炒火麻仁飲片標準湯劑特征圖譜及有效成分的定量檢測

史紫娟，林碧珊，陳錦霞，劉勇，高永堅，區(qū)淑蘊，曾杉

國藥集團 廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

火麻仁又名大麻仁、麻子仁、線麻子、大麻子等，為桑科1 年生草本植物大麻Cannabis sativaL.的干燥成熟果實或成熟去殼的種子。炒火麻仁為火麻仁清炒后的炮制品，具有潤腸燥、滋陰血之功效［1］。炒火麻仁的主要活性成分有脂肪油、生物堿等。脂肪油為其主要藥效成分之一，包含飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸及其酯類等，具有降血壓、利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓形成的功效［2］。炒火麻仁中含有的主要生物堿成分為胡蘆巴堿，是一種廣泛分布的季銨鹽生物堿?，F(xiàn)代藥理學研究表明，胡蘆巴堿具有抗腫瘤、降低膽固醇及降血糖等藥理活性［3］，被視為炒火麻仁的特征性指標成分。關于炒火麻仁的成分含量測定的文獻報道不多，現(xiàn)有文獻只針對火麻仁中的脂肪酸或胡蘆巴堿進行單方面研究［4-5］，但由于樣品前處理復雜和高溫下易發(fā)生雙鍵異構化而難以準確測定等原因，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版尚未建立炒火麻仁的含量測定指標。

中藥飲片標準湯劑是在中醫(yī)理論指導下以臨床實際應用為參考，使用現(xiàn)代中藥提取方法并通過標準化工藝規(guī)程制備而成的單味中藥飲片水煎液，是中藥配方顆粒生產工藝和質量的“基準”［6］。本研究制備了20 批炒火麻仁飲片標準湯劑，考察了炒火麻仁飲片標準湯劑的出膏率、總脂肪酸和葫蘆巴堿含量及轉移率，并進行特征圖譜相似度研究，為炒火麻仁配方顆粒的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；MS105DU 型十萬分之一天平、AL104 型萬分之一天平、PL203 型千分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FTS-40F 型陶瓷保健壺（潮州市一壺百飲電器實業(yè)有限公司）；TRL-0.5 型真空冷凍干燥機（大連雙瑞科技有限公司）；Synergy UV型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品α-亞麻酸（批號：111631-201605，純度：99.8%）、亞油酸（批號：111622-201203，純度：99.1%）、鳥苷（批號：111977-201501，純度：93.6%）、胡蘆巴堿（批號：110883-201604，純度：78.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇和乙腈；色譜純冰乙酸和十二烷基磺酸鈉（Aladdin公司）；石油醚為分析純；水為超純水。

1.3 樣品

20 批火麻仁藥材分別產自山西、河南、陜西、甘肅等地，經江陰天江藥業(yè)有限公司唐波研究員鑒定為?？浦参锎舐镃annabis sativaL.的干燥成熟果實，按《中國藥典》2020 年版標準檢驗全部合格，參考《中國藥典》2020 年版火麻仁項下炮制方法制成炒火麻仁飲片［1］，具體炮制方法：除去雜質和果皮，文火清炒至微黃。依據(jù)“逢籽必破”原則，用中藥飲片機將炒火麻仁飲片打碎至全部通過10 目篩。20批飲片信息見表1。

表1 20批炒火麻仁飲片信息

2 方法與結果

2.1 炒火麻仁飲片標準湯劑的制備

取炒火麻仁飲片100 g，加入8倍量水浸泡30 min，煎煮30 min，趁熱濾過，藥渣再加入6 倍量水，煎煮25 min，濾過，合并濾液。減壓濃縮至約200 g的浸膏，即得炒火麻仁飲片標準湯劑。浸膏加水稀釋至固含率約為15%，再進行冷凍干燥，即得炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉。

2.2 炒火麻仁飲片和標準湯劑中有效成分的定量測定

《中國藥典》2020 年版火麻仁藥材、飲片及炒火麻仁飲片均沒有相應的含量測定項，本研究參考文獻[7-8]，采用油重法測定炒火麻仁飲片和標準湯劑中總脂肪的含量。另參照《中國藥典》2020 年版（一部）胡蘆巴項下胡蘆巴堿含量測定色譜條件建立了炒火麻仁飲片和標準湯劑中胡蘆巴堿的含量測定方法，為制定炒火麻仁配方顆粒的質量控制標準提供參考［1］。

2.2.1 總脂肪含量測定

2.2.1.1 飲片供試品的制備 稱取打碎后炒火麻仁飲片（過二號篩）約2.0 g，移入濾紙筒內，將濾紙筒放入索氏提取器的抽提筒內，由提取器冷凝管上端加入石油醚至接收瓶內容積的1/2處，于水浴上加熱，使石油醚不斷回流抽提至6 h。將抽提液減壓濃縮，分別轉移至蒸發(fā)皿，置水浴鍋上蒸干，再于100 ℃烘箱中干燥1 h，于干燥器內冷卻0.5 h 后稱質量，蒸發(fā)皿增加的質量即為總脂肪質量。

2.2.1.2 標準湯劑供試品的制備 取炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉約1.0 g，以下與2.2.1.1 項下“移入濾紙筒內”后操作相同，蒸發(fā)皿增加的質量即為總脂肪質量。

2.2.1.3 標準湯劑總脂肪含量平行樣驗證 取同一批炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉，平行3 份，按2.2.1.2項下方法制備供試品，測定總脂肪含量。結果3 批標準湯劑的總脂肪質量分數(shù)分別為32.08%、32.75%、31.89%，均值為32.24%，RSD為1.40%。結果表明，同一批炒火麻仁飲片標準湯劑平行樣總脂肪含量的RSD＜2%，表明各平行樣間差異較小，標準湯劑制備工藝可靠，總脂肪含量測定方法穩(wěn)定。

2.2.2 胡蘆巴堿含量測定

2.2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以甲醇-0.05%十二烷基磺酸鈉溶液-冰乙酸（20.0∶80.0∶0.1）為流動相，檢測波長為265 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.30 mL·min-1，進樣量為1 μL，理論板數(shù)按胡蘆巴堿峰計算應不低于4000。

2.2.2.2 對照品溶液的制備 取胡蘆巴堿對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成質量濃度為20 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2.3 飲片供試品溶液的制備 取炒火麻仁飲片粉末（過二號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.4 標準湯劑供試品溶液的制備 取本品凍干粉約0.2 g，精密稱定，以下與2.2.2.3 項下“置具塞錐形瓶中”后相同操作，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.5 方法學考察 線性關系考察：精密稱取胡蘆巴堿對照品12.23 mg，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，作為對照品儲備溶液。分別精密量取上述儲備液，稀釋成質量濃度為0.006 1、0.012 2、0.024 5、0.048 9、0.097 8、0.122 3 mg·mL-1的對照溶液，按2.2.2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積。以胡蘆巴堿峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，回歸方程：Y=168.35X+0.012 3（r=1.000 0），表明質量濃度為0.006 1～0.122 3 mg·mL-1時與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取胡蘆巴堿對照品溶液，按2.2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，計算胡蘆巴堿峰面積的RSD為0.4%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉約0.2 g，精密稱定，按2.2.2.4 項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液，按2.2.2.1 項下色譜條件，分別在0、2、6、12、24 h進樣，計算胡蘆巴堿峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取同一批炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉約0.2 g，精密稱定，按2.2.2.4 項下方法平行制備6 份供試品溶液，精密吸取供試品溶液，按2.2.2.1項下色譜條件測定，計算供試品溶液中胡蘆巴堿含量的RSD為0.8%，表明該方法重復性良好。

加樣回收率試驗：取同一批已知含量的炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉約0.1 g，平行稱取6 份，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別按1∶1 加入胡蘆巴堿對照品溶液，按2.2.2.4 項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液，按2.2.2.1 項下色譜條件測定，計算胡蘆巴堿平均回收率和RSD，結果胡蘆巴堿的平均回收率為97.7%，RSD 為0.3%，表明該方法回收率良好。

2.2.2.6 炒火麻仁飲片標準湯劑出膏率測定 將20批炒火麻仁飲片制備成標準湯劑，取標準湯劑約10 g，置質量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，再放置105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于干燥器中放冷30 min，測定干固物并按公式（1）計算出膏率。結果見表2。結果表明，20 批炒火麻仁飲片標準湯劑出膏率為15.55%～22.04%，均值為18.80%。

2.2.2.7 炒火麻仁飲片和標準湯劑樣品測定 根據(jù)已建立的含量測定方法對20批炒火麻仁飲片及其標準湯劑進行定量測定并按公式（2）、（3）計算轉移率，結果見表2。

表2 炒火麻仁飲片及標準湯劑測定結果

結果表明，20 批炒火麻仁飲片總脂肪質量分數(shù)為37.98%～53.88%，均值為48.58%，；20 批炒火麻仁飲片標準湯劑總脂肪質量分數(shù)為16.38%～36.76%，均值為26.15%；20批炒火麻仁飲片標準湯劑總脂肪含量轉移率為5.61%～17.33%，均值為10.87%。

20 批炒火麻仁飲片中胡蘆巴堿質量分數(shù)為0.057%～0.119%，均值為0.074%；20批炒火麻仁飲片標準湯劑胡蘆巴堿質量分數(shù)為0.234%～0.460%，均值為0.336%；20批炒火麻仁飲片標準湯劑胡蘆巴堿含量轉移率為83.93%～98.72%，均值為91.11%。

2.3 超高效液相色譜法（UPLC）特征圖譜研究

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～6 min，2%～12%A；6～14 min，12%～40%A；14～16 min，40%～80%A；16～21 min，80%A；21～24 min，80%～100%A；24～26 min，100%A）；流速為0.30 mL·min-1；檢測波長為205 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為1 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別取對照品α-亞麻酸和亞油酸適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為10 μg·mL-1的溶液；取鳥苷對照品適量，精密稱定，加水制成質量濃度為20 μg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，稱定質量，超聲（500 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 對照品指認 精密吸取2.3.2 項下對照品溶液和2.3.3 項下供試品溶液各1 μL，進樣測定，記錄色譜圖，結果見圖1。

圖1 對照品及炒火麻仁飲片標準湯劑的UPLC圖

結果表明，在炒火麻仁飲片標準湯劑特征圖譜中，分別呈現(xiàn)與鳥苷（峰1）、α-亞麻酸（峰5）和亞油酸（峰6）保留時間一致的特征峰。

2.3.5 特征圖譜方法學考察 精密度試驗：取同一份炒火麻仁飲片標準湯劑供試品溶液，按照2.3.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，并以α-亞麻酸峰（峰5）為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結果其RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一份炒火麻仁飲片標準湯劑供試品溶液，分別在0、2、4、8、10、12、16、20、24 h按2.3.1項下色譜條件進樣測定，以α-亞麻酸峰（峰5）為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結果其RSD 均小于2%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉，按2.3.3 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按照2.3.1 項下色譜條件進樣測定，以α-亞麻酸峰（峰5）為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結果其RSD 均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.4 特征圖譜樣品檢測與分析

取20 批炒火麻仁飲片標準湯劑凍干粉，按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將20 批樣品色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）軟件中進行色譜峰匹配及相似度分析，選擇峰面積穩(wěn)定的色譜峰作為共有峰，最終確定6 個共有峰。20 批炒火麻仁飲片標準湯劑的特征圖譜見圖2，對照特征圖譜見圖3，相似度結果見表3。結果顯示，20 批炒火麻仁飲片標準湯劑特征圖譜與對照特征圖譜之間的相似度均在0.90 以上，表明各批次炒火麻仁飲片標準湯劑具有較好的一致性。

表3 20批炒火麻仁飲片標準湯劑特征圖譜相似度結果

圖2 20批炒火麻仁飲片標準湯劑UPLC特征圖譜

圖3 炒火麻仁飲片標準湯劑對照特征圖譜

3 討論

3.1 標準湯劑制備工藝的合理性

本研究選取20 批合格的炒火麻仁飲片，參照《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》［9］和《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》［10］的煎煮方法，以水為提取溶劑，煎煮2 次，經固液分離、低溫減壓濃縮、冷凍干燥后制得樣品。炒火麻仁以果實入藥，為瀉下藥，不屬于清熱、滋補類藥。所以炒火麻仁飲片標準湯劑一煎煮沸后再煎煮30 min，二煎時間適當縮短為25 min。本研究考察了過濾方式及不同目數(shù)篩網的過濾效果，水煎液直接過篩時，會殘留較多油脂在篩網上。因此，通過先將水煎液油層吸取出來，再將剩余水煎液過篩的方式，可以盡量收集水煎液中的油脂。通過對200目和350目篩網的比較發(fā)現(xiàn)，兩者濾液中均無明顯可見固體雜質，為了提高過濾效率，選擇了200 目篩網進行固液分離。同時通過比較不同濃縮溫度下炒火麻仁飲片標準湯劑的密度、出膏率及濃縮液狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在65 ℃減壓條件下進行濃縮時，濃縮液可正常起泡蒸發(fā)，終密度為1.00～1.02 g·mL-1，為了保證標準湯劑質量的穩(wěn)定性，最終采用65 ℃減壓進行濃縮。

3.2 特征圖譜方法的考察

通過二極管陣列檢測器對炒火麻仁飲片標準湯劑中特征圖譜色譜峰信號進行全波長（190～400 nm）掃描，再結合炒火麻仁飲片中油脂類成分，如亞油酸、α-亞麻酸等分子結構中僅含有非共軛雙鍵，因此只有末端吸收，全波長掃描結果也顯示，炒火麻仁飲片標準湯劑在205 nm 附近具有較強吸收，因此選擇205 nm 作為特征圖譜的檢測波長。流動相考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-水3 種不同體系，標準湯劑供試品溶液在乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-水流動相體系中基線漂移較大，在乙腈-水體系中特征峰個數(shù)、響應值及基線平穩(wěn)程度均較優(yōu)，因此采用乙腈-水作為炒火麻仁飲片標準湯劑特征圖譜的流動相體系。考察了30、35、40 ℃柱溫的差異，結果在柱溫35 ℃時火麻仁標準湯劑主要色譜峰的分離度更好。

供試品溶液制備方法時考察了無水乙醇、甲醇、50%乙醇水溶液和水4 種溶劑對炒火麻仁飲片標準湯劑的提取效率，結果50%甲醇提取的峰個數(shù)最多，提取效率最高；同時比較了超聲提取和回流提取2種方式對提取效率的影響，結果2 種提取方式差異不大，從操作方便考慮，選擇超聲提取。

3.3 有效成分檢測方法的建立

參考文獻[11]中關于火麻仁飲片中胡蘆巴堿的研究采用的是高效液相色譜法（HPLC），樣品處理過程復雜，且對色譜柱的要求較高?？紤]到色譜柱的通用性和普及性，本研究選用了C18反向鍵合色譜柱，簡化了樣品的處理過程，并且隨著儀器的普及和檢測器的多樣化，UPLC 以其高效、快速、靈敏、節(jié)省溶劑等優(yōu)點，在中藥指紋圖譜和有效成分的分析上占據(jù)明顯優(yōu)勢［12］。本研究采用UPLC 技術，建立了炒火麻仁飲片和標準湯劑中胡蘆巴堿的含量測定方法，該法簡便、易行，可有效測定炒火麻仁飲片中胡蘆巴堿的含量。

4 結論

20 批炒火麻仁飲片標準湯劑的特征圖譜，通過擬合共確定了6 個特征峰，并通過對照品指認了鳥苷、α-亞麻酸和亞油酸3 個成分，將多批結果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）進行計算，結果20 批炒火麻仁飲片標準湯劑樣品的特征圖譜相似度均高于0.90，表明該方法簡便準確、重復性好，可用于炒火麻仁飲片標準湯劑的質量控制。

本研究根據(jù)《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》［9］中相關規(guī)定，確定了炒火麻仁飲片標準湯劑制備的相應工藝參數(shù)，制備了20 批不同產地的炒火麻仁飲片標準湯劑，并從指標性成分的定量檢測及其出膏率、轉移率和特征圖譜等方面進行了系統(tǒng)研究，建立的指標性成分的定量檢測方法和特征圖譜方法可同時用于炒火麻仁飲片和標準湯劑的檢測，研究結果可為炒火麻仁飲片標準湯劑和配方顆粒的制備及質量控制研究提供參考，從而提高產品質量控制水平。