基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)的四妙勇安湯治療糖尿病足潰瘍機(jī)制分析與驗(yàn)證

吳奇，高兆佐，王彬

1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250000；2廣饒縣中醫(yī)院內(nèi)分泌科；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院周圍血管科

國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）2021年發(fā)布的第十版全球糖尿病地圖顯示，全球20～79歲的成人中約有5.37億人患有糖尿病（DM），預(yù)計(jì)到2045年將上升至7.83億。糖尿病足潰瘍（DFU）是DM患者最常見的并發(fā)癥之一，也是造成DM患者截肢甚至死亡的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，DFU患者在高位截肢后第12個(gè)月的病死率可達(dá)16.7%，第5年的病死率超過(guò)50%，DFU造成的病死率甚至高于部分癌癥［1-2］。四妙勇安湯最早出現(xiàn)在《華佗神醫(yī)秘傳》，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草4味藥組成，具有滋陰活血、清熱解毒的功效，是治療“脫疽”的經(jīng)典方?，F(xiàn)代藥理研究顯示，四妙勇安湯具有抗炎、抗凝血、改善血液流變學(xué)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用［3-5］。臨床研究表明，四妙勇安湯對(duì)DFU的治療效果顯著，但具體作用機(jī)制尚不明確。2022年2月—6月，本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上篩選出四妙勇安湯的主要藥物成分及關(guān)鍵靶基因，并與疾病靶點(diǎn)交集后，確定白細(xì)胞介素6（IL-6）為核心靶點(diǎn)，通過(guò)分子對(duì)接的方法檢測(cè)四妙勇安湯的核心活性成分與IL-6的結(jié)合程度，并進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為臨床上采用四妙勇安湯治療DFU提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇7～8周齡雄性Wistar大鼠10只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可號(hào)：SCXK（魯）2019-0003。細(xì)胞：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。藥物：四妙勇安湯（金銀花90 g、玄參90 g、當(dāng)歸60 g、甘草30 g）飲片購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海東洋紡生物科技有限公司，IL-6、GAPDH引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，ELISA試劑盒購(gòu)自杭州多科生物科技有限公司。

1.2 四妙勇安湯治療DFU的核心靶點(diǎn)分析

1.2.1 四妙勇安湯的有效成分及其作用靶點(diǎn)篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）中，按口服生物利用度（OB）≥30、類藥性（DL）≥0.18檢索四妙勇安湯相關(guān)藥物的有效成分及作用靶點(diǎn)，利用Universal Protein數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.2 藥物—疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取以“Diabetic foot ulcer”為關(guān)鍵詞，從比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（CTD）中搜索與DFU相關(guān)的靶點(diǎn)，篩選條件為：in?ference score≥10。將四妙勇安湯的作用靶點(diǎn)與DFU疾病靶點(diǎn)在韋恩圖繪制平臺(tái)Venny2.1（https：//bio?infogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，確定關(guān)鍵靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.2.3 藥物—疾病核心靶點(diǎn)篩選及通路富集分析在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）中輸入四妙勇安湯治療DFU的關(guān)鍵靶點(diǎn)，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。將相互連接的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，根據(jù)自由度（Degree）篩選出排名前十的核心靶點(diǎn)，Degree值越高表示該節(jié)點(diǎn)所代表的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越高。將前十位的核心靶點(diǎn)輸入Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)（https：//metascape.org/），運(yùn)用京都基因與基因組百科全書（KEGG），以P<0.01為條件，對(duì)核心靶點(diǎn)的通路進(jìn)行富集分析，繪制氣泡圖。

1.2.4 四妙勇安湯的藥物活性成分分析使用Cytoscape3.7.1創(chuàng)建藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)圖，圖中節(jié)點(diǎn)（Node）之間通過(guò)邊（Edge）來(lái)連接，根據(jù)Degree值的大小篩選出藥物活性成分，選擇排名前四的核心活性成分進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.5 四妙勇安湯核心活性成分與疾病核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（Pub?Chem）中下載排名前四的核心活性成分的三維結(jié)構(gòu)，并保存為sdf格式；導(dǎo)入到chemdraw3D軟件中，利用MM2模塊進(jìn)行能量最小化，獲得能量較低的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象，并保存為MOl2文件。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）中下載疾病核心靶點(diǎn)IL-6蛋白的三維結(jié)構(gòu)，其蛋白質(zhì)PDB的ID為1ALU。利用Pymol對(duì)IL-6蛋白進(jìn)行可視化，利用Mgtools1.5.6進(jìn)行加氫，計(jì)算電荷，合并非極性氫等前處理后，將配體和受體保存為pdbqt文件。使用Autodock vina1.1.2軟件將配體與受體進(jìn)行分子對(duì)接，取最優(yōu)勢(shì)構(gòu)象，利用PYMOL和Discovery Studio進(jìn)行可視化分析。當(dāng)分值（結(jié)合能）≤-5.0 kcal/mol表明化合物小分子與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合能力。

1.3 四妙勇安湯治療DFU機(jī)制的細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 含藥血清和空白血清的制備取10只大鼠，分為兩部分，每部分5只。四妙勇安湯由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草組成，比例為3∶3∶2∶1，按照大鼠體表面積換算公式進(jìn)行換算，兩部分大鼠分別給予四妙勇安湯、雙蒸水28 g/（kg·d）灌胃［6］，共7 d；末次灌胃后2 h，使用異氟烷進(jìn)行麻醉，心臟取血后分離收集含藥血清和空白血清。

1.3.2 細(xì)胞分組處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，以2×105/孔接種于12孔板，使用F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液。將HUVEC分為低、中、高劑量組和空白對(duì)照組，分別加入5%含藥血清+95%空白血清、10%含藥血清+90%空白血清、20%含藥血清+80%空白血清、100%空白血清，每孔100 μL。將各組細(xì)胞置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃條件下孵育24 h。

1.3.3 細(xì)胞中疾病核心靶點(diǎn)IL-6 mRNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，使用紫外分光光度儀測(cè)定RNA的濃度和純度。按照說(shuō)明書合成cDNA，使用Ultra SYBR Mix?ture PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。IL-6上游引物5'-CAATGAGGAGACTTGCCTGGT-3'，下 游 引 物5'-GCAGGAACTGGATCAGGACT-3'；GAPDH上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。采 用2-ΔΔCt法 計(jì) 算IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞上清液中疾病核心靶點(diǎn)IL-6蛋白檢測(cè)采用ELISA法。取各組處理后的細(xì)胞，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IL-6蛋白表達(dá)，通過(guò)微板讀數(shù)器測(cè)量雙波長(zhǎng)（450、630 nm）下的吸光度（OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-6蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graph Pad Prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用S-W正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四妙勇安湯的有效成分及其作用靶點(diǎn)分析結(jié)果在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草的有效成分分別為23、9、2、93個(gè)，剔除重復(fù)成分后，共獲得120個(gè)有效成分。確定金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草的作用靶點(diǎn)分別為126、55、64、125個(gè)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后，共獲得208個(gè)作用靶點(diǎn)。見OSID碼圖1。

2.2 藥物—疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)分析結(jié)果共獲得501個(gè)疾病靶點(diǎn)，與四妙勇安湯的208個(gè)作用靶點(diǎn)取交集，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)81個(gè)。見OSID碼圖2。

2.3 藥物—疾病核心靶點(diǎn)篩選及其通路分析結(jié)果PPI網(wǎng)絡(luò)圖共包含206個(gè)節(jié)點(diǎn)、778條邊（OSID碼圖3）。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，Degree值排名前十的核心靶點(diǎn)分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫 瘤 壞 死 因 子（TNF）、IL-6、p53基 因（TP53）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、缺氧誘導(dǎo)因子1亞基α（HIF1A）。KEGG通路富集結(jié)果顯示共富集到81條相關(guān)通路，其中19條與DFU的發(fā)生關(guān)系密切。核心靶點(diǎn)AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1β、JUN、CASP3、PTGS2、STAT3、HIF1A分別涉及15、14、13、10、10、8、7、5、5、2條DFU相關(guān)通路，見表1；其中IL-6在相關(guān)通路富集中排名靠前，在參與多項(xiàng)炎癥通路的同時(shí)也參與了血管病變、神經(jīng)病變、感染等重要通路，選擇IL-6作為核心靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究靶點(diǎn)。

表1 DFU的主要相關(guān)通路

2.4 四妙勇安湯的藥物活性成分分析結(jié)果藥物—成分—靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)圖見OSID碼圖4。四妙勇安湯共102個(gè)藥物活性成分，MOL000098（五羥黃酮）、MOL000422（山柰酚）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL004328（柚皮素）是四妙勇安湯排名前四的核心活性成分，分別對(duì)應(yīng)101、42、32、17個(gè)活性靶點(diǎn)。

2.5 四妙勇安湯核心活性成分與IL-6的分子對(duì)接分析結(jié)果五羥黃酮能夠與IL-6的ASP34、ARG30和LEU33氨基酸形成3個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，其距離分別為2.9、4.0和3.0；五羥黃酮的疏水官能團(tuán)能夠與IL-6的GLN175和LEU178氨基酸形成疏水相互作用，結(jié)合能為-6.2 kcal/mol。山柰酚能夠與IL-6的LEU33、ASP34和ARG179氨基酸形成4個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，其距離分別為2.9、2.9、3.3和3.4；山柰酚的疏水官能團(tuán)能夠與IL-6的GLN175和LEU178氨基酸形成疏水相互作用，結(jié)合能為-6.2 kcal/mol。β-谷甾醇能夠與IL-6的ARG182氨基酸形成穩(wěn)定的氫鍵，其距離為2.9；β-谷甾醇的疏水官能團(tuán)能夠與IL-6的ARG30、LEU33、ILE36、GLN175、和LYS171氨基酸形成疏水相互作用，結(jié)合能為-6.5 kcal/mol。柚皮素能夠與IL-6的ASP34和ARG30氨基酸形成2個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，其距離分別為2.8和3.9；柚皮素的疏水官能團(tuán)能夠與IL-6的GLN175和LEU33氨基酸形成疏水相互作用，結(jié)合能為-6.4 kcal/mol。見OSID碼圖5。

2.6 各組細(xì)胞IL-6 mRNA及上清液IL-6蛋白表達(dá)比較與空白對(duì)照組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞IL-6 mRNA及上清液IL-6蛋白表達(dá)均降低，以高劑量組降低最明顯（P均<0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞IL-6 mRNA及上清液IL-6蛋白表達(dá)比較（-x±s）

3 討論

研究表明，DFU的發(fā)生發(fā)展均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，因此抗炎已成為治療DFU的新方向。本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1β、HIF1A、PTGS2、CASP3、TNF、AKT1均與DFU的發(fā)生有著重要聯(lián)系。對(duì)上述核心靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集，得到的81條信號(hào)通路中包含炎癥通路、神經(jīng)通路、感染通路、糖尿病并發(fā)癥等多條與DFU密切相關(guān)的通路。值得關(guān)注的是，多條DFU相關(guān)通路中均有IL-6的參與，這表明IL-6異常表達(dá)是導(dǎo)致DFU的關(guān)鍵因素。IL-6是體內(nèi)重要的炎癥因子，在自身或外在因素的刺激下由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生并分泌，是炎癥風(fēng)暴級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)及標(biāo)志，會(huì)誘導(dǎo)促進(jìn)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞的聚集和分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的活性，促使炎癥細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，導(dǎo)致組織損傷潰瘍面加重，延長(zhǎng)創(chuàng)面愈合時(shí)間。因此，阻斷IL-6的合成及釋放能有效減輕炎癥損害的發(fā)生和發(fā)展［7-9］。

四妙勇安湯具有清熱解毒、涼血散瘀之效，是治療DFU的常用方劑，在臨床上療效顯著。本研究分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯中多個(gè)有效成分對(duì)DFU有治療作用，其中五羥黃酮、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素是活性較強(qiáng)的核心成分。以往研究顯示，β-谷甾醇具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抑制炎癥等多種生物活性作用，可提高白細(xì)胞介素10的活性，減少TNF-α及白細(xì)胞介素1等炎癥因子分泌。此外，β-谷甾醇還具有較好的降脂作用，可降低機(jī)體對(duì)膽固醇的吸收，有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，改善局部血運(yùn)，有利于創(chuàng)面的愈合［10-11］。山奈酚可顯著改善小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的葡萄糖吸收能力，其原因可能與該成分能改善胰島素敏感性、抑制醛糖還原酶途徑及抗炎抗氧化有關(guān)，因此能有效抑制DFU的發(fā)生與發(fā)展［12］。此外，柚皮素、五羥黃酮均具有顯著的抗炎作用，其中五羥黃酮可以下調(diào)TNF-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）表達(dá)，拮抗IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥和凋亡，而柚皮素具有抗氧化的作用［13-15］。

本研究使用分子對(duì)接技術(shù)將上述4個(gè)核心成分與IL-6進(jìn)行對(duì)接，結(jié)合能均<-5 kcal/mol，表明這些小分子化合物與IL-6具有良好的結(jié)合活性，對(duì)其起調(diào)控作用。為了進(jìn)一步探討四妙勇安湯對(duì)IL-6的調(diào)控作用，我們?cè)贖UVEC中進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；結(jié)果顯示隨著四妙勇安湯含藥血清濃度的升高，HUVEC中IL-6 mRNA及上清液IL-6蛋白表達(dá)逐漸下降，以高劑量組下降最明顯，推測(cè)四妙勇安湯通過(guò)抑制IL-6表達(dá)從而對(duì)DFU發(fā)揮治療作用。值得關(guān)注的是，在四妙勇安湯對(duì)DFU的治療作用中，發(fā)揮主要作用的是β-谷甾醇、山奈酚、柚皮素和五羥黃酮，這為今后相關(guān)藥物單體的研究提供了依據(jù)。不足的是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一項(xiàng)多靶點(diǎn)、多途徑的研究，盡管我們篩查了主要核心靶點(diǎn)為IL-6，并指出四妙勇安湯對(duì)DFU的治療與IL-6關(guān)系密切，但藥物與靶點(diǎn)之間關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外，IL-6是一種全身性的炎癥因子，盡管有研究表明IL-6會(huì)導(dǎo)致微循環(huán)局部栓塞，造成組織缺血壞死，但是IL-6對(duì)病發(fā)處相關(guān)因子的影響尚不明了。因此，明確IL-6與DFU發(fā)生的具體作用機(jī)制，探討IL-6異常改變的上游機(jī)制，闡述核心靶點(diǎn)與疾病之間的因果關(guān)系是未來(lái)工作的重點(diǎn)內(nèi)容。