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    鹽酸羥考酮在大鼠胃癌根治術(shù)中的超前鎮(zhèn)痛效果評(píng)價(jià)及對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的影響

    2022-12-26 12:08:12李正凱阮雁捷郭冠軍
    實(shí)用癌癥雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:羥考酮藥組脊髓

    李正凱 阮雁捷 郭冠軍 張 樂 張 品

    胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,給人類生命健康帶來嚴(yán)重危害,臨床上外科手術(shù)是主要治療方式。胃癌根治術(shù)對(duì)患者造成很大創(chuàng)傷,術(shù)后疼痛是患者要面臨的嚴(yán)重問題,尤其是深部內(nèi)臟牽拉的疼痛感,一直是術(shù)后鎮(zhèn)痛難題[1]。同時(shí)手術(shù)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷,患者容易發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)一步損傷正常組織。良好的鎮(zhèn)痛方式可以有效減輕患者術(shù)后炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng),降低并發(fā)癥發(fā)生率[2]。鹽酸羥考酮是一種μ、κ受體雙重激動(dòng)的半合成阿片類藥物,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用[3]。臨床研究表明,鹽酸羥考酮對(duì)內(nèi)臟痛具有良好鎮(zhèn)痛作用,常用于內(nèi)臟手術(shù)術(shù)后鎮(zhèn)痛[4]。超前鎮(zhèn)痛是指在傷害性刺激之前采取措施對(duì)其進(jìn)行阻滯,可有效減輕傷害性刺激誘發(fā)的疼痛感。研究發(fā)現(xiàn),鹽酸羥考酮超前鎮(zhèn)痛對(duì)惡性腫瘤患者術(shù)后鎮(zhèn)痛效果良好且不良反應(yīng)小,但其在胃癌根治術(shù)中的效果報(bào)道尚少[5]。本研究通過觀察鹽酸羥考酮對(duì)大鼠胃癌根治術(shù)超前鎮(zhèn)痛效果,并初步探討其鎮(zhèn)痛機(jī)制,為臨床胃癌根治術(shù)患者圍術(shù)期鎮(zhèn)痛提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠40只,SPF級(jí),雄性,4周齡,平均體質(zhì)量(100±20)g,購自上海南方模式生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0010,使用許可證號(hào):使用許可SYXK(滬)2018-0002。大鼠在溫度(23±2)℃,濕度(55±5)%,12 h/12 h明暗循環(huán)下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

    1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)(大連美侖生物技術(shù)有限公司,純度>95%),鹽酸羥考酮注射液(以色列RAFA LABORATORIES LIMITED公司,國藥準(zhǔn)字J20180002,1 mL∶10 mg×5支),一氧化氮(nitric oxide,NO)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondial dehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所),大鼠P物質(zhì)(substance P,SP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海滬震生物科技有限公司),兔抗大鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)多抗、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor κB,NF-κB)p65多抗、山羊抗兔IgG-HRP(美國Abcam公司),38450-電子觸覺測量儀、熱輻射痛閾檢測儀(意大利Ugo Basile公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 建立大鼠胃癌模型及分組 隨機(jī)取30只大鼠,參照文獻(xiàn)[6],采用MNNG誘導(dǎo)大鼠胃癌模型,用5%酒精-水溶液將MNNG配成濃度為1 g/L的母液,4 ℃避光保存,使用前再稀釋成MNNG終濃度為100 μg/mL的溶液,置于避光瓶內(nèi)。造模第1天起,給予大鼠飲用濃度為100 μg/mL MNNG的水劑作為常規(guī)飲用水,飼喂正常塊狀飼料;連續(xù)飲用8周后,飼喂上述MNNG水劑配制的粉狀飼料代替之前的塊狀飼料喂養(yǎng)大鼠;24周后改用正常塊狀飼料喂養(yǎng),隔天給予MNNG水劑;28周起停止給予MNNG水劑,改用自來水喂養(yǎng)1周。剔除造模過程中死亡大鼠2只,剩余28只隨機(jī)分為模型組9只,前給藥組9只,后給藥組10只。其余10只大鼠正常喂養(yǎng),為對(duì)照組。

    1.2.2 干預(yù)方法 開腹前30 min,對(duì)照組、模型組大鼠按0.2 mg/kg腹腔注射生理鹽水,前給藥組大鼠按0.2 mg/kg腹腔注射鹽酸羥考酮注射液。注射30 min后,模型組、前給藥組、后給藥組大鼠按4 mL/kg腹腔注射水合氯醛(10% w/v)進(jìn)行麻醉,腹部剃毛,在腹部正中切口,切除胃部病變部分,將直徑1 mm硅膠管埋入胃內(nèi),胃前壁雙層荷包縫合結(jié)扎,腹壁戳口引出導(dǎo)管,將戳口周圍腹膜縫合固定。開腹后30 min,后給藥組大鼠按0.2 mg/kg腹腔注射鹽酸羥考酮注射液。所有手術(shù)大鼠術(shù)后按0.1 mL/只注射青霉素(80萬單位)以防感染。對(duì)照組大鼠不做手術(shù)。肉眼觀察切除的胃黏膜有無灰白色結(jié)節(jié)、隆起、糜爛、潰瘍等變化,將胃黏膜病變部分行HE染色,鏡檢觀察胃黏膜有無腸化生及異型增生等胃癌典型病理變化,剔除胃黏膜無上述變化的大鼠,模型組、前給藥組、后給藥組各剔除一只。

    1.2.3 測定機(jī)械性縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT) 分別于術(shù)后24、48、72 h采用電子Von Frey測量儀測定大鼠PWMT。將大鼠單獨(dú)放入底部為鐵絲網(wǎng)的透明塑料隔間內(nèi),適應(yīng)30 min后,用測量儀的測試探針刺激大鼠兩后足底中部,至尼龍絲出現(xiàn)彎曲,緩慢加壓,不同強(qiáng)度之間間隔30 s,直到大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng),每個(gè)強(qiáng)度測試5次,出現(xiàn)3次縮足反應(yīng)為止,記錄儀器顯示的讀數(shù)。每足測量3次,取平均值。

    1.2.4 測定熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL) 分別于術(shù)后24、48、72 h測定大鼠PWTL。大鼠測完P(guān)WMT值后,將大鼠單獨(dú)放置于底部為2 mm厚有機(jī)玻璃的塑料箱中,適應(yīng)30 min后,用熱輻射痛閾檢測儀照射大鼠兩后足底部,至大鼠出現(xiàn)縮足或舔足時(shí)停止照射,記錄檢測儀上的時(shí)間,為PWTL,設(shè)定檢測儀自動(dòng)切斷時(shí)間為25 s,同一部位刺激間隔時(shí)間為5 min,每只大鼠重復(fù)測量5次,去除最大值與最小值,取剩余3次平均值。

    1.2.5 檢測血清NO、SP水平 末次PWTL測完后,頸椎脫臼處死大鼠,心臟采血3 mL,放入EP管,4 ℃ 4000 r/min(離心半徑12 cm)離心10 min,分離上清液后保存在-80 ℃的冰箱中。取保存血清,根據(jù)試劑盒說明書采用硝酸還原酶法檢測血清中NO濃度;SP濃度檢測采用雙抗體夾心ELISA法,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測光密度(A)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品大鼠血清SP濃度。

    1.2.6 檢測脊髓組織GSH-Px、SOD、MDA水平 末次PWTL測完后,頸椎脫臼處死大鼠,快速分離并取出脊髓,放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩H〖顾杞M織70 mg制備組織勻漿,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,終止反應(yīng)后在450 nm處讀取吸光度(A)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品GSH-Px、SOD、MDA的濃度。

    1.2.7 檢測脊髓組織iNOS、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量 取脊髓組織80 mg于液氮中研磨,加入全細(xì)胞裂解液,提取總蛋白,檢測蛋白濃度后,蛋白樣本加入上樣緩沖液,變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離等量蛋白,濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉2 h,添加iNOS、NF-κB p65一抗(1∶1 000)4 ℃封閉過夜,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶4 000),室溫孵育2 h,ECL顯影、定影、拍照,分析蛋白條帶灰度值,計(jì)算iNOS、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量(以iNOS、NF-κB p65蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠不同時(shí)間PWMT比較

    24、48、72 h PWMT組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組、前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWMT均減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWMT均增大,且后給藥組24、48、72 h PWMT均低于前給藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組、模型組、前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWMT隨著時(shí)間延長而增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠不同時(shí)間PWMT比較

    2.2 各組大鼠不同時(shí)間PWTL比較

    24、48、72 h PWTL組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組、前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWTL均縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWTL均延長,且后給藥組24、48、72 h PWTL均長于前給藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組、模型組、前給藥組、后給藥組24、48、72 h PWTL隨著時(shí)間延長而延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    2.3 血清NO、SP水平比較

    血清NO、SP濃度組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組、前給藥組、后給藥組NO、SP濃度均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,前給藥組、后給藥組NO、SP濃度均降低,且后給藥組NO、SP濃度均高于前給藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    表2 各組大鼠不同時(shí)間PWTL比較

    表3 各組大鼠血清NO、SP水平比較

    2.4 脊髓組織GSH-Px、SOD、MDA水平比較

    脊髓組織GSH-Px、SOD活力、MDA含量組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組、前給藥組、后給藥組GSH-Px、SOD活力均下降,MDA含量均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,前給藥組、后給藥組GSH-Px、SOD活力均升高,MDA含量均下降,且后給藥組GSH-Px、SOD活力均低于前給藥組,MDA含量高于前給藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

    2.5 脊髓組織iNOS、NF-κB p65蛋白水平比較

    脊髓組織iNOS、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組、前給藥組、后給藥組iNOS、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,前給藥組、后給藥組iNOS、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低,且后給藥組iNOS、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量高于前給藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5,圖1。

    表4 各組大鼠脊髓組織GSH-Px、SOD、MDA水平比較

    表5 各組大鼠脊髓組織iNOS、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

    3 討論

    胃癌根治術(shù)創(chuàng)口和內(nèi)臟疼痛刺激胃部及腹腔組織,誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),引起外周及中樞敏化,增強(qiáng)痛覺信號(hào),導(dǎo)致患者痛覺閾值降低,加劇疼痛反應(yīng)[7]。因此,選擇合適的鎮(zhèn)痛藥物最大限度減輕手術(shù)創(chuàng)傷帶給患者的疼痛至關(guān)重要。目前多數(shù)研究認(rèn)為,在術(shù)前采取干預(yù)措施阻滯傷害性刺激,以減少外周及中樞敏化,提高患者痛覺閾值,從而減少或避免術(shù)后使用鎮(zhèn)痛藥物,減小氧化應(yīng)激損傷[8]。目前研究發(fā)現(xiàn),一些鎮(zhèn)痛藥物應(yīng)用于婦科等手術(shù)超前鎮(zhèn)痛,效果良好,本實(shí)驗(yàn)將鹽酸羥考酮應(yīng)用于胃癌根治術(shù)大鼠,以研究其對(duì)胃癌根治術(shù)超前鎮(zhèn)痛的效果及其作用機(jī)制[9]。

    圖1 各組大鼠脊髓組織中各蛋白的表達(dá)

    鹽酸羥考酮可減輕與μ受體相關(guān)的傷害性疼痛,同時(shí)κ受體興奮可減輕術(shù)后內(nèi)臟痛,且不良反應(yīng)較小,術(shù)后鎮(zhèn)痛效果良好[10]。大鼠在胃癌根治術(shù)后表現(xiàn)對(duì)機(jī)械性刺激和熱刺激痛覺過敏,與人臨床術(shù)后疼痛相似。NO在機(jī)體疼痛調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,參與傳遞脊髓水平的傷害信息,與痛覺過敏的形成和發(fā)展密切相關(guān),抑制體內(nèi)NO生成可發(fā)揮有效鎮(zhèn)痛作用[11]。SP是一種傳遞痛覺信息的神經(jīng)遞質(zhì),廣泛參與多種疾病性疼痛的傳導(dǎo)和調(diào)制[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),前給藥組及后給藥組均可降低/縮短大鼠各個(gè)時(shí)間PWMT/PWTL,降低血清中NO及SP濃度,提示鹽酸羥考酮具有顯著鎮(zhèn)痛作用,且前給藥組比后給藥組的鎮(zhèn)痛效果更好,提示鹽酸羥考酮對(duì)大鼠胃癌根治術(shù)具有超前鎮(zhèn)痛作用。研究表明,采用鹽酸羥考酮超前鎮(zhèn)痛的腹腔鏡膽囊切除術(shù)患者,術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)疼痛評(píng)分和血清炎癥因子水平顯著降低[13]。研究發(fā)現(xiàn),鹽酸羥考酮超前鎮(zhèn)痛可以有效減輕內(nèi)鏡下兒童扁桃體切除術(shù)后的疼痛[14]。由此表明,使用鹽酸羥考酮超前鎮(zhèn)痛可有效減輕患者術(shù)后疼痛,結(jié)合本研究結(jié)果,提示鹽酸羥考酮在胃癌根治術(shù)超前鎮(zhèn)痛上同樣具有應(yīng)用價(jià)值。

    正常體內(nèi)氧化和過氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài),手術(shù)等傷害性刺激可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),體內(nèi)MDA等氧化產(chǎn)物生成增多,SOD和GSH-Px等抗氧化酶生產(chǎn)減少,造成體內(nèi)氧化和過氧化系統(tǒng)失衡,損傷細(xì)胞和組織,引發(fā)神經(jīng)疼痛[15]。Mato等[16]研究表明,在關(guān)節(jié)炎疼痛大鼠中,減少氧化應(yīng)激反應(yīng)可以降低大鼠機(jī)械性異常性疼痛。研究顯示,中線剖腹手術(shù)患者術(shù)后體內(nèi)SOD1水平顯著升高,且疼痛評(píng)分顯著降低[17]。本研究前給藥組和后給藥組脊髓組織SOD、GSH-Px活力顯著升高,MDA含量顯著減少,提示鹽酸羥考酮具有抗氧化作用,且前給藥組抗氧化作用效果更顯著,表明鹽酸羥考酮對(duì)胃癌根治術(shù)后鎮(zhèn)痛作用可能與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

    NF-κB以p50/p65異二聚體形式存在,在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用,氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基可以激活NF-κB,從而誘導(dǎo)iNOS轉(zhuǎn)錄,高表達(dá)的iNOS促進(jìn)大量合成NO,進(jìn)而增加傷害性痛覺信息在脊髓的傳遞和整合,加劇患者術(shù)后疼痛反應(yīng)[18]。研究證實(shí),抑制NF-κB/iNOS信號(hào)通路可以減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[19]。另有研究表明,NF-κB、iNOS表達(dá)水平下調(diào),抗氧化效果明顯[20]。本研究中前給藥組和后給藥組NF-κB p65、iNOS蛋白水平顯著下降,表明鹽酸羥考酮通過抑制NF-κB/iNOS信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用,同時(shí)前給藥組NF-κB p65、iNOS蛋白水平更低,表明鹽酸羥考酮發(fā)揮超前鎮(zhèn)痛作用可能是通過抑制NF-κB/iNOS信號(hào)通路,減少氧化應(yīng)激反應(yīng),發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

    綜上所述,鹽酸羥考酮在胃癌根治術(shù)大鼠中具有超前鎮(zhèn)痛作用,其作用機(jī)制可能是通過抑制NF-κB/iNOS信號(hào)通路,從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng),阻斷傷害性信息傳遞,發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,為臨床胃癌根治術(shù)患者圍術(shù)期鎮(zhèn)痛提供理論參考。

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