半枝蓮多糖SBP-2A對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞增殖的抑制作用*

付 楊 許曉義 宋高臣

牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011

21世紀(jì)，隨著醫(yī)療事業(yè)的進(jìn)步，人均預(yù)期壽命不斷增加。同時(shí)，惡性腫瘤正逐漸成為常見(jiàn)惡性疾病，癌癥這一世界性健康問(wèn)題已成為每個(gè)國(guó)家人均預(yù)期壽命增加的最大障礙，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。2020年全球新發(fā)癌癥19 292 789例，死亡癌癥9 958 133例[1]。其中全球肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)新發(fā)病例90.5萬(wàn)例，死亡病例83萬(wàn)例，占癌癥發(fā)病和死亡總數(shù)的4.7%和8.3%，我國(guó)占新發(fā)病例的40%以上，且有上升趨勢(shì)[2]。半枝蓮(ScutellariabarbataD.Don)為唇形科黃芩屬多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)境內(nèi)，含多種維生素、微量元素及氨基酸等成分。半枝蓮可全草入藥，味苦、辛、酸，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒、活血祛瘀、利尿消腫止痛的功效。半枝蓮是癌癥治療中常用的清熱解毒中藥，半枝蓮多糖是從半枝蓮全植物中提取的有效成分，很多藥理實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)半枝蓮多糖具有抗肝癌[3]的作用。但以上研究多是基于半枝蓮所提取的粗多糖水平來(lái)探索抗肝癌作用及機(jī)制的，這對(duì)于半枝蓮多糖作為抗肝癌藥物的開(kāi)發(fā)尚欠缺一定的藥學(xué)理論支持，缺乏說(shuō)服力。本課題組采用水提醇沉法、除蛋白、脫色等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)半枝蓮進(jìn)行分離純化得到半枝蓮多糖組分SBP-2，再通過(guò)離子柱層析純化、凝膠柱層析純化等工藝，提取了更高純度且組分均一的半枝蓮多糖SBP-2A，通過(guò)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定SBP-2A的多糖含量為92.17%。本實(shí)驗(yàn)以小鼠肝癌H22細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究分離純化后的半枝蓮多糖SBP-2A對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞增殖及凋亡的影響，以期為開(kāi)發(fā)半枝蓮多糖為高效低毒抗腫瘤中藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠肝癌H22細(xì)胞株購(gòu)自無(wú)錫欣潤(rùn)生物公司；半枝蓮多糖SBP-2A于牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院自提，經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)得多糖純度為92%；黃芪多糖購(gòu)自北京美迪克斯生物技術(shù)有限公司，純度為99%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(浙江聯(lián)科生物有限公司)；RPMI 1640、青霉素鏈霉素(Gibco)；胎牛血清(無(wú)錫欣潤(rùn)生物公司)；BCA試劑盒、Western快速轉(zhuǎn)膜液(Beyotime)；SDS-PAGE配膠試劑盒、SDS-PAGE電泳液(Biosharp)；Bcl-2、Bax抗體(Wanleibio)；高效RIPA(Solarbio)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀(賽默飛世爾有限公司)；顯微鏡(賽默飛世爾有限公司)；BD Face calibur流式細(xì)胞分析儀(BD Biosciences，美國(guó))；5415D型離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠肝癌H22細(xì)胞的培養(yǎng)：將小鼠肝癌H22細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含10%的胎牛血清、1%的100 pg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素)中，放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

半枝蓮多糖SBP-2A溶液的配置：取出凍干的半枝蓮多糖SBP-2A粉末，加入RPMI 1640培養(yǎng)液，配置的半枝蓮多糖SBP-2A溶液的終濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL。

細(xì)胞分組及給藥：分為5組，陰性對(duì)照組不加入藥物，陽(yáng)性對(duì)照組加入濃度為200 μg/mL的黃芪多糖，低劑量治療組加入濃度為50 μg/mL的半枝蓮多糖SBP-2A，中劑量治療組加入濃度為100 μg/mL的半枝蓮多糖SBP-2A，高劑量治療組加入濃度為200 μg/mL的半枝蓮多糖SBP-2A。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖的抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌H22細(xì)胞以RPMI 1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為104個(gè)/mL，每孔100 μL，接種于96孔板。分為5組，每組設(shè)5～6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入5 μg/mL MTT，在培養(yǎng)箱孵育4 h，2000 r/min離心10 min，小心吸去孔內(nèi)液體并加入150 μL DMSO，震蕩10 min，利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度OD值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，抑制率=(1-試驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)× 100%。

1.5.2 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌H22細(xì)胞4×105個(gè)/孔接種在24孔板上，培養(yǎng)24 h后取出并收集細(xì)胞涂片于載玻片。細(xì)胞涂片用4%多聚甲醛固定1 h，按照蘇木素染色2 min、鹽酸乙醇分化3次、1%伊紅復(fù)染10～15 s、再用梯度乙醇分別浸泡0.5～1 min后，細(xì)胞涂片置于二甲苯中浸泡10 min。更換二甲苯后再浸泡10 min，滴加1～2滴中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5.3 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌H22細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后，離心棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-FITC再加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液混勻。室溫避光孵育后置于冰浴中，然后在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4 WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，按照1.5.1方法分組處理后培養(yǎng)24 h，用PBS沖洗，加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，置于冰上裂解30 min。在預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。用SDS-PAGE分離總蛋白，然后電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，用一級(jí)抗體在4 ℃孵育一整夜。用TBST(Tris緩沖鹽水和Tween 20的混合物)沖洗3次膜，并在室溫下與二級(jí)抗體孵育2 h。進(jìn)行洗膜、顯影液、定影、晾曬等一系列實(shí)際操作，最后用圖像處理軟件測(cè)量曝光圖像的光密度，然后用統(tǒng)計(jì)軟件分析目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白光密度的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率比較

陽(yáng)性對(duì)照組及低、中、高劑量治療組均顯示出對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，且隨著半枝蓮多糖SBP-2A劑量增加，小鼠肝癌H22細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2 細(xì)胞形態(tài)比較

光學(xué)顯微鏡下，陰性對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)良好，核質(zhì)染色較深。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞變小，嚴(yán)重破裂，胞質(zhì)流出僅剩下細(xì)胞核，存活的細(xì)胞明顯減少。低劑量治療組細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)亮點(diǎn)泡狀結(jié)構(gòu)，多數(shù)細(xì)胞核開(kāi)始出現(xiàn)固縮現(xiàn)象。中劑量治療組細(xì)胞核大幅固縮，細(xì)胞變小，少數(shù)細(xì)胞膜破裂，胞質(zhì)流出，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)開(kāi)始分開(kāi)。高劑量治療組細(xì)胞畸形，大小不一，破裂，胞質(zhì)留出，細(xì)胞黯淡無(wú)光。與陰性對(duì)照組比較，低、中、高劑量治療組均出現(xiàn)一定程度的凋亡形態(tài)特征，且高劑量治療組最為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)變化(×100)

2.3 細(xì)胞凋亡率比較

陽(yáng)性對(duì)照組及低、中、高劑量治療組細(xì)胞凋亡率均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且高劑量治療組細(xì)胞凋亡率顯著高于低、中劑量治療組(P<0.05)。見(jiàn)圖2及表2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.4 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

陽(yáng)性對(duì)照組及低、中、高劑量治療組Bax蛋白表達(dá)水平均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組及中、高劑量治療組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖3及表3。

1為陰性對(duì)照組，2為低劑量治療組，3為中劑量治療組，4為高劑量治療組，5為陽(yáng)性對(duì)照組圖3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表3 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

中藥在腫瘤治療方面強(qiáng)調(diào)扶正與祛邪相結(jié)合，注重全方位、多角度治療疾病，可起到穩(wěn)定腫瘤病灶、改善患者癥狀、提高生存質(zhì)量的效果。中藥多糖是一種天然大分子，廣泛存在于多種中藥材當(dāng)中，多項(xiàng)研究表明，中藥多糖具有抗腫瘤[4]、抗病毒[5]、抗氧化[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]等多種生物活性，從而有效抑制腫瘤增殖[8]、分化和轉(zhuǎn)移，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

半枝蓮是近幾年來(lái)研究較多的抗腫瘤藥物，研究表明半枝蓮粗多糖可抑制小鼠H22肝細(xì)胞瘤[9]；提高S180荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性，增強(qiáng)免疫功能[10]；也可通過(guò)影響H22小鼠肝癌瘤組織中的部分蛋白質(zhì)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的治療作用[11]；但以上研究都是基于半枝蓮粗多糖水平進(jìn)行的。本研究采用更精細(xì)的純化工藝，提取了更高純度且組分均一的半枝蓮多糖SBP-2A進(jìn)行抗肝癌作用機(jī)制的研究?；诖?，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠肝癌H22細(xì)胞，半枝蓮多糖SBP-2A處理24 h后檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示低、中、高劑量治療組細(xì)胞增殖抑制率顯著增加。HE染色結(jié)果顯示，低、中、高劑量治療組較陰性對(duì)照組出現(xiàn)核固縮、體積縮小、細(xì)胞皺縮等細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，且高劑量治療組最為明顯。通過(guò)Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示低、中、高劑量治療組細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組，高劑量治療組細(xì)胞凋亡率高于低、中劑量治療組。本研究結(jié)果表明半枝蓮多糖SBP-2A能夠抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

線(xiàn)粒體在細(xì)胞凋亡中起著決定性的作用[12]，細(xì)胞凋亡的線(xiàn)粒體是通過(guò)Bcl-2家族Bax/Bak與Bcl-2、Bcl-x L水平之間的平衡來(lái)調(diào)控的[13]。Bcl-2、Bcl-x L可以通過(guò)阻止線(xiàn)粒體Cytochrome-c的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用，而B(niǎo)ax和Bak通過(guò)破壞線(xiàn)粒體膜的完整性發(fā)揮促凋亡作用[14]。Bcl-2基因是一種具有抑制細(xì)胞凋亡作用的原癌基因，主要位于線(xiàn)粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Bax是一種誘導(dǎo)凋亡原癌基因，表達(dá)水平增加可拮抗Bcl-2的作用；兩者間相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。研究[15]顯示，Bcl-2/Bax比值上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡；Bcl-2/Bax比值下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，本研究檢測(cè)了半枝蓮多糖SBP-2A對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響，結(jié)果顯示中、高劑量治療組能明顯上調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平；再次印證了半枝蓮多糖SBP-2A對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

綜上所述，半枝蓮多糖SBP-2A可抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)同時(shí)下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。半枝蓮多糖作為一種天然提取物，仍需我們繼續(xù)挖掘其組分的藥用潛能。對(duì)于是否存在其他治療途徑或通路，也有待在后續(xù)研究中進(jìn)行更深入的探討。