羊膜修復(fù)肌腱、韌帶損傷的研究進(jìn)展

張加廷 江濤 張佳 肇剛 魏鈺 安明揚(yáng) 李春寶 劉玉杰*

羊膜是胎盤(pán)的最內(nèi)層，位于胎兒旁邊，由一層厚的基底膜和一層無(wú)血管基質(zhì)組成[1]，每年可以從數(shù)百萬(wàn)新生兒中收集到。研究表明，羊膜含具有分化潛能的干細(xì)胞及血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placental growth factor，PLGF）和粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）等生物活性因子[2]。生物羊膜作為組織工程中的重要成員，在眼科、燒傷整形科、耳鼻喉科等專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域已有大量的研究和臨床應(yīng)用。而其在肌腱損傷修復(fù)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用相對(duì)較少，對(duì)未來(lái)應(yīng)用于肌腱、韌帶損傷的修復(fù)具有巨大的前景。本文就羊膜在肌腱、韌帶損傷修復(fù)方面的相關(guān)研究作一概述。

1 羊膜概述

羊膜（amniotic membrane，AM）是胎盤(pán)的最內(nèi)層，緊鄰胎兒，半透明，厚0.02 ～0.05 mm，為無(wú)血管和血供的組織，由3 層組成。上皮層：由大量微絨毛、代謝旺盛的單層立方體上皮細(xì)胞構(gòu)成；基底層：含有Ⅳ型和Ⅶ型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白和透明質(zhì)酸；無(wú)血管間質(zhì)層：可細(xì)分為3層結(jié)構(gòu)，由內(nèi)到外分別是內(nèi)致密層、具有疏松成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的中間成纖維細(xì)胞層，以及最外層幾乎無(wú)細(xì)胞的海綿層?；|(zhì)主要含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ型膠原[3]。

羊膜上皮細(xì)胞有助于羊水的動(dòng)態(tài)平衡，而細(xì)胞內(nèi)空泡的存在表明有一定的分泌活動(dòng)[4]。羊膜能夠允許水和可溶性化合物的運(yùn)輸，產(chǎn)生生長(zhǎng)因子，如上皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BFGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受體、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）及其受體，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-α，TGF-β1、β2和β3亞型[5]。此外，羊膜還分泌白細(xì)胞介素6和8轉(zhuǎn)化羊水干擾素-c以及血管活性肽，表現(xiàn)出促進(jìn)上皮化、抗纖維化、抗炎抗血管生成和抗微生物侵襲等特征，維持生理濕潤(rùn)微環(huán)境，從而減少水分流失，促進(jìn)傷口愈合[6]。

1.1 抗纖維化和抗炎特性

羊膜的抗纖維化作用是通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)，減少TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3亞型和TGF-βⅡ型受體的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。羊膜的抗炎作用是通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子，如白介素IL-1a、IL-2、IL-8、IL-10、IFN-c、bFGF、腫瘤壞死因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)驅(qū)動(dòng)的[7]。羊膜的這些抗炎和抗纖維化作用也被認(rèn)為是通過(guò)在上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞上的FAS受體介導(dǎo)了相關(guān)細(xì)胞的凋亡表達(dá)[8]。

1.2 抗血管生成特性

羊膜的抗血管生成作用是通過(guò)合成有效的抗血管生成化合物，包括血小板反應(yīng)素-1、內(nèi)皮抑素和金屬蛋白酶抑制劑（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和TIMP-4）。盡管如此，組織工程中羊膜的抗血管生成作用（導(dǎo)致組織缺血）必須與其他潛在益處相平衡考慮[9]。

1.3 抗微生物特性

羊膜和羊水的抗微生物作用歸于羊水中存在桿菌素、β-溶酶、溶菌酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白和7-S免疫球蛋白。此外，羊膜作為一種有效的物理屏障，由于其與傷口表面的緊密黏附，可以防止?jié)撛诘母腥具M(jìn)入修復(fù)組織的內(nèi)部[10]。

1.4 免疫調(diào)節(jié)作用

最初認(rèn)為羊膜細(xì)胞表面沒(méi)有主要的組織相容性抗原HLA-A、HLA-B或HLA-DR，但研究進(jìn)一步表明，羊膜上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞有限表達(dá)HLA-Ia 類(lèi)（HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR）和Ib 類(lèi)（HLA-E、HLA-G）抗原。然而，移植冷凍保存的羊膜并不會(huì)導(dǎo)致免疫排斥。羊膜的這一特點(diǎn)避免了羊膜移植中使用任何免疫抑制劑[11]。

2 羊膜在屈肌腱損傷修復(fù)中的抗粘連作用

肌腱與周?chē)M織粘連是肌腱損傷修復(fù)中最常見(jiàn)的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多采用雞或大鼠，以羊膜覆蓋損傷的屈肌腱，觀(guān)察術(shù)后關(guān)節(jié)活動(dòng)度、組織學(xué)特點(diǎn)、力學(xué)性能等評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究表明羊膜可有效防止損傷肌腱修復(fù)后的組織粘連[12-15]。Liu等[16]利用雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立肌腱鞘缺損模型和Ⅱ區(qū)屈指肌腱模型，通過(guò)大體、組織學(xué)和生物力學(xué)對(duì)比研究，結(jié)果顯示羊膜組炎癥反應(yīng)輕微，周?chē)M織幾乎無(wú)粘連，該研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為羊膜作為腱鞘構(gòu)建中的天然生物替代材料，促進(jìn)內(nèi)源性愈合，能有效抑制外源性愈合和防止肌腱粘連。在另一項(xiàng)臨床研究中，研究者將89 例Ⅱ區(qū)屈肌腱損傷患者，分為對(duì)照組、聚DL-乳酸（PDLLA）組和羊膜組，分別于術(shù)后1、2、3、6、12個(gè)月隨訪(fǎng)，評(píng)價(jià)近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)指間關(guān)節(jié)主動(dòng)屈曲和伸展活動(dòng)，結(jié)果顯示術(shù)后羊膜組較對(duì)照組的屈伸活動(dòng)范圍更好[17]。Lepp?nen 等[18]將手屈肌腱損傷手術(shù)患者的肌腱周?chē)匝蚰ぐ鼑?，術(shù)后6 個(gè)月觀(guān)察患者的手指活動(dòng)范圍，結(jié)果似乎并不理想，認(rèn)為與現(xiàn)有技術(shù)相比，使用同種異體羊膜移植似乎不太可能在臨床上產(chǎn)生預(yù)期的效果，但尚不確定不良結(jié)果是否與技術(shù)因素、同種異體羊膜移植物本身或并發(fā)癥的偶發(fā)性有關(guān)。Ang 等[19]報(bào)道了1例33歲跟腱術(shù)后肌腱周?chē)：墼錾⒃贁嗔训幕颊?，術(shù)中為防止瘢痕形成，在跟腱內(nèi)放置了一半的羊膜移植物，用可吸收縫線(xiàn)固定其余一半的羊膜移植物。術(shù)后隨訪(fǎng)患者疼痛癥狀逐漸消失，并在術(shù)后2 個(gè)月可以穿運(yùn)動(dòng)鞋無(wú)痛行走，但遺憾的是作者并未對(duì)患者康復(fù)后的踝關(guān)節(jié)活動(dòng)度做詳細(xì)的描述。

3 羊膜促進(jìn)急性肌腱損傷愈合

隨著急性跟腱斷裂疾病的增加，每年在10萬(wàn)人中約有18 人發(fā)生跟腱斷裂。跟腱斷裂后手術(shù)治療發(fā)生肌腱纖維化、局部瘢痕粘連及傷口難以愈合等不良反應(yīng)是臨床醫(yī)生不得不面對(duì)的問(wèn)題[20]。McQuilling 等[21]以羊膜包裹縫合好的大鼠跟腱，在第2周、第4周分別進(jìn)行組織學(xué)、免疫學(xué)、生物力學(xué)評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羊膜處理過(guò)的實(shí)驗(yàn)組可以增加細(xì)胞遷移，提高跟腱的機(jī)械性能。該研究通過(guò)免疫熒光證明，在第14天和28天，脫水羊膜包裹處理組中scleraxis（Scx）持續(xù)高表達(dá)，認(rèn)為該因子在肌腱再生與修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。一項(xiàng)以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的急性跟腱損傷的動(dòng)物模型中，同樣顯示人羊膜能夠使跟腱愈合速度加快，炎癥反應(yīng)減輕，成纖維細(xì)胞活性增強(qiáng)[22]。de Girolamo 等[23]選擇羊膜懸液治療膠原酶誘導(dǎo)的跟腱損傷動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)治療組所有肌腱在第28天組織變性均明顯少于對(duì)照組。

Liu等[24]比較了人羊膜和小腸黏膜下層對(duì)兔跟腱損傷修復(fù)的影響，認(rèn)為小腸黏膜下層比人羊膜在跟腱愈合早期能夠更好改善損傷肌腱的生物力學(xué)特性并促進(jìn)新血管形成。但此研究可能存在樣本量不足以及缺乏修復(fù)跟腱的細(xì)胞及膠原定量分析，結(jié)論仍然需要進(jìn)一步研究探討。Coban等[25]的研究通過(guò)對(duì)斷裂的跟腱注射羊水和羊膜，觀(guān)察早期修復(fù)斷裂肌腱的效果，該研究認(rèn)為人羊膜和羊水對(duì)跟腱斷裂早期的愈合過(guò)程沒(méi)有任何影響。

Seo 等[26]在體外環(huán)境下分別將編織絲支架與包裹著羊膜的編織絲支架與肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)，分別在第5、15、30 d采用MTT法測(cè)量?jī)山M支架上細(xì)胞增殖數(shù)量，結(jié)果顯示包裹羊膜組編織絲支架上細(xì)胞數(shù)量明顯多于單純編織絲支架組。Murray等[27]建議理想的肌腱材料應(yīng)在植入后起到早期支撐作用，待宿主肌腱組織再生后能夠被完全吸收。羊膜材料與其他材料組合構(gòu)建組織工程肌腱值得學(xué)者們進(jìn)一步探索。

4 羊膜在慢性腱病中的應(yīng)用

足跟疼痛是一種常見(jiàn)的慢性腱病，據(jù)報(bào)道美國(guó)大約有患者200萬(wàn)人。足底筋膜炎是足跟疼痛最常見(jiàn)的原因之一，可能是由各種軟組織損傷及退變引起。足底筋膜炎和跟腱炎是嚴(yán)重的慢性疼痛疾病，但目前的治療方法有限，組織工程療法為此疾病的治療帶來(lái)了希望。近年來(lái)大量的研究證實(shí)人羊膜含有分化潛力的間充質(zhì)干細(xì)胞及豐富的生物活動(dòng)分子，具有減輕疼痛、降低纖維化、抑制細(xì)菌繁殖和改善局部炎性環(huán)境的能力，成為了治療慢性肌腱疾病的方法之一。Werber[28]使用顆?；蚰ず脱蛩委熥愕捉钅ぱ缀皖B固性跟痛癥，經(jīng)治療患者疼痛癥狀明顯減輕。Gellhorn等[29]通過(guò)超聲引導(dǎo)下注射脫水人羊膜溶液治療慢性肌腱病及關(guān)節(jié)病，通過(guò)對(duì)40 例臨床病例長(zhǎng)達(dá)9 個(gè)月的隨訪(fǎng)觀(guān)察，經(jīng)疼痛評(píng)分和患肢功能平穩(wěn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)治療效果，顯示所有病例盡管注射后可能會(huì)短時(shí)間局部疼痛增加，但是對(duì)羊膜注射后耐受性良好。此外隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)脫水人羊膜注射液可以減輕患處疼痛并改善關(guān)節(jié)功能，止痛藥使用率顯著降低，患者對(duì)該療法的滿(mǎn)意度很高。

5 羊膜細(xì)胞相關(guān)研究

羊膜上皮細(xì)胞位于羊膜最表層，與胎兒直接接觸。一些研究中羊膜上皮細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)具有高度的可塑性及較高的分化能力[30]。事實(shí)上，羊膜上皮細(xì)胞在人和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出低免疫原性和高免疫調(diào)節(jié)活性的特征。2005年Miki等[31]首次發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞具有在外源生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下向全部3 個(gè)胚層分化的能力，從此越來(lái)越多的研究證實(shí)了此假設(shè)。有研究直接證明了人羊膜上皮細(xì)胞與肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)羊膜上皮細(xì)胞向腱細(xì)胞分化[32]。在另一項(xiàng)利用人羊膜上皮細(xì)胞治療早期跟腱損傷的研究中，通過(guò)檢測(cè)人羊膜上皮細(xì)胞在早期部分缺損跟腱中的生物活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)人羊膜上皮細(xì)胞處理的損傷肌腱在28 d內(nèi)其結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能迅速恢復(fù)，與對(duì)照組有顯著差異[33]。移植的羊膜上皮細(xì)胞在宿主肌腱內(nèi)仍然存活，與內(nèi)源性細(xì)胞相互作用?？赡艿臋C(jī)制為人羊膜上皮細(xì)胞通過(guò)分泌調(diào)節(jié)因子抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，激活M2 巨噬細(xì)胞亞群并進(jìn)行早期募集，促進(jìn)血管及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，這一結(jié)論與另外一項(xiàng)研究證明羊膜上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)誘導(dǎo)M1、M2型巨噬細(xì)胞的募集來(lái)促進(jìn)損傷肌腱的修復(fù)相一致[34]。研究還發(fā)現(xiàn)部分原位分化的人羊膜上皮細(xì)胞表現(xiàn)為腱細(xì)胞樣表型。這些研究證明了羊膜細(xì)胞在肌腱損傷治療中的作用。近年來(lái)開(kāi)始興起的對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞與肌腱損傷修復(fù)關(guān)系的研究結(jié)論較為一致，均認(rèn)為羊膜上皮細(xì)胞能夠有效促進(jìn)損傷肌腱的再生與修復(fù)[35]。還有一部分研究證明羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具有分化能力并能夠在肌腱修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[36]。

6 羊膜的免疫調(diào)節(jié)作用

羊膜是胎盤(pán)最里面的一層，其免疫調(diào)節(jié)特性已經(jīng)在眼科、皮膚再生、口腔黏膜修復(fù)等方面取得了較為成熟的成果。Hortensius等[37]以羊膜和膠原為材料制成復(fù)合支架，與腱細(xì)胞共培養(yǎng)，在炎性相關(guān)因子作用下，含有羊膜材料的支架中的腱細(xì)胞活性高于其他實(shí)驗(yàn)組，證明了羊膜抑制炎性反應(yīng)并促進(jìn)腱細(xì)胞活性。有研究認(rèn)為，羊膜的免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)源于羊膜上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，將羊膜培養(yǎng)液應(yīng)用于治療馬的肌腱和韌帶損傷取得了滿(mǎn)意的療效[38]。該研究認(rèn)為從馬羊膜細(xì)胞培養(yǎng)液中提取的細(xì)胞外基質(zhì)在體外發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)肌腱損傷的愈合，此作用是通過(guò)細(xì)胞釋放的生物活性因子發(fā)揮的，從而為我們提供了一種無(wú)細(xì)胞性肌腱損傷修復(fù)治療的方法。雖然這種無(wú)細(xì)胞治療應(yīng)用前景廣闊，但進(jìn)一步了解羊膜中起關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子及其作用機(jī)制，如何更加安全的應(yīng)用于臨床治療，仍需要進(jìn)一步的研究和探索。

7 討論

人羊膜作為肌腱、韌帶損傷修復(fù)新的組織工程材料，具有容易獲得、成本低廉、生物活性高、生物相容性及機(jī)械性能好的先天優(yōu)勢(shì)。目前，羊膜在肌腱損傷治療中的應(yīng)用形式有脫細(xì)胞羊膜、脫水羊膜、羊膜基質(zhì)注射液、羊膜上皮細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體懸液等，近年來(lái)的研究表明，羊膜在促進(jìn)肌腱愈合、減輕肌腱粘連、改善損傷肌腱微環(huán)境等方面有著較為理想的效果。但羊膜的作用機(jī)制及其相關(guān)影響因素仍不完全明確，羊膜在很多運(yùn)動(dòng)相關(guān)疾病中的應(yīng)用值得進(jìn)一步研究與探索。另外，臨床缺乏成熟可用的運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域羊膜組織工程的產(chǎn)品，需要研究者不斷深化研究?jī)?nèi)容，完善應(yīng)用條件，充實(shí)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)具有顯著療效優(yōu)勢(shì)且安全可靠的醫(yī)療產(chǎn)品。總之，羊膜為肌腱與韌帶相關(guān)損傷的治療提供了新的思路。