Angiopep-2修飾白藜蘆醇脂質(zhì)體的處方優(yōu)化與體外評價

于 洋，孔 亮，劉婉瀅，李灃芮，李學(xué)濤

Angiopep-2修飾白藜蘆醇脂質(zhì)體的處方優(yōu)化與體外評價

于 洋，孔 亮，劉婉瀅，李灃芮，李學(xué)濤*

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

制備Angiopep-2（Ang）修飾的白藜蘆醇（resveratrol，Res）脂質(zhì)體（Ang-Lip/Res），并對其進(jìn)行處方優(yōu)化和體外腦靶向性研究。采用薄膜分散法制備Ang-Lip/Res，利用Box-Benhken響應(yīng)面法對影響其包封率的3因素（磷脂的質(zhì)量濃度、磷脂與藥物的質(zhì)量比、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比）進(jìn)行優(yōu)化處方最佳制備工藝并驗(yàn)證脂質(zhì)體的包封率；采用磺酰羅丹明B蛋白法考察脂質(zhì)體對小鼠神經(jīng)細(xì)胞的毒性；采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡探究細(xì)胞攝取情況；構(gòu)建體外血腦屏障模型，比較白藜蘆醇脂質(zhì)體（Res-Lip）跨越血腦屏障的能力。Ang-Lip/Res的最優(yōu)處方：磷脂的質(zhì)量濃度為4.4 mg/mL，磷脂與白藜蘆醇的質(zhì)量比為11∶1，磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為5.5∶1。按照最佳處方，以磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000及DSPE-PEG2000-Ang為膜材制備的Ang-Lip/Res包封率為（93.28±1.35）%。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50 μmol/L濃度以內(nèi)，Ang-Lip/Res對小鼠神經(jīng)細(xì)胞N2a和bEnd.3無明顯毒性；體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與非靶向Res-Lip相比，Ang的修飾明顯增加了bEnd.3細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取，提高了脂質(zhì)體體外BBB滲透率。成功制備Ang-Lip/Res，可進(jìn)一步應(yīng)用于防治腦部疾病的研究。

白藜蘆醇；Angiopep-2；脂質(zhì)體；細(xì)胞攝??；體外靶向性

白藜蘆醇（3,5,4-三羥基二苯乙烯，resveratrol，Res）是一種存在于虎杖、花生和葡萄等植物中的多酚類化合物，因其具有多種保護(hù)健康的生物學(xué)特性，而備受國內(nèi)外專家學(xué)者的高度重視[1]。在相關(guān)報道中，白藜蘆醇表現(xiàn)出卓越的抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)活性，常用于腦部疾病的研究[2]。然而，白藜蘆醇存在水溶性低、穩(wěn)定性差、不能穿過高選擇性的血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）、生物利用度低等問題，嚴(yán)重阻礙了其應(yīng)用。為了解決上述問題，研究人員做出了很多努力，其中研發(fā)納米給藥系統(tǒng)是較為有效的手段之一。脂質(zhì)體是目前應(yīng)用最廣泛的納米給藥系統(tǒng)，較其他納米給藥系統(tǒng)具有更好的生物相容性，在靶向遞藥、緩釋控釋及減小藥物毒性等方面均具備獨(dú)特優(yōu)勢。研究人員將白藜蘆醇包載在脂質(zhì)體的雙分子層閉合囊泡狀結(jié)構(gòu)中，應(yīng)用于阿爾茨海默病、帕金森病等腦部疾病的治療，相比于游離的白藜蘆醇，脂質(zhì)體使白藜蘆醇的生物利用度大幅提高[3]。此外，將合適的配體修飾在脂質(zhì)體表面，可以增加脂質(zhì)體的主動靶向性，實(shí)現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)遞送[4]。Angiopep-2（Ang）是Angiopeps家族中的一種人工肽，可以通過低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP）受體介導(dǎo)跨越BBB，常應(yīng)用于修飾腦靶向遞藥系統(tǒng)，增強(qiáng)BBB穿透率[5]。

脂質(zhì)體的制備主要有乙醇注入法、硫酸銨梯度法、逆向蒸發(fā)法及薄膜分散法等，需根據(jù)藥物的性質(zhì)不同選擇合適的制備方法。薄膜分散法適用于脂溶性藥物脂質(zhì)體的制備，且操作簡單，白藜蘆醇是脂溶性藥物，宜采用薄膜分散法制備[6]?；诖耍狙芯坎捎帽∧し稚⒎ㄖ苽銩ng修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體（Ang modified resveratrol liposomes，Ang-Lip/ Res），通過Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化制劑處方工藝，并進(jìn)一步對Ang-Lip/Res的神經(jīng)細(xì)胞毒性、體外靶向性、體外BBB滲透能力進(jìn)行考察，以期為白藜蘆醇制劑研發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA1004型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ3200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，超聲功率150 W，工作頻率40 kHz；JY92-2D型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；85-1型磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；2010型液相色譜儀，UV檢測器，島津色譜工作站；Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），月旭科技股份有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-50柱，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；WJ-80B-II型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；T1-S型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；HBS-1096A型酶標(biāo)儀，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 材料

白藜蘆醇，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號J1101A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%；pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS），北京索萊寶科技有限公司，批號1022Q021；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-靶向多肽Ang（DSPE-PEG2000-Ang），遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室合成，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%；蛋黃卵磷脂（egg yolk phosphatidylcholine，EPC），日本NOF公司，批號120015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%；膽固醇，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號F0119A；磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB），大連美侖生物科技有限公司，批號MB1808-1；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；香豆素，大連美侖生物科技有限公司，批號MB4815；白藜蘆醇分析對照品，成都普菲德生物科技有限公司，批號19042607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%；0.25%胰蛋白酶，美國Gibco公司，批號2186964；青霉素/鏈霉素溶液，大連美倫生物科技有限公司，批號MA0110-Aug-13G；甲醇為色譜純。

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3，中科院上海細(xì)胞庫；小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2a，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 Ang-Lip/Res的制備

采用薄膜分散法制備Ang-Lip/Res，精密稱取適量DSPE-PEG2000-Ang、DSPE-PEG2000、白藜蘆醇、卵磷脂和膽固醇于50 mL圓底燒瓶中，加入甲醇超聲溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇，此時圓底燒瓶內(nèi)壁形成一層均勻的薄膜；加入5 mL PBS，超聲振蕩使薄膜溶解；將混合液轉(zhuǎn)移至10 mL EP管中，冰浴下超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲10 min（單次超聲時長10 s，超聲間隔5 s），最后用0.22 μm聚碳酸酯膜擠壓2次，即得Ang-Lip/Res。

采用同樣的方法制備不加DSPE-PEG2000-Ang的白藜蘆醇脂質(zhì)體（Res-Lip），不加白藜蘆醇的空白脂質(zhì)體（B-Lip）。

2.2 白藜蘆醇含量測定的方法學(xué)建立

2.2.1 空白溶液的制備 精密吸取1 mL的B-Lip和適量甲醇置于10 mL棕色量瓶中，超聲破乳，定容至刻度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取1 mL的Ang-Lip/Res和適量甲醇置于10 mL棕色量瓶中，超聲破乳，定容至刻度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇對照品10 mg，以甲醇為溶劑，配成1.0 mg/mL的白藜蘆醇對照品母液。稀釋母液制成質(zhì)量濃度為0.01、0.10、0.19、0.28、0.37、0.46 mg/mL的系列對照品溶液，低溫避光保存，備用。

2.2.4 色譜條件 色譜柱為Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫28 ℃；檢測波長306 nm；體積流量1.0 mL/min；流動相為甲醇-水（55∶45）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.5 專屬性考察 精密吸取10 μL的白藜蘆醇對照品溶液（0.10 mg/mL）、供試品溶液和空白溶液，注入液相色譜儀。結(jié)果如圖1所示，白藜蘆醇色譜峰在5.9 min左右出現(xiàn)，空白溶液無干擾，說明此色譜條件可用于該脂質(zhì)體中白藜蘆醇的含量測定，該方法專屬性良好。

圖1 白藜蘆醇對照品溶液(A)、Ang-Lip/Res供試品溶液(B)、空白溶液(C)的HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 按“2.2.4”項(xiàng)色譜條件對“2.2.3”項(xiàng)中系列白藜蘆醇對照品溶液進(jìn)樣分析，以系列白藜蘆醇對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程＝22 337＋701.72，2＝0.999 1。結(jié)果表明，白藜蘆醇在0.01～0.46 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下白藜蘆醇對照品溶液，同1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣5 d，計算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)精密度RSD為0.44%，日間精密度RSD為0.57%，證明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.4”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果白藜蘆醇峰面積的RSD為1.01%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法制備Ang- Lip/Res，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h時進(jìn)樣測定，結(jié)果，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.93%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取1 mL B-Lip，1 mL白藜蘆醇對照品溶液于10 mL棕色量瓶中，加甲醇超聲破乳、定容，制成供試品溶液，平行6份，進(jìn)樣分析。結(jié)果，白藜蘆醇的平均加樣回收率為102.25%，RSD為0.39%，表明該方法符合要求。

2.2.11 最低檢測限和最低定量限 按“2.2.3”項(xiàng)方法制備白藜蘆醇對照品溶液，進(jìn)樣檢測，當(dāng)信噪比（/）＝3時，對應(yīng)的白藜蘆醇質(zhì)量濃度為檢測限；當(dāng)/＝10時，對應(yīng)的白藜蘆醇質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果，白藜蘆醇檢測限為0.3 μg/mL，定量限為1.5 μg/mL。

2.3 包封率測定

2.3.1 過柱前脂質(zhì)體藥物含量 精密吸取1 mL Ang-Lip/Res，用PBS定容至5 mL，加等量甲醇超聲破乳混勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.3.2 過柱后脂質(zhì)體藥物含量 使用Sephadex G-50凝膠柱洗脫1 mL Ang-Lip/Res，將洗脫液用PBS定容至5 mL，加等量甲醇超聲破乳混勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.3.3 包封率的測定 將上述溶液進(jìn)樣分析，根據(jù)回歸方程得白藜蘆醇的含量，計算包封率。

包封率＝過柱后脂質(zhì)體藥物含量/過柱前脂質(zhì)體藥物含量

2.4 處方優(yōu)化

在文獻(xiàn)調(diào)研及前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定以磷脂的質(zhì)量濃度（1）、磷脂與藥物的質(zhì)量比（2）、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比（3）這3個因素為考察對象，其中各因素的取值范圍：12.2～6.6 mg/mL，26∶1～16∶1，33∶1～8∶1；以Ang-Lip/Res包封率（）為響應(yīng)值進(jìn)行考察。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立擬合數(shù)學(xué)模型，描繪三維效應(yīng)面圖，從效應(yīng)面的較優(yōu)區(qū)域選取最優(yōu)處方。試驗(yàn)因素水平設(shè)計及結(jié)果見表1，試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件，根據(jù)表2所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別將影響因素與包封率進(jìn)行多元2次項(xiàng)擬合，得到擬合方程為＝51.551 10－8.217 051－2.474 102＋36.102 803＋0.104 5512＋1.140 9113＋1.542 0023－0.125 0012－0.270 2022－6.116 8032，2＝0.964 6，＜0.05。說明該模型能較好地反映出響應(yīng)值的變化，可用于篩選Ang-Lip/ Res的最優(yōu)處方。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表2 回歸模型及方差分析

對上述擬合模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。由表2可以看出，所建模型具有極高的顯著性（＜0.01），而失擬項(xiàng)＞0.05，表明失擬不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)2＝0.964 6，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度良好，用該模型分析和預(yù)測Ang-Lip/Res的制備工藝是合適的。通過Design-Expert 8.0.6.1軟件對各因素之間的交互作用進(jìn)行效應(yīng)面分析，繪制因變量的等高線圖與3D響應(yīng)面圖（圖2）。

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行分析優(yōu)化，結(jié)合脂質(zhì)體性狀要求，制備經(jīng)驗(yàn)及脂質(zhì)體制備的實(shí)際情況最終確定Ang-Lip/Res的最優(yōu)處方為14.4 mg/mL，211∶1，35.5∶1，DSPE-PEG20003.5 mg，DSPE-PEG2000-Ang 2 mg，超聲功率500 W，處方量5 mL。

2.5 最優(yōu)處方確定和驗(yàn)證

根據(jù)優(yōu)化所得最佳處方，按相同條件制備3批Ang-Lip/Res進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果3批Ang-Lip/Res的包封率分別為92.17%、93.02%、94.65%，平均包封率為（93.28±1.35）%，包封率的實(shí)測值與Box- Behnken響應(yīng)面法預(yù)測值96.35%相近，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選處方穩(wěn)定性與重現(xiàn)性良好。

2.6 脂質(zhì)體的生物活性初步評價

2.6.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 將bEnd.3細(xì)胞和N2a細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用0.25%胰酶＋1 mmol/L EDTA為消化液進(jìn)行消化和傳代。

2.6.2 脂質(zhì)體對bEnd.3細(xì)胞和N2a細(xì)胞存活率的影響 采用SRB染色法對細(xì)胞存活率進(jìn)行考察。以2.0×104個/孔的密度和1.8×104個/孔的密度將bEnd.3細(xì)胞和N2a細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果加入不同濃度的白藜蘆醇、B-Lip、Res-Lip、Ang-Lip/Res，以DMEM培養(yǎng)基為空白對照，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用10%三氯乙酸固定，蒸餾水洗，SRB染色，晾干，1%冰醋酸洗，加入Tris緩沖液振搖30 min，540 nm處測量樣品吸光度（）值。細(xì)胞存活率＝A/0（式中A為給藥組的值，0為空白對照組的值），各組細(xì)胞存活率測定結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)顯示，在0～50 μmol/L，B-Lip、Res-Lip和Ang-Lip/Res組細(xì)胞存活率在90%以上，白藜蘆醇組細(xì)胞存活率比脂質(zhì)體組低，表明將藥物制成脂質(zhì)體可減弱藥物毒性；在0～50.0 μmol/L制劑膜材對細(xì)胞無明顯毒性，給藥制劑組不會損傷神經(jīng)細(xì)胞活力，可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

圖2 各因素(X1, X2, X3)與響應(yīng)值包封率的三維效應(yīng)面圖和等高線圖

2.6.3 脂質(zhì)體體外攝取情況考察

（1）熒光探針脂質(zhì)體的制備：由于白藜蘆醇不具有熒光性，因此本實(shí)驗(yàn)選用具有熒光性的香豆素作為熒光探針來評價脂質(zhì)體的體外細(xì)胞攝取情況。精密稱取處方量的EPC、膽固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Ang及香豆素于圓底燒瓶中，按“2.4”項(xiàng)所述最優(yōu)處方的方法制備B-Lip、香豆素脂質(zhì)體（coumarin liposome，Cou-Lip）及Angiopep-2修飾的香豆素脂質(zhì)體（Ang-Lip/Cou）。

（2）熒光顯微鏡觀察脂質(zhì)體攝取情況：將bEnd.3細(xì)胞以1.5×105個/孔接種于48孔板中培養(yǎng)24 h。將B-Lip、Cou-Lip和Ang-Lip/Cou加到細(xì)胞板中（各孔中香豆素的終濃度均為3 μmol/L。以B-Lip作為對照，每組3個復(fù)孔），繼續(xù)孵育1 h，DAPI室溫避光染色15 min，利用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度并拍照，結(jié)果如圖3所示，可見，與Cou-Lip組（熒光強(qiáng)度309 207.00±11 792.04）相比，Ang-Lip/Cou組（熒光強(qiáng)度345 500.66±9 812.65）熒光強(qiáng)度具有顯著性（＜0.05）。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞未見香豆素攝取，給藥組具有明顯香豆素攝取，攝取效果為B-Lip＜Cou-Lip＜Ang-Lip/Cou，表明通過Ang修飾脂質(zhì)體可顯著增加細(xì)胞對藥物的攝取。

表3 不同濃度制劑的細(xì)胞毒性

圖3 不同脂質(zhì)體對bEnd.3細(xì)胞的攝取

（3）流式細(xì)胞儀考察脂質(zhì)體攝取情況：細(xì)胞模型的建立同上述方法，bEnd.3細(xì)胞在含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h后，用冷PBS洗3次，消化后用0.3 mL PBS復(fù)懸，采用流式細(xì)胞儀測定與細(xì)胞結(jié)合的香豆素的熒光強(qiáng)度如圖4所示，可見，B-Lip組的熒光強(qiáng)度為19.13±1.53，與Cou-Lip組（熒光強(qiáng)度406.00±33.41）相比，Ang-Lip/Cou組（熒光強(qiáng)度451.33±9.29）熒光強(qiáng)度具有顯著性（＜0.05）。流式細(xì)胞儀的測定結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證Ang-Lip/Cou在bEnd.3細(xì)胞中表現(xiàn)出更好的穿透性，使藥物更容易蓄積。

2.6.4 脂質(zhì)體跨BBB能力的研究

（1）熒光顯微鏡測定：依照文獻(xiàn)方法[7]利用bEnd.3細(xì)胞和N2a細(xì)胞共培養(yǎng)建立體外血腦屏障模型。將bEnd.3細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔的密度接種在Transwell板的上室，N2a細(xì)胞以1×105個/孔接種在下室，培養(yǎng)24 h后，將B-Lip、Cou-Lip和Ang- Lip/Cou用培養(yǎng)基稀釋后加至bEnd.3細(xì)胞層繼續(xù)培養(yǎng)2 h（香豆素的終濃度均為3 μmol/L。以B-Lip作為對照），處理時用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，DAPI染色15 min，再次用PBS洗3次，自然揮干，用熒光顯微鏡觀察并拍照，見圖5。如圖5所示，B-Lip組N2a細(xì)胞無香豆素攝取，Cou-Lip（熒光強(qiáng)度3 760.67±144.69）和Ang-Lip/Cou（熒光強(qiáng)度4 072.79±84.85）表現(xiàn)為明顯的香豆素攝取，且Ang-Lip/Cou組香豆素攝取效果最好，二者相比具有顯著性意義（＜0.05），說明Ang的修飾增強(qiáng)了脂質(zhì)體體外BBB滲透率。

圖4 熒光強(qiáng)度用流式細(xì)胞儀分析

（2）流式細(xì)胞儀測定：體外BBB模型的建立同上述方法，bEnd.3細(xì)胞在含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后，PBS洗3次，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS復(fù)懸，使用流式細(xì)胞儀檢測各組N2a細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，評價靶向脂質(zhì)體透過血腦屏障的效率，如圖6所示，可見，B-Lip組的熒光強(qiáng)度為10.78±2.18，與Cou-Lip組（熒光強(qiáng)度172.00±4.36）相比，Ang-Lip/Cou組（熒光強(qiáng)度119.00±6.56）熒光強(qiáng)度具有顯著性（＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果進(jìn)一步確定Ang修飾后顯著提高脂質(zhì)體穿透BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

圖5 通過顯微鏡觀察N2a細(xì)胞內(nèi)的熒光信號評估脂質(zhì)體在體外跨BBB的能力

圖6 熒光強(qiáng)度用流式細(xì)胞儀分析

3 討論

BBB通過調(diào)節(jié)離子和大分子透過毛細(xì)血管壁擴(kuò)散維持腦組織成分穩(wěn)定，保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)平衡，防止血液循環(huán)中的致病物質(zhì)進(jìn)入大腦[7]。然而，BBB也會阻斷大部分藥物入腦，致使藥物難以在腦內(nèi)達(dá)到有效的治療濃度，給中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療增大障礙[8]。

長期以來，白藜蘆醇被廣泛報道具有較強(qiáng)的抗衰老[9]、神經(jīng)保護(hù)等生理活性[10-12]。但其尚存在水溶性差、難以跨越BBB、代謝迅速等問題，限制了其應(yīng)用[13]。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇合成的具有與細(xì)胞膜相似結(jié)構(gòu)的納米遞藥系統(tǒng)，它既能包載親水性藥物又能包載疏水性藥物，具有改善藥物溶解性，保持藥物活性，使藥物在血液中長效循環(huán)等優(yōu)勢[14]。此外，在脂質(zhì)體表面修飾合適配體，利用配體和受體特異性結(jié)合，可將脂質(zhì)體靶向遞送至受體過表達(dá)的病灶處，使脂質(zhì)體具有特異性靶向作用；在此基礎(chǔ)上，利用腦靶向基團(tuán)識別腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上內(nèi)源性受體即可實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體的主動腦靶向作用[15-16]。

Ang是由19個氨基酸組成的能夠靶向低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽，具有輔助納米載體穿透BBB的能力。研究表明，Ang修飾的納米載體，可以通過BBB上表達(dá)的LRP介導(dǎo)內(nèi)吞進(jìn)入腦組織，且BBB穿透率比轉(zhuǎn)鐵蛋白，乳鐵蛋白高數(shù)十倍，大幅提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療效果[17-19]。Ang修飾腦靶向給藥系統(tǒng)的制備方式有2種：①在已制備完成的納米給藥系統(tǒng)表面用Ang修飾；②將末端修飾的Ang共價連接到脂質(zhì)鏈或聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）鏈的末端與其他材料共同構(gòu)建納米給藥系統(tǒng)。第1種方法較為靈活，但后處理步驟繁瑣。第2種方法操作簡便，有利于脂質(zhì)體的純化，且靶向肽裝載率更高[20]。因此，本研究利用DSPE-PEG2000-Ang與其他材料共同構(gòu)建納米靶向遞藥系統(tǒng)，制備Ang-Lip/Res。

本研究采用薄膜分散法制備Ang-Lip/Res，通過Box-Behnken響應(yīng)面法確定最優(yōu)處方，經(jīng)驗(yàn)證脂質(zhì)體包封率在90%以上。本研究通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)考察Ang-Lip/Res對神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示低劑量Ang-Lip/Res具備生物安全性。此外，本研究進(jìn)一步通過體外攝取實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證Ang修飾脂質(zhì)體在小鼠bEnd.3細(xì)胞中的攝取情況顯著高于未修飾脂質(zhì)體。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ang修飾脂質(zhì)體體外BBB滲透能力高于未修飾脂質(zhì)體。本制劑將為后續(xù)腦部疾病的治療與研究提供參考，為腦靶向制劑的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 張琪, 蘇蘭, 何龍希, 等. 白藜蘆醇的藥理作用及其臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展 [J]. 華西藥學(xué)雜志, 2022, 37(2): 214-217.

[2] Katila N, Duwa R, Bhurtel S,. Enhancement of blood-brain barrier penetration and the neuroprotective effect of resveratrol [J]., 2022, 346: 1-19.

[3] Kong D H, Hong W Y, Yu M,. Multifunctional targeting liposomes of epirubicin plus resveratrol improved therapeutic effect on brain gliomas [J]., 2022, 17: 1087-1110.

[4] Su Y G, Guo C J, Chen Q,. Novel multifunctional bionanoparticles modified with sialic acid for stroke treatment [J]., 2022, 214: 278-289.

[5] Wang J, Kong L, Guo R B,. Multifunctional icariin and tanshinone IIAco-delivery liposomes with potential application for Alzheimer’s disease [J]., 2022, 29(1): 1648-1662.

[6] Liu W, Hou Y, Jin Y,. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism [J]., 2020, 104: 177-189.

[7] Hajal C, Le R B, Kamm R D,Biology and models of the blood-brain barrier [J]., 2021, 23: 359-384.

[8] Dos Santos Rodrigues B, Lakkadwala S, Kanekiyo T,. Dual-modified liposome for targeted and enhanced gene delivery into mice brain [J]., 2020, 374(3): 354-365.

[9] Zhou D D, Luo M, Huang S Y,. Effects and mechanisms of resveratrol on aging and age-related diseases [J]., 2021, 2021: 9932218.

[10] Islam F, Nafady M H, Islam M R,. Resveratrol and neuroprotection: An insight into prospective therapeutic approaches against Alzheimer’s disease from bench to bedside [J]., 2022, 59 (7): 4384-4404.

[11] Kung H C, Lin K J, Kung C T,Oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and neuroprotection of polyphenols with respect to resveratrol in Parkinson’s disease [J]., 2021, 9(8): 918.

[12] Rahman M H, Akter R, Bhattacharya T,Resveratrol and neuroprotection: Impact and its therapeutic potential in Alzheimer’s disease [J]., 2020, 11: 619024.

[13] Han D G, Seo S W, Choi E,Impact of route-dependent phase-II gut metabolism and enterohepatic circulation on the bioavailability and systemic disposition of resveratrol in rats and humans: A comprehensive whole body physiologically-based pharmacokinetic modeling [J]., 2022, 151: 113141.

[14] Khaledian S, Dayani M, Fatahian A,. Efficiency of lipid-based nano drug delivery systems in crossing the blood-brain barrier: A review [J]., 2022, 346: 118278.

[15] Teixeira S, Carvalho M A, Castanheira E M S. Functionalized liposome and albumin-based systems as carriers for poorly water-soluble anticancer drugs: An updated review [J]., 2022, 10(2): 486.

[16] Ruan S B, Zhou Y, Jiang X G,. Rethinking CRITID procedure of brain targeting drug delivery: Circulation, blood brain barrier recognition, intracellular transport, diseased cell targeting, internalization, and drug release [J]., 2021, 8(9): 2004025.

[17] Habib S, Singh M. Angiopep-2-modified nanoparticles for brain-directed delivery of therapeutics: A review [J]., 2022, 14(4): 712.

[18] 張燕, 費(fèi)偉東, 陶姣陽, 等. Angiopep-2修飾的載三氧化二砷介孔二氧化硅脂質(zhì)囊納米遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建及體外評價 [J]. 中草藥, 2018, 49(6): 1289-1297.

[19] Zhu Z C, Zhai Y X, Hao Y,. Specific anti-glioma targeted-delivery strategy of engineered small extracellular vesicles dual-functionalised by Angiopep-2 and TAT peptides [J]., 2022, 11(8): e12255.

[20] Moosavian S A, Sahebkar A. Aptamer-functionalized liposomes for targeted cancer therapy [J]., 2019, 448: 144-154.

Preparation optimization andevaluationof Angiopep-2 modified resveratrol liposomes

YU Yang, KONG Liang, LIU Wan-ying, LI Feng-rui, LI Xue-tao

School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

To prepare and optimize the prescription of Angiopep-2 (Ang) modified resveratrol (Res) liposomes (Ang-Lip/ Res) and performbrain targeting study.The Ang-Lip/Res were prepared by thin film dispersion method, and the three factors [the egg yolk phosphatidylcholine (EPC) concentration, the mass ratio of EPC to cholesterol, and the mass ratio of to Res] affecting liposomes encapsulation rate were optimized using Box-Benhken response surface methodology, and the encapsulation rates of the liposomes were verified; The antiproliferation effect of liposomes on N2a and bEnd.3 cells was investigated by SRB assay. Flow cytometry and microscope were utilized for exploring the cellular uptake. Anmodel of the blood-brain barrier was constructed to compare the ability of resveratrol liposomes to cross the blood-brain barrier.The optimized preparation process and formulation were as follow: EPC concentration of 4.4 mg/mL, EPC to cholesterol mass ratio of 11:1, EPC to resveratrol mass ratio of 5.5:1. According to the optimal prescription, the encapsulation efficiency of Ang-Lip/Res prepared with EPC, cholesterol, DSPE-PEG2000and DSPE- PEG2000-Ang as membrane materials were (93.28 ± 1.35)%. The results of cytotoxicity assay showed that Ang-Lip/Res within 50 μmol/L concentration range was not significantly toxic to mouse neuronal cells N2a and bEnd.3 cells. Thecell uptake results showed that modification of Ang significantly increased uptake efficiency of Ang-Lip/Res by bEnd.3 cells compared to non-targeted Res-Lip and improved its BBB penetration.The Ang-Lip/Res is successfully prepared, which can be used for further research of prevention and treatment of brain diseases.

resveratrol; Angiopep-2; liposomes; cellular uptake;targeting

R283.6

A

0253 - 2670(2022)24 - 7706 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.008

2022-06-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81874347）；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)高層次引進(jìn)人才科研啟動資金資助項(xiàng)目（2100221005）；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2021年博士后啟動資金（21601A2100）

于 洋（1994—），女，講師，研究方向?yàn)樾滦徒o藥系統(tǒng)。Tel: 15764399825 E-mail: yuqn0702@163.com

李學(xué)濤（1979—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾滦徒o藥系統(tǒng)。Tel: (0411)85890145 E-mail: lixuetao1979@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]