復(fù)方銀杏葉制劑中總銀杏酸含量測定方法的優(yōu)化△

鄭云楓，闞宏飛，楊陽，嚴(yán)輝，潘蘇華，郭海英

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

銀杏葉制劑中殘留銀杏酸（ginkgolic acid，GA）的問題一直受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1]，它被認(rèn)為是銀杏葉提取物（EGb）及制劑中的主要有害物質(zhì)，可引起肝損傷、免疫毒性、胚胎毒性及嚴(yán)重的過敏反應(yīng)[2-3]。為了保障銀杏葉制劑使用的安全性，所有EGb及其制劑必須建立相應(yīng)的銀杏酸檢測方法，并嚴(yán)格限定其含量[4-5]。

圖1 銀杏酸結(jié)構(gòu)式

目前，已報道的銀杏酸定量分析法有分光光度法[6]，RP-HPLC[7]，GC-MS[8]及 HPLC-ESI-MS[9]等，其中RP-HPLC被公認(rèn)為是最成熟的一種檢測方法。但由于銀杏酸為一系列的弱極性化合物，包括白果新酸（GA1），白果酸（GA2），十七烷二烯銀杏酸（GA3），氫化白果酸（GA4）以及十七烷一烯銀杏酸（GA5）五種主要成分，且在EGb及其制劑中的含量很低，因此樣品溶液制備能否將總銀杏酸提取完全并達(dá)到定量檢測的要求，是銀杏酸HPLC含量測定的關(guān)鍵。從已報道的文獻(xiàn)看，總銀杏酸測定法中樣品制備方法各不相同，如趙月珍等[10]采用甲醇回流-氯仿萃取法制備銀杏葉及制劑樣品溶液；田紫平等[11]采用石油醚提取法對銀杏葉中銀杏總酚酸進(jìn)行制備；仰榴青等[12]采用正己烷提取-硅膠柱色譜法對銀杏葉總酚酸進(jìn)行了制備處理；而何靜仁[13]在銀杏葉中總酚酸測定時采用了甲醇提取-正己烷萃取法，這些不同的樣品處理方法必然會影響EGb或制劑中銀杏酸含量測定的準(zhǔn)確性。

復(fù)方銀杏葉膠囊是由刺梨（Rosa roxbughii Tratt）與EGb組成的復(fù)方銀杏葉制劑[14]，兩者配伍可以減輕EGb引起的消化道不良反應(yīng)，提高銀杏葉制劑的用藥安全[15]。本研究擬以復(fù)方銀杏葉制劑為對象，首先考察了幾種常用的銀杏酸提取制備方法，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面曲線法進(jìn)一步優(yōu)化了樣品制備過程中提取溶劑類型、溶劑用量、提取時間等參數(shù)，旨在建立準(zhǔn)確、靈敏的總銀杏酸分析方法，為EGb及其制劑中銀杏酸的準(zhǔn)確分析提供參考。

1 儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)（Alliance 2695四元泵，PDA二極管陣列檢測器），Empower色譜工作站；BT-220S電子天平（賽多利斯）；KQ-100DB型數(shù)顯超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；離心機（TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠）；1810-D型自動雙重純水蒸餾器（上海申生科技有限公司）。白果新酸對照品（純度大于 98%，批號：111690-201403），由中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用；總銀杏酸對照品（批號：111594-201304），由中國食品藥品檢定研究院提供，供定位用。復(fù)方銀杏葉膠囊（中試產(chǎn)品，自制，批號：150101）。甲醇、乙腈均為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水；乙醇、正己烷、石油醚、正己烷、冰醋酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-3%HAC水溶液（92∶8）；檢測波長：310 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL·min－1。

2.2 對照品溶液的制備

取白果新酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含5.2μg的溶液，作為對照品溶液；另取總銀杏酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含105μg的溶液，作為定位用對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密稱取白果新酸對照品適量，加甲醇制成濃度為33.20μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，再依次稀釋成16.60、8.40、4.20、2.10、1.05μg·mL－1的系列對照品溶液，按上述色譜條件測定峰面積值，以對照品濃度X（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝20 849X－1669.9，r＝0.999 8，結(jié)果表明白果新酸在1.05～16.60μg·mL－1呈良好的線性關(guān)系。

2.4 檢測限和定量限

以白果新酸測定檢測限和定量限。結(jié)果顯示檢測限（信噪比3∶1）：檢出濃度為 0.35μg·mL－1；定量限（信噪比為10∶l）為1.05μg·mL－1。以該濃度的白果新酸對照品連續(xù)進(jìn)樣5次，RSD為2.28%。

2.5 不同樣品溶液制備方式對制劑中總銀杏酸測定的影響

2.5.1 石油醚提取-甲醇溶解 精密稱取復(fù)方銀杏葉膠囊內(nèi)容物5.0 g，置圓底燒瓶中，加入石油醚（60～90℃）100 mL，稱定重量，回流提取2 h，放冷，補足失重，過濾，精密吸取續(xù)濾液50 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，并定容至2 mL，0.45μm微孔濾膜過濾，即得[11]。

2.5.2 甲醇提取-氯仿萃取 精密稱取復(fù)方銀杏葉膠囊內(nèi)容物5.0 g，置圓底燒瓶中，加入甲醇100 mL，稱定重量，回流提取2 h，放冷，補足失重，過濾，精密吸取續(xù)濾液50 mL，回收溶劑，加水50 mL分散溶解并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用氯仿萃取2次，每次50 mL，合并氯仿液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并定容至2 mL，0.45μm微孔濾膜過濾，即得[10]。

2.5.3 甲醇提取-正己烷萃取 精密稱取復(fù)方銀杏葉膠囊內(nèi)容物5.0 g，置圓底燒瓶中，加入甲醇100 mL，稱定重量，回流提取2 h，放冷，補足失重，過濾，精密吸取續(xù)濾液50 mL，置分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次50 mL，合并正己烷液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并定容至2 mL，0.45μm微孔濾膜過濾，即得[13]。

2.5.4 測定法 精密吸取樣品溶液、對照品溶液及定位對照溶液各20μL，注入液相色譜儀，比較各樣品溶液中與總銀杏酸對照品相應(yīng)色譜峰的峰面積，并依據(jù) 《中華人民共和國藥典》規(guī)定方法，以白果新酸對照品外標(biāo)法計算總銀杏酸含量[16]。見表1及圖2。

結(jié)果顯示，在此色譜條件下總銀杏酸類成分分離度較好，三種銀杏酸制備方法對復(fù)方銀杏葉膠囊中總銀杏酸的含量檢測結(jié)果影響較大，以石油醚提取-甲醇溶解法制備的樣品中，僅能檢測到GA1及GA2，以白果新酸計算該樣品總銀杏酸的含量最低，僅有0.933 mg·kg－1；而以甲醇提取-正己烷萃取法的提取率最高，能夠檢測到與總銀杏酸對照品溶液中GA1～GA5的5個色譜峰，其總銀杏酸含量為2.847 mg·kg－1，明顯高于采用甲醇提取-氯仿萃取法制備的樣品中檢測的含量，提示以甲醇提取結(jié)合正己烷萃取法更適宜于復(fù)方銀杏葉膠囊中總銀杏酸的前處理。

表1 不同樣品溶液制備方法對制劑中總銀杏酸測定結(jié)果影響

圖2 復(fù)方銀杏葉膠囊中銀杏酸HPLC圖

2.6 響應(yīng)面曲線法優(yōu)化總銀杏酸制備方法

為了進(jìn)一步優(yōu)化提取方法，依據(jù)2.5.3項下制備方法，在預(yù)試驗及參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[17]，選擇甲醇濃度（A）、溶劑體積（B）及提取時間（C）為3個主要考察因素，以總銀杏酸（GA1～GA5）含量作為考察指標(biāo)，得到各因素影響趨勢及范圍，進(jìn)而采用Box-Behnken法優(yōu)化總銀杏酸供試品液提取制備方法。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，依據(jù)單因素預(yù)試實驗結(jié)果，各因素設(shè)置3水平進(jìn)行試驗，用－1，0，1表示，共計15個試驗點。因素水平表見表2，結(jié)果見表2。

表2 試驗設(shè)計因素與水平表

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

表中NO.1～12為析因試驗，NO.13～15為中心驗證實驗。運用Design-Expert 8.0.5軟件對各組測定計算的總銀杏酸含量進(jìn)行分析，進(jìn)行二次回歸擬合，得到針對甲醇濃度（A）、溶劑體積（B）及提取時間（C）的多元回歸方程，如下：Y＝2.94＋0.12A＋0.055B＋0.014C－0.064AB－0.039AC－0.005 043BC－0.13A2－0.17B2－0.16C2。

對擬合的模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見下表。本實驗選用的模型P＜0.000 1，具有高度顯著性；而失擬誤差項（P＝0.096 8）不顯著，說明該回歸模型與實驗情況模擬較好，誤差較小。此外模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.969 1，也表明該模型的擬合程度較好，可用于總銀杏酸提取條件的預(yù)測和優(yōu)化分析。由回歸系數(shù)的顯著性水平可知，A（P＜0.000 1），B（P＜0.000 1），AB（P＝0.000 1），AC（P＝0.002 3）極顯著，其它項均不顯著。根據(jù)Box-Behnken擬合模型，顯示甲醇濃度對總銀杏酸的提取效果具有較大影響，提取溶劑體積影響其次，提取時間的影響并不明顯。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

2.7 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

采用Design-Expert 8.0.5軟件，依據(jù)回歸方程繪制不同影響因素對總銀杏酸含量的三維曲線圖，響應(yīng)面分析圖形可較直觀地反映各自變量及其交互作用對響應(yīng)值的影響，見圖3。從圖中可以看出，提取體積固定時，總銀杏酸測得量隨著甲醇濃度的升高先增高后趨于平穩(wěn)；甲醇濃度一定時，評價結(jié)果隨提取體積的增加先升高后降低；提取時間固定時，總銀杏酸測得量隨著甲醇濃度的升高先增高，后趨于平穩(wěn)；甲醇濃度一定時，評價結(jié)果隨提取時間的增加先升高后亦趨于平穩(wěn)。在交互作用分析中，AB（P＝0.000 1）及 AC（P＝0.002 3）均小于0.01，表明甲醇濃度和提取溶劑體積、甲醇濃度和提取時間兩組因素間的交互作用顯著；而BC的P值均大于0.05，顯示提取溶劑體積和提取時間之間的交互作用不顯著。

圖3 提取過程甲醇濃度、溶劑體積、提取時間交互作用及其對總銀杏酸含量影響的響應(yīng)曲面

根據(jù)Design-Expert 8.0.5優(yōu)化所得總銀杏酸樣品溶液制備方法：采用85%甲醇，提取體積為98.76 mL，提取時間為1.8 h，在此條件下預(yù)測總銀杏酸測定量可達(dá)到2.952 mg·kg－1?？紤]到提取過程中實際情況，最終研究樣品溶液制備方法：精密稱取復(fù)方銀杏葉膠囊內(nèi)容物5.0 g，置圓底燒瓶中，加入85%甲醇100 mL，稱定重量，回流提取1.8 h，放冷，補足失重，過濾，精密吸取續(xù)濾液50 mL，置分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次50 mL，合并正己烷液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并定容至2 mL，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。為了驗證響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，以優(yōu)化得到的條件對復(fù)方銀杏葉樣品進(jìn)行3次驗證試驗，結(jié)果顯示，總銀杏酸測得的平均含量為2.916 mg·kg－1，與預(yù)測值相對偏差1.21%，說明確定的制備方法穩(wěn)定可行。

3 討論

銀杏酸類成分極性較小，在銀杏葉提取物中的含量較低，且除銀杏酸外銀杏葉提取物中還有弱極性的黃酮類、聚戊烯醇類等成分，因此EGb及其制劑一般需要預(yù)處理后才能進(jìn)行HPLC分析。本研究中曾參考2015版 《中華人民共和國藥典》銀杏葉提取物項下制備方法[16]，采用甲醇超聲提取后進(jìn)行檢測，但由于制劑中銀杏酸含量較低，以甲醇∶樣品（5∶1）進(jìn)行提取，進(jìn)樣量為20μL時仍無法檢測到樣品中的銀杏酸類成分，提示該方法作為銀杏葉制劑中銀杏酸限度檢測方法并不適宜。

在研究過程中還發(fā)現(xiàn)，以正己烷、石油醚為溶劑提取時，容易造成本品粉末在溶劑中團聚成小塊，從而影響銀杏酸的提取效果，這可能也是造成石油醚提取-甲醇溶解法提取不完全的原因；此外還嘗試過采用硅膠柱色譜法對樣品進(jìn)行處理，但檢測出的總銀杏酸含量相對偏低，推測這與硅膠對銀杏酸產(chǎn)生了一定死吸附有關(guān)。

針對優(yōu)化后的測定方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察。取同一復(fù)方銀杏葉膠囊樣品5份，依法制備樣品，HPLC測定。結(jié)果顯示，復(fù)方銀杏葉膠囊中總銀杏酸含量測定的精密度RSD為1.42%，其中銀杏酸GA1、GA 2及GA 5的RSD＜3.0%，而銀杏酸 GA3及GA 4的RSD相對較大，分別達(dá)4.67%、5.38%，這可能是與它們在總銀杏酸中的相對百分含量較低（＜5%）有關(guān)。在已知含量的復(fù)方銀杏葉樣品中，分別加入不同量銀杏酸對照品進(jìn)行加樣回收試驗，進(jìn)行加樣回收率試驗，測得該方法的平均回收率為97.7%，RSD為2.25%（n＝6）。表明以上樣品溶液的提取和純化方法具有較好的回收率，建立的含量測定方法穩(wěn)定、可行，這可為含銀杏葉提取物制劑中銀杏酸限量檢查提供參考。