自身免疫性肝炎中隱匿性HBV感染的情況及其對疾病進(jìn)展的影響

陳欣欣，張海萍，黃春洋，蘇建榮，閆惠平

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京 100050；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京 100069

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的炎癥，需要排除病毒性肝炎、酒精性或非酒精性脂肪性肝病等其他病因肝病后做出診斷，免疫抑制劑治療有效［1－2］。AIH的致病機(jī)制尚不完全清楚，與遺傳易感性、免疫紊亂、病毒感染（HBV、HCV）及環(huán)境等多種因素有關(guān)。

HBV感染是我國最主要肝臟疾病，經(jīng)過數(shù)十年的乙型肝炎疫苗接種和有效的抗病毒治療，目前感染率已經(jīng)明顯下降。隱匿性HBV感染（occult HBV infection，OBI）作為HBV的一種特殊感染形式，表現(xiàn)為HBsAg陰性，而血清和/或肝組織中檢測到HBV DNA［3］。因此，OBI仍具有傳播性，若使用免疫抑制治療的患者可出現(xiàn)HBV再激活，且與肝臟疾病的進(jìn)展有關(guān)。除一般人群存在隱匿性HBV感染外，Georgiadou等［4］曾報(bào)道在AIH中OBI檢出率為13.64%（9/66）。國內(nèi)關(guān)于AIH患者中OBI的情況鮮有報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)已對合并OBI的AIH患者HBV基因亞型及S基因的變異特點(diǎn)進(jìn)行了報(bào)道分析［5］，本文旨在進(jìn)一步研究OBI對AIH的疾病進(jìn)展或預(yù)后有無影響，以期為疾病的診治提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年4月1日—2019年3月31日期間北京佑安醫(yī)院診斷為AIH的患者樣本103例，其中17例患者已接受免疫抑制劑治療。全部患者HBsAg陰性，排除合并乙型肝炎、丙型肝炎、藥物性肝損傷等其他肝病者。AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國際AIH組織制定的AIH評分系統(tǒng)和簡化評分標(biāo)準(zhǔn)［6－7］，以及《自身免疫性肝炎診斷和治療共識（2015）》［8］。隨訪時(shí)間定義為從確診至最后1次統(tǒng)計(jì)或者患者死亡。87例（84.47%，87/103）患者成功進(jìn)行隨訪，平均隨訪時(shí)間為26.53個(gè)月（范圍：1～74個(gè)月）?；颊叩念A(yù)后主要考慮患者死亡和出現(xiàn)不良事件，不良事件包括出現(xiàn)肝硬化、肝硬化失代償、肝移植。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)指標(biāo)檢測 羅氏combas e601型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測HBV標(biāo)志物；Olympus AU5400全自動生化分析儀檢測生化指標(biāo)，如ALT、AST等；羅氏（Roche）E170檢測免疫學(xué)指標(biāo)，IgG、IgA、IgM、C3、C4等；間接免疫熒光法和免疫印跡法檢測自身抗體，如抗核抗體（ANA）、抗平滑肌抗體（SMA）、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體（SLA/LP）等，試劑購自德國歐蒙公司。

1.2.2 HBV DNA提取和檢測 103例患者的血清標(biāo)本均為首診時(shí)采集保存，利用QIAamp mini Elute病毒核酸提取試劑盒提取待測樣本血清中的核酸。由于隱匿感染者體內(nèi)HBV DNA含量很低，一般檢測方法可能會漏檢。依據(jù)2008年歐洲肝病學(xué)會（EASL）國際OBI感染研討會推薦的巢式PCR的方法［3］，對HBV基因組的C、P、X、S四個(gè)開放閱讀框的區(qū)域進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行Sanger測序分析。將乙型肝炎陽性標(biāo)本DNA作為陽性對照，健康人血清DNA為陰性對照，Nuclease－Free Water為空白對照，每個(gè)樣本均進(jìn)行2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)HBV兩個(gè)或兩個(gè)區(qū)域以上擴(kuò)增陽性時(shí)判為HBV DNA陽性。本研究相關(guān)引物合成和測序均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

利用COBAS?AmpliPrep/COBAS?TaqMan?病毒載量全自動系統(tǒng)，檢測OBI患者血清中HBV DNA病毒載量。

1.2.3 OBI患者血清HBV pgRNA的檢測 血清HBV pgRNA的檢測采用HBV pgRNA測定試劑盒（PCR－熒光探針法），定量測定血清標(biāo)本中的HBV pgRNA。試劑盒購自北京熱景生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布計(jì)量資料用s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)（最小值～最大值）表示，兩組間比較采用Mann－Whitney U秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher檢驗(yàn)。Kaplan－Meier法繪制生存曲線，采用Cox回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AIH患者中OBI的確定 103例AIH患者經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增并測序，結(jié)果顯示，24例（23.30%，24/103）標(biāo)本在兩個(gè)或者兩個(gè)以上HBV DNA閱讀框區(qū)域的巢式PCR擴(kuò)增陽性（圖1），參照指南中OBI的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，診斷為OBI。

圖1 C、S、P、X四個(gè)閱讀框的巢式PCR擴(kuò)增電泳圖Figure 1 The results of nesting PCR amplification of C，S，P，X four reading frames

為避免假陽性“False”O(jiān)BI的存在［9］，對HBV DNA病毒載量同時(shí)進(jìn)行定量分析。14例（58.33%，14/24）HBV DNA病毒載量低于20 IU/mL，10例（41.67%，10/24）HBV DNA病毒載量＞20 IU/mL，最高值為1.43×102IU/mL，均＜200 IU/mL。再次證實(shí)這24例符合OBI診斷，而且患者HBV DNA均處于低拷貝復(fù)制狀態(tài)，無“False”O(jiān)BI。

2.2 HBV基因分型結(jié)果 對24例OBI血清HBV S基因成功進(jìn)行了巢式PCR擴(kuò)增和測序，測序結(jié)果進(jìn)行HBV基因分型分析。其中19例OBI標(biāo)本成功進(jìn)行直接測序，11例（57.89%，11/19）為HBV C基因型，8例（42.11%，8/19）為HBV B基因型，未見其他基因型。5例直接測序失敗的標(biāo)本進(jìn)行克隆測序，結(jié)果顯示：其中4例為混合基因型感染（HBV B＆C），且混合感染樣本中基因型C所克隆樣本數(shù)目高于基因型B（72.50%vs 27.50%）（詳細(xì)結(jié)果見［5］）。

2.3 合并OBI的患者血清HBV pgRNA水平 通過PCR熒光探針法檢測AIH合并OBI感染的24例患者的血清中HBV pgRNA，以評估其cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性和HBV的感染力。結(jié)果顯示：15例（62.50%，15/24）患者的血清HBV pgRNA＜300拷貝/mL。9例（37.50%，9/24）患者的血清HBV pgRNA＞300拷貝/mL，在這9例OBI患者中，其肝細(xì)胞核中具有較高的cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性（圖2）。此9例標(biāo)本HBV基因分型結(jié)果顯示，3例為B型，4例為C基因型，2例為B/C混合感染基因型。

圖2 AIH合并OBI患者血清的HBV pgRNA水平Figure 2 HBV pgRNA in serum of patients with AIH combined with OBI infection

2.4 OBI患者主要臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比對分析 103例AIH患者分為兩組：合并OBI組（n＝24）、無OBI組（n＝79）。與無OBI組相比，合并OBI組患者在年齡和性別分布上、生化指標(biāo)（如ALT、AST等）和免疫學(xué)等指標(biāo)（如ANA、SMA等）均未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均＞0.05）（表1）。

表1 AIH患者（是/否）合并OBI的生化免疫指標(biāo)比較Table 1 Biochemical and immunological characteristics of OBI patients

HBV血清標(biāo)志物：103例AIH患者均為HBsAg陰性，其中，44例（42.72%）為抗－HBc陽性，與無OBI組比，抗－HBc對OBI的檢出無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但HBV的三個(gè)抗體（抗－HBc/抗－HBs/抗－HBe）同時(shí)陽性在合并OBI組出現(xiàn)的比例顯著高于無OBI組（χ2＝5.906，P＝0.016）（表2）。

表2 AIH患者是/否合并OBI的HBV血清標(biāo)志物比較Table 2 The comparison of HBV serum markers in AIH patients with or without occult HBV infection

2.5 隨訪和預(yù)后 87例（84.47%，87/103）患者成功進(jìn)行隨訪，其中21例為合并OBI的患者。隨訪時(shí)間平均值為26.53（1～74）個(gè)月。隨訪過程中共14例（16.09%，14/87）患者出現(xiàn)不良事件，5年的生存率為67.82%。21例OBI組患者組中，6例（25%，6/24）出現(xiàn)了不良事件，其5年的生存率為61.90%（圖3）。單因素的生存分析發(fā)現(xiàn)：OBI、低蛋白血癥、脾腫大、腹水為AIH不良事件的危險(xiǎn)因素（P值均＜0.05），與疾病進(jìn)展相關(guān)。進(jìn)一步行多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，低蛋白血癥、腹水為不良事件相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P值均＜0.05）（表3）。

表3 AIH患者產(chǎn)生不良事件的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of adverse events in patients with AIH

圖3 AIH患者生存曲線的比較Figure 3 Predicting clinical outcomes of AIH patients stratified by OBI

3 討論

OBI的危害在于［10－14］：（1）由于患者HBsAg陰性但HBV DNA陽性，其具有的傳染性易被忽略；（2）HBV存在被再激活的可能性，已有報(bào)道證明在某些特定情況下（如患者接受免疫抑制劑治療、接受放化療等），隱匿的HBV可被再激活，患者出現(xiàn)肝功能異常、肝細(xì)胞損傷、病毒復(fù)制活躍，有可能加速疾病的進(jìn)展。（3）OBI可能是加速肝病進(jìn)展，形成肝硬化或向HCC發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素之一。有文獻(xiàn)［15］報(bào)道，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等風(fēng)濕免疫疾病患者長期接受免疫抑制劑治療過程中患者出現(xiàn)ALT升高，HBV DNA陽性，表現(xiàn)出OBI的再激活。因此，建議對可能發(fā)生HBV再激活的患者，激素治療前先期應(yīng)用抗HBV治療。AIH是一種免疫介導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎癥，免疫抑制劑治療有效。那么，AIH患者中是否也存在伴OBI，感染率如何，對疾病的進(jìn)展有無影響？這些問題國內(nèi)罕見報(bào)道。

本研究表明AIH患者中存在較高的OBI感染率（23.30%），高于與希臘患者相關(guān)的報(bào)道（13.64%）［4］，此結(jié)果可能與HBV流行的地域性差異有關(guān)。OBI在AIH患者中的檢出率也高于我國普通人群曾報(bào)道的OBI的檢出率（2.0%～11.5%）［9］。此前筆者團(tuán)隊(duì)報(bào)道［5］了合并OBI的AIH患者HBV病毒學(xué)特點(diǎn)：HBV基因型為B型和C型，存在B/C混合型；AIH患者合并的OBI與顯性的HBV感染者病毒基因型分布特點(diǎn)一致；還報(bào)道了多個(gè)與OBI發(fā)生及疾病進(jìn)展相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)，有助于更好地了解AIH患者合并OBI的病毒學(xué)特點(diǎn)。

HBV感染肝細(xì)胞后在細(xì)胞核形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）并持續(xù)存在，是乙型肝炎患者難以停藥及停藥后發(fā)生病毒學(xué)反彈的主要因素［16－17］。HBV前基因組RNA（Pregenomic RNA，pgRNA）是cccDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以病毒顆粒形式表達(dá)于HBV相關(guān)肝病患者的血清中，是反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的理想指標(biāo)［18］。為了解OBI感染后病毒是否也在肝細(xì)胞核內(nèi)形成cccDNA，本研究對24例OBI患者血清進(jìn)行HBV pgRNA的檢測，其中9例（37.50%，9/24）HBV pgRNA＞300拷貝/mL。結(jié)果表明，發(fā)生OBI的AIH患者的肝細(xì)胞核中也存在較高的cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。隨訪中對87例中的11例合并OBI的AIH患者進(jìn)行近2年的HBV DNA病毒載量的檢測沒有顯著的變化，尚未發(fā)現(xiàn)HBV再激活情況。但是，建議臨床在免疫抑制劑治療AIH的過程中應(yīng)注重對這類患者HBV DNA的實(shí)時(shí)監(jiān)測，以防止HBV的再激活，影響治療甚至疾病的進(jìn)程。

單項(xiàng)抗－HBc陽性通常被認(rèn)為是HBV既往感染的標(biāo)志物，不過在抗－HBc陽性的HCV感染者中可能有更高的OBI患病率［19］，但也有文獻(xiàn)［20］得出了相反的結(jié)論。本研究顯示，AIH患者抗－HBc陽性率為42.72%（44/103），顯著高于正常人群抗－HBc陽性率（7.2%～11.7%）的報(bào)道［9，21］。且AIH合并OBI的患者與三種HBV血清標(biāo)志物（抗－HBs＆抗－HBc＆抗－HBe）同時(shí)陽性具有顯著相關(guān)性（P＝0.016），而與抗－HBc單獨(dú)陽性者相關(guān)性不顯著。此外，24例OBI患者的樣本中9例（37.50%，9/24）為HBV血清學(xué)標(biāo)志物全部陰性，此現(xiàn)象也在丙型肝炎患者合并OBI的病例中有過報(bào)道［22］。因此，無論是在HBV血清學(xué)標(biāo)志物陽性或者陰性的AIH患者中，均有可能存在合并OBI的可能，這也為AIH患者的OBI診斷提出了一定的挑戰(zhàn)。

本研究對患者的部分臨床信息和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果做了分析，與非OBI組相比，OBI組患者在年齡和性別分布上、生化指標(biāo)（如ALT、AST等）和免疫學(xué)等指標(biāo)（如ANA、SMA等）未發(fā)現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測可能與病例數(shù)較少以及AIH患者的高度個(gè)體化免疫抑制劑治療有關(guān)。

在對HCV和HIV的研究中有文獻(xiàn)［23－24］報(bào)道，合并OBI可能增加慢性HCV感染者發(fā)生HCC或肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)。合并OBI對AIH疾病進(jìn)程有無影響？在國內(nèi)外還鮮有報(bào)道。本文對87例AIH患者進(jìn)行了隨訪，其中21例為合并OBI的AIH患者，研究發(fā)現(xiàn)合并OBI與低蛋白血癥、脾腫大、腹水均為AIH不良事件的危險(xiǎn)因素，影響疾病預(yù)后。與非OBI組相比，合并OBI的AIH患者不良事件的累計(jì)發(fā)生率高于單純AIH患者組（P＝0.027），提示合并OBI可能加速AIH疾病的進(jìn)展，臨床醫(yī)生應(yīng)關(guān)注AIH合并OBI的及時(shí)診斷并制訂更適合的治療方案，臨床不應(yīng)忽略AIH合并OBI的問題。

總之，本研究證實(shí)了AIH患者中存在OBI，且感染率較高。但血清HBV DNA處于低或極低水平，部分患者HBV pgRNA陽性，表明存在病毒隱匿傳播和病毒再激活的風(fēng)險(xiǎn)。合并OBI可能是影響AIH患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素之一。這些結(jié)果對深入認(rèn)識AIH合并OBI的問題提供了可靠的數(shù)據(jù)信息。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2012年5月22日和2021年12月30日經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會審批，批號為［2012］44號和［2021］392號?；颊呔炇鹬橥鈺?。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：閆惠平、蘇建榮對研究的思路、設(shè)計(jì)、論文的審閱等有關(guān)鍵貢獻(xiàn)；陳欣欣參與了研究實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)的實(shí)施、數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程，參與起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；張海萍、黃春洋參與了實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析。