),促進CD206陽性細胞的凋亡,從而緩解肝纖維化[47]。

    肌成纖維細胞由肝星狀細胞激活后轉(zhuǎn)分化而來,能夠分泌大量細胞外基質(zhì),是肝纖維化進展的重要環(huán)節(jié)。因此,抗纖維化治療的主要目標之一是開發(fā)一種以成纖維細胞為靶標的藥物遞送系統(tǒng),以抑制肝纖維化。最新采用膜融合技術(shù)開發(fā)了氯膦酸鹽-尼達尼布(NIN)-外泌體-脂質(zhì)體雜交納米顆粒(CLD/NIN@LIEV),該方法搭載了靶向成纖維細胞的藥物NIN[6]。細胞外囊泡(EV)是成纖維細胞來源的外泌體,對肝成纖維細胞具有同源歸巢作用,從而增強NIN作用的靶向性。CLD/NIN@LIEV中的氯膦酸鹽一方面抑制肝臟Kupffer細胞活性,減少Kupffer細胞對納米顆粒的非特異性吞噬作用,進一步增加NIN向成纖維細胞的傳遞;另一方面抑制Kupffer細胞分泌炎性細胞因子,緩解肝臟炎癥及延緩纖維化進展。

    目前,M1和M2型巨噬細胞極化已經(jīng)被證明在炎癥和肝損傷的進展中發(fā)揮重要作用,因此利用轉(zhuǎn)基因巨噬細胞耗竭模型實現(xiàn)對特定巨噬細胞亞型的耗竭有利于探索不同亞型巨噬細胞和疾病的關(guān)系。筆者團隊[48]首次提出了“Ces1f可能通過Kupffer細胞M1極化介導(dǎo)急性肝衰竭肝組織炎癥損傷”的假說,因此,采用巨噬細胞耗竭有希望能夠進一步探索Ces1f與肝臟M1型巨噬細胞之間的關(guān)系。

    3 小結(jié)

    肝巨噬細胞在慢性肝損傷的發(fā)病機制中起著重要作用,并被認為是肝損傷治療的潛在靶點。這些作用包括清除病原體或細胞碎片;在損傷反應(yīng)中釋放抗炎細胞因子;在慢性肝損傷中調(diào)節(jié)非實質(zhì)性肝細胞群及免疫細胞。了解巨噬細胞耗竭促進肝損傷的機制,無論是通過抑制外周單核細胞浸潤,還是通過抑制Kupffer細胞功能或巨噬細胞極化,可能有助于開發(fā)新的針對肝損傷和纖維化的方案。

    然而巨噬細胞耗竭中存在一些問題,比如,巨噬細胞耗竭效率難以量化、耗竭的亞型難以確定、耗竭對象不具有特異性即可能會損傷除巨噬細胞外的其他免疫及非免疫細胞。氯膦酸鹽脂質(zhì)體法作為當前應(yīng)用最為廣泛的巨噬細胞耗竭方法,盡管具有經(jīng)濟、制備簡單的優(yōu)點,但其對巨噬細胞耗竭效率差異很大(通常50%~95%),研究結(jié)果的可靠性有待評估[38]。目前,巨噬細胞耗竭作為一種建立模型的方法被應(yīng)用于大量的實驗研究,幾乎所有的方法都有其缺陷,以至于很多相似的實驗得出不同的實驗結(jié)果。實驗結(jié)果的不嚴謹一方面是未選擇符合自身實驗設(shè)計的耗竭方法,另一方面是巨噬細胞耗竭方法本身就具有很多局限性,例如,Csf-1r基因敲除模型中CSF-1R除了能夠在巨噬細胞表達,還能在樹突狀細胞和單核細胞表達[49]。如果不能排除其他免疫細胞對實驗的影響,該方法則不具有嚴謹性。轉(zhuǎn)基因模型能夠基于細胞特異的基因設(shè)計靶向特定巨噬細胞亞型的方案,具有耗竭效率高以及耗竭特異性強的優(yōu)勢,然而轉(zhuǎn)基因小鼠價格昂貴及繁育周期長是實驗設(shè)計需要考慮的重要影響因素。巨噬細胞耗竭方法的主要局限性嚴重阻礙了對巨噬細胞是否真正參與疾病進展的判定。因此,亟需探索出能夠最大程度地減少包含任何潛在混雜因素的巨噬細胞耗竭模型,從而最終確定巨噬細胞在各種疾病發(fā)病機制中的作用。

    利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

    作者貢獻聲明:于倩負責收集整合文獻資料以及撰寫論文;趙賽負責收集文獻;劉亮明對確定寫作思路及框架具有關(guān)鍵貢獻,并且參與指導(dǎo)撰寫、修改論文以及文章最終定稿。

    猜你喜歡
    酸鹽脂質(zhì)體轉(zhuǎn)基因
    探秘轉(zhuǎn)基因
    轉(zhuǎn)基因,你吃了嗎?
    PEG6000修飾的流感疫苗脂質(zhì)體的制備和穩(wěn)定性
    雙膦酸鹽在骨相關(guān)疾病診斷和治療中的研究進展
    超濾法測定甘草次酸脂質(zhì)體包封率
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:08
    TPGS修飾青蒿琥酯脂質(zhì)體的制備及其體外抗腫瘤活性
    中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:08:52
    天然的轉(zhuǎn)基因天然的轉(zhuǎn)基因“工程師”及其對轉(zhuǎn)基因食品的意蘊
    高鐵酸鹽的制備、性質(zhì)及在水處理中的應(yīng)用
    磷鉬釩雜多酸鹽MxHyP2Mo15V3O62的合成及其催化性能研究
    Keggin結(jié)構(gòu)雜多酸鹽的合成、表征及催化燃油超深度脫硫
    国产一区有黄有色的免费视频| 欧美97在线视频| kizo精华| 制服丝袜香蕉在线| 美女国产视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 99热6这里只有精品| 成年av动漫网址| 熟女av电影| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久成人免费电影| 超碰av人人做人人爽久久| 国产淫片久久久久久久久| 国产在线一区二区三区精| 特级一级黄色大片| 国产极品天堂在线| 亚洲精品国产成人久久av| 99久国产av精品国产电影| 极品教师在线视频| 男女那种视频在线观看| 熟女电影av网| 日日撸夜夜添| 久久久久九九精品影院| 亚洲av在线观看美女高潮| 人妻一区二区av| 22中文网久久字幕| 夫妻午夜视频| 久久久久网色| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产老妇女一区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 激情 狠狠 欧美| 好男人在线观看高清免费视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产av码专区亚洲av| 欧美bdsm另类| 欧美激情在线99| 熟女人妻精品中文字幕| 国产午夜精品一二区理论片| 青春草国产在线视频| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 一个人看的www免费观看视频| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久久精品性色| 午夜视频国产福利| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 嫩草影院精品99| 99久国产av精品国产电影| 乱码一卡2卡4卡精品| 观看免费一级毛片| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜免费鲁丝| 午夜精品国产一区二区电影 | 一级片'在线观看视频| 久久久久九九精品影院| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲成色77777| 又大又黄又爽视频免费| 丝袜美腿在线中文| 欧美高清性xxxxhd video| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 深夜a级毛片| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产伦理片在线播放av一区| 一区二区三区精品91| 久久久久久久午夜电影| 色视频www国产| 久久亚洲国产成人精品v| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美国产精品一级二级三级 | 嫩草影院入口| tube8黄色片| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产av国产精品国产| 91精品国产九色| 欧美人与善性xxx| av在线观看视频网站免费| 成人特级av手机在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 成人一区二区视频在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 久热这里只有精品99| 交换朋友夫妻互换小说| 大片电影免费在线观看免费| 国产黄色视频一区二区在线观看| 熟女av电影| 亚洲自拍偷在线| 免费观看性生交大片5| 免费看日本二区| 一个人看视频在线观看www免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 我要看日韩黄色一级片| 18禁动态无遮挡网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美zozozo另类| 亚洲精品国产av蜜桃| 黄色一级大片看看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 禁无遮挡网站| 另类亚洲欧美激情| 亚洲熟女精品中文字幕| 91在线精品国自产拍蜜月| 中文字幕免费在线视频6| 99久久九九国产精品国产免费| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美区成人在线视频| 我的女老师完整版在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久久国产网址| 各种免费的搞黄视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 老司机影院毛片| 亚洲精品乱久久久久久| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久久久伊人网av| 日韩免费高清中文字幕av| 国产成人a区在线观看| 永久免费av网站大全| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 最近的中文字幕免费完整| 免费av观看视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 高清毛片免费看| 全区人妻精品视频| 久久久久久国产a免费观看| 秋霞在线观看毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 美女国产视频在线观看| 一级黄片播放器| 久久久久久久久久成人| 男女下面进入的视频免费午夜| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 在线观看一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 亚洲性久久影院| 成人国产麻豆网| 插阴视频在线观看视频| 久久亚洲国产成人精品v| 五月伊人婷婷丁香| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人午夜精彩视频在线观看| 少妇丰满av| 高清欧美精品videossex| 精品视频人人做人人爽| 国产一区二区在线观看日韩| 下体分泌物呈黄色| 黄色一级大片看看| xxx大片免费视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 九九在线视频观看精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 超碰97精品在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 男女国产视频网站| 97在线人人人人妻| av在线观看视频网站免费| 丝袜美腿在线中文| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 美女主播在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品一及| 日本黄色片子视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线观看人妻少妇| 街头女战士在线观看网站| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲国产av新网站| 免费在线观看成人毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 欧美一级a爱片免费观看看| 男女边摸边吃奶| 免费观看无遮挡的男女| 日韩一区二区视频免费看| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本一二三区视频观看| 搞女人的毛片| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 三级国产精品片| 国产精品.久久久| 在线观看三级黄色| 国产精品蜜桃在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产 一区 欧美 日韩| freevideosex欧美| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 青春草视频在线免费观看| 成人黄色视频免费在线看| 一本久久精品| 在线播放无遮挡| 在线观看一区二区三区| 少妇熟女欧美另类| 国产免费福利视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 在线精品无人区一区二区三 | 美女内射精品一级片tv| 免费看不卡的av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产人妻一区二区三区在| 熟女av电影| 中国三级夫妇交换| 又爽又黄无遮挡网站| 老司机影院毛片| 综合色av麻豆| 国产高清三级在线| 亚洲精品日韩av片在线观看| 水蜜桃什么品种好| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产极品天堂在线| 麻豆成人午夜福利视频| 成人亚洲精品一区在线观看 | 综合色丁香网| 免费人成在线观看视频色| 99热国产这里只有精品6| 国产片特级美女逼逼视频| 岛国毛片在线播放| 亚洲内射少妇av| 国产91av在线免费观看| 午夜日本视频在线| 午夜老司机福利剧场| 亚洲欧美成人精品一区二区| 在线观看三级黄色| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品福利在线免费观看| 国产成人aa在线观看| 国产精品.久久久| 久久精品综合一区二区三区| 男女那种视频在线观看| 日本wwww免费看| 久久人人爽人人片av| 高清午夜精品一区二区三区| 综合色丁香网| kizo精华| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产69精品久久久久777片| 成年女人看的毛片在线观看| 嫩草影院入口| 久久久久国产网址| 免费大片18禁| 97超碰精品成人国产| 免费电影在线观看免费观看| 高清毛片免费看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 春色校园在线视频观看| www.av在线官网国产| 亚洲国产欧美人成| 免费少妇av软件| 看非洲黑人一级黄片| 国产人妻一区二区三区在| 国产男女超爽视频在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲av福利一区| 久久久久久久国产电影| 街头女战士在线观看网站| 国产片特级美女逼逼视频| 国产黄片美女视频| 黄色怎么调成土黄色| 成年女人在线观看亚洲视频 | 成人欧美大片| 亚洲av免费在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产黄色免费在线视频| 国产人妻一区二区三区在| 国产老妇女一区| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产午夜精品一二区理论片| 一级a做视频免费观看| 高清在线视频一区二区三区| 日韩伦理黄色片| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产av码专区亚洲av| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费看不卡的av| 欧美精品国产亚洲| 丝袜喷水一区| 亚洲av.av天堂| 免费在线观看成人毛片| h日本视频在线播放| 最近最新中文字幕免费大全7| 免费观看的影片在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲精品色激情综合| 国产精品嫩草影院av在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 精品久久久精品久久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲欧美精品专区久久| 黄色怎么调成土黄色| 又爽又黄无遮挡网站| 伦理电影大哥的女人| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 免费av不卡在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美97在线视频| 51国产日韩欧美| 另类亚洲欧美激情| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 99久久人妻综合| 1000部很黄的大片| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产成人aa在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品精品国产色婷婷| 精品人妻一区二区三区麻豆| 视频区图区小说| 美女高潮的动态| 国产黄色免费在线视频| 韩国av在线不卡| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品一区www在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品久久久久久久末码| 久久女婷五月综合色啪小说 | 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本午夜av视频| 久久99热6这里只有精品| av网站免费在线观看视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 伦理电影大哥的女人| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费av观看视频| 一级毛片电影观看| 午夜视频国产福利| 激情五月婷婷亚洲| 国产精品国产av在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩电影二区| 国产黄a三级三级三级人| tube8黄色片| 我的女老师完整版在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产精品专区欧美| 又爽又黄a免费视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 干丝袜人妻中文字幕| 久久99精品国语久久久| 久久精品夜色国产| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲电影在线观看av| 97热精品久久久久久| av天堂中文字幕网| 精品久久久久久久末码| 熟女电影av网| 热99国产精品久久久久久7| 最近中文字幕2019免费版| 大片免费播放器 马上看| 黄色配什么色好看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美高清成人免费视频www| 丰满乱子伦码专区| 国产在线男女| 中国国产av一级| 午夜免费男女啪啪视频观看| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久欧美国产精品| av一本久久久久| 99久久精品一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 免费看不卡的av| 舔av片在线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 99九九线精品视频在线观看视频| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲色图综合在线观看| .国产精品久久| 六月丁香七月| 国产精品久久久久久久电影| 久久国内精品自在自线图片| 身体一侧抽搐| 国产人妻一区二区三区在| 在线观看av片永久免费下载| 一级黄片播放器| 亚洲真实伦在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 日本午夜av视频| 中文字幕免费在线视频6| 少妇丰满av| 99久久人妻综合| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 97在线人人人人妻| 国产成年人精品一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 五月玫瑰六月丁香| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲最大成人av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产黄片视频在线免费观看| www.av在线官网国产| 欧美成人a在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 男插女下体视频免费在线播放| 成年女人看的毛片在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品成人在线| 国产v大片淫在线免费观看| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 成人国产av品久久久| 边亲边吃奶的免费视频| 乱系列少妇在线播放| 国产精品国产三级专区第一集| 免费在线观看成人毛片| 五月伊人婷婷丁香| 久久久久久久久久久丰满| 97超视频在线观看视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产视频首页在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一区二区三区免费毛片| av在线蜜桃| 日韩 亚洲 欧美在线| 日本与韩国留学比较| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品国产三级普通话版| 观看免费一级毛片| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品人妻久久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品影视一区二区三区av| 全区人妻精品视频| 51国产日韩欧美| 国产精品成人在线| 制服丝袜香蕉在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品偷伦视频观看了| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美bdsm另类| 99热这里只有是精品50| 久久久精品94久久精品| 国产欧美亚洲国产| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产免费福利视频在线观看| 人妻系列 视频| 亚洲熟女精品中文字幕| videos熟女内射| 国产亚洲5aaaaa淫片| 有码 亚洲区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品成人在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 五月伊人婷婷丁香| 国产综合懂色| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 人人妻人人看人人澡| av在线播放精品| 国产老妇女一区| 国产人妻一区二区三区在| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 中文字幕亚洲精品专区| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩av不卡免费在线播放| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 中文字幕久久专区| 欧美性感艳星| 黄色日韩在线| 简卡轻食公司| 成人黄色视频免费在线看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 只有这里有精品99| 三级国产精品片| 两个人的视频大全免费| 丝袜美腿在线中文| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久久精品欧美日韩精品| 另类亚洲欧美激情| 亚洲综合色惰| av线在线观看网站| eeuss影院久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 免费观看在线日韩| 一级毛片久久久久久久久女| 直男gayav资源| 亚洲精品视频女| 丝袜脚勾引网站| 成人毛片a级毛片在线播放| 交换朋友夫妻互换小说| 边亲边吃奶的免费视频| 下体分泌物呈黄色| 久久久午夜欧美精品| 99热6这里只有精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| a级毛色黄片| 高清午夜精品一区二区三区| 久久国内精品自在自线图片| 全区人妻精品视频| 日本一二三区视频观看| 天堂中文最新版在线下载 | 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 免费在线观看成人毛片| 国产爱豆传媒在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产亚洲一区二区精品| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩一区二区三区影片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产乱来视频区| 日韩av不卡免费在线播放| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲电影在线观看av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 欧美激情久久久久久爽电影| 国产黄片视频在线免费观看| 日韩国内少妇激情av| 国产av国产精品国产| 大香蕉久久网| 91精品伊人久久大香线蕉| 成年版毛片免费区| 久久午夜福利片| 国产精品.久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看| 三级经典国产精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 性色avwww在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲av免费高清在线观看| 我的老师免费观看完整版| 国产精品一区www在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 午夜激情福利司机影院| www.av在线官网国产| 午夜日本视频在线| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品成人在线| 成人亚洲精品av一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品一二三区在线看| 亚洲欧美精品专区久久| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲美女视频黄频| 高清毛片免费看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品一二三区在线看| 亚洲av日韩在线播放| 国产亚洲av嫩草精品影院| 两个人的视频大全免费| 男人和女人高潮做爰伦理| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲精品,欧美精品| 91精品国产九色| 日日撸夜夜添| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品三级大全| 亚洲欧美成人精品一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 一级a做视频免费观看| 色5月婷婷丁香| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲经典国产精华液单| videossex国产| 交换朋友夫妻互换小说| 人妻系列 视频| 视频区图区小说| av在线老鸭窝| 丰满乱子伦码专区| 在线精品无人区一区二区三 | 国产在视频线精品| 日本免费在线观看一区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线观看av片永久免费下载| 少妇 在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲成人一二三区av| 国产精品无大码| 免费黄网站久久成人精品|