鉤端螺旋體病實驗室診斷研究進展

李彬，葉強，徐穎華

·綜述·

鉤端螺旋體病實驗室診斷研究進展

李彬，葉強，徐穎華

102629 北京，中國食品藥品檢定研究院國家衛(wèi)生健康委員會生物技術產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室

鉤端螺旋體（簡稱鉤體）病是一種由不同血清群致病性鉤體所引起的急性感染性疾病，屬自然疫源性疾病[1]。大多數(shù)哺乳動物均可為致病性鉤體的攜帶宿主，鉤體通過動物尿液排出后可以在水或土壤中存活數(shù)月，成為重要的傳染源[2]。盡管鉤體病發(fā)病率總體呈現(xiàn)下降趨勢，但是隨著全球氣候變暖、洪水災害頻發(fā)，鉤體病疫情在全球范圍內(nèi)仍時有發(fā)生，尤其是對發(fā)展中和不發(fā)達國家造成較大威脅[3-4]，我國近年也有死亡病例報道[5]。人們對此類傳染病放松警惕以及非特異性臨床癥狀表現(xiàn)等因素導致診斷難度加大，存在著鉤體病暴發(fā)或大流行的潛在危險[6]。

近些年，隨著生物信息學、基因組學等領域飛速發(fā)展，圍繞鉤體病的研究在不斷地深入和拓展，鉤體病的實驗室診斷方法也在不斷創(chuàng)新。因此，本文結合最新的文獻資料就目前國內(nèi)外鉤體病的實驗室診斷方法研究進展進行梳理，期望對鉤體病的快速診斷和預防提供借鑒作用。

1 傳統(tǒng)的鉤體培養(yǎng)法

在鉤體病發(fā)病初期，未使用抗生素類藥物前，可以從病人血液或腦脊液采取樣本進行培養(yǎng)，通過在暗視野顯微鏡中觀察有無鉤體生長進行診斷。鉤體的培養(yǎng)最常使用 Korthof 或EMJH（Ellinghausen McCullough Johnson Harris）作為主要的選擇性培養(yǎng)基[7]，并在培養(yǎng)基加入 8% ～ 10% 的兔血清、輔以少量抑菌劑提高樣本培養(yǎng)陽性率。該診斷方法需要在生物安全柜中進行操作，且鉤體培養(yǎng)生長至少需要2 周的時間，極易延誤治療時機，因此在實際臨床中應用較少[4, 8]。

雖然通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)法來診斷鉤體病實際應用很少，但是通過分離培養(yǎng)獲得鉤體菌株是一項最為基礎的工作，可以全面了解鉤體的分布，有效推動菌株標準化和疫苗研制[6]。

2 血清學診斷方法

血清學診斷主要是測定人或動物血清中的鉤體特異性抗體，主要包括顯微鏡凝集試驗（microscopic agglutination test，MAT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），目前市場已有商業(yè)化基于 IgG 和 IgM 抗體的 ELISA 檢測試劑盒或商用快速診斷測試卡[4, 9]。

2.1 MAT

MAT 是通過使用 7 天齡左右不同血清型鉤體培養(yǎng)物與患者不同稀釋度的血清相互作用，然后在暗視野顯微鏡下觀察凝集現(xiàn)象，以視野中 50%鉤體被凝集的患者血清最高稀釋度作為終點凝集滴度；其診斷標準是終點凝集滴度≥ 1:400 或二次采血雙份血清終點凝集滴度呈 4 倍或以上增長者為陽性[4, 10]。

然而，由于 MAT 方法要求實驗室保有不同血清型鉤體，且需要定期傳代培養(yǎng)維持鉤體菌株以制備活抗原，不易標準化，對實驗室及操作人員要求比較高[11]；此外，在疾病早期階段鉤體抗體水平低，易成假陰性診斷，而在鉤體病疫區(qū)因部分人口的 MAT 滴度升高，易成假陽性診斷；無法區(qū)分感染時間、不能用于流行病學和感染監(jiān)測[4]。例如，2018 年在廣州發(fā)現(xiàn)的 1 例鉤體病例采用 MAT 檢測結果為陰性，從而延誤了治療時機[5]。

2.2 ELISA

用于鉤體病診斷的 ELISA 主要有間接法（包括 IgM-ELISA 和 IgG-ELISA）、凝膠擴散 ELISA（Dig-ELISA）和斑點 ELISA（Dot-ELISA）。ELISA 法可以從不同血清型感染病人血清中檢測特異性 IgM 或 IgG 來診斷鉤體病，其中大多數(shù) IgM 靶向抗體主要在疾病的第一周內(nèi)產(chǎn)生，且在第二周確診最為準確，可對急性和亞急性感染進行診斷[3]。ELISA 因易于操作且不需要活抗原而發(fā)展成常用工具，目前市場上有許多商用的 IgM-ELISA 法檢測試劑盒[3-4]。

為了提高結果的質(zhì)量，研究人員對 IgM-ELISA 技術診斷鉤體病進行了改進。Niloofa 等[12]通過用辣根過氧化酶與 IgM/IgG 偶聯(lián)并加入碳酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液對聚乙烯微孔板進行處理，結果顯示這種血清特異性的in house-ELISAs 方法可用于鉤體病的實驗室診斷；此外，有人利用基因特異性抗原改進 ELISA 法，建立了多種屬特異性檢測方法，包括 rGroEL1-524 IgM-ELISA 檢測方法[13]和以 lipL32 重組蛋白作為抗原的 in house-間接 ELISA 法[14]，這些方法進一步提高了 ELISA 診斷的敏感性、特異性和可靠性。

3 分子診斷方法

隨著分子生物技術的發(fā)展，新的技術可以實現(xiàn)鉤體感染的快速檢測，且具有更高的靈敏度和特異性。目前，多種分子生物學技術和方法被用于鉤體實驗室診斷。

3.1 PCR

在鉤體病感染的早期和康復階段，可通過對樣本（培養(yǎng)物或患者體液）進行鉤體的特異性基因靶向擴增，進行快速和直接的診斷。鉤體中管家基因（、、s）或特異性基因（32、、、1）已被用作于 PCR 診斷靶標基因[15]，其中32基因是一種毒力因子，僅在致病性鉤體中發(fā)現(xiàn)，因此常被用作靶標基因以提高檢測的特異性[16]?；?2 基因特異性引物和 TaqMan 探針，采用熒光定量 PCR（RT-PCR）檢測鉤體病血清學陽性患者尿液樣本中的鉤體，表現(xiàn)出高特異性、敏感性、不易被污染等特點[16]。大量研究表明，基于32基因的 RT-PCR 特異性高達 99%，甚至達 100%。在發(fā)病的前 10天使用，獲得結果可靠，可作為鉤體病早期診斷的重要工具[17-18]。

研究人員通過將多重 PCR、MAT、ELISA 聯(lián)合使用，最大程度降低誤診率，極大提高了診斷的靈敏度[19]。但以 PCR 為基礎的分子診斷方法也有一定的局限性，比如不能確定所感染鉤體的血清型。

3.2 環(huán)介導等溫擴增檢測方法

環(huán)介導等溫擴增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）是通過針對目的基因的 6 個不同區(qū)域設計兩對引物、在單一溫度下 1 h 左右完成目的基因檢測的方法。由于 LAMP 方法無需貴重精細儀器，已廣泛應用于臨床診斷，尤其在一些發(fā)展中國家[20]應用較多?；?LAMP 開發(fā)的鉤體病實驗室診斷檢測方法日益增多，并已從簡單的濁度視覺結果觀察擴展到紙基核酸檢測或與生物傳感器裝置配套使用[20-21]。

Varsha 等[22]研制了一種基于 Whatman 濾紙作為檢測基質(zhì)的 LAMP 方法，將在基質(zhì)中包含有（用作陽性對照）、非致病性鉤體21、致病性鉤體32、陰性對照、人球蛋白基因（用作陽性對照）5 個靶點基因與中間樣本槽（待檢測感染血樣）相通，進行 LAMP 擴增，后加入 DNA 染料，可用智能手機和圖像處理軟件進行分析?？稍?15 min 之內(nèi)完成擴增，檢測靈敏度低至 50 ag/μl 的病原體，可區(qū)分血清樣本中的致病性和非致病性鉤體。Nurul Najian 等[21]開發(fā)了多重環(huán)介導等溫擴增（m-LAMP），可同時監(jiān)測目標 DNA 模板和 LAMP 對照，用于致病性鉤體的檢測，該方法檢測靈敏度低至每毫升 0.395 基因組。該研究團隊又于 2019年將 LAMP 與一種生物傳感器進行集成，利用 DNA 雜交系統(tǒng)進行分析，通過顏色快速判定結果，檢測靈敏度低至 200 fg/μl，且對 172 株鉤體菌株的檢測特異性為 100%[20]。

其中，Structurei，t表示旅游產(chǎn)業(yè)結構升級，Convergi，t表示文化與旅游產(chǎn)業(yè)融合；Mediatori，t表示中介變量，包括文化與旅游消費需求(Demandi，t)、技術創(chuàng)新(Techi，t)、文化與旅游業(yè)協(xié)同集聚(Clusteri，t)；Controlsi，t表示控制變量，包括市場化水平(Marketi，t)、人力資本(Labori，t)、政府支出(Governi，t)、貿(mào)易開放(Openi，t)；α、β、γ、φ為系數(shù)向量，εi，t為隨機誤差項。

多項研究表明，LAMP 用于臨床樣本的鉤體病實驗室診斷具有良好的特異性、敏感性和準確性，成本較低[23]，適用于不同層級醫(yī)院對疑似鉤體病例進行實驗室診斷。

3.3 基于生物傳感器的其他分子診斷方法

生物傳感器是將生物識別元件與換能器相結合的裝置，將生物信號轉換為可測量的讀數(shù)，從而確認生物相互作用，比如酶-底物反應、抗原-抗體反應、DNA-DNA 相互作用、DNA-蛋白質(zhì)相互作用等，可以提供一種快速、簡單且經(jīng)濟高效的、基于芯片實驗室的微生物檢測方法[8]。

目前，已有多種基于生物傳感器檢測鉤體的探索研究[24]。Nagraik 等[25]基于32基因開發(fā)了一種電化學 DNA 傳感器，該生物傳感器的多壁碳納米管經(jīng) AuNPs 修飾，固定標記的 ssDNA 探針，展現(xiàn)出對靶標微生物高度的敏感性和特異性。此外，研究人員應用金納米顆粒-碳納米纖維復合制備而成的電極，采用循環(huán)伏安法和電化學阻抗法進行電化學分析，可 30 min 之內(nèi)完成致病性鉤體特異性22 基因的檢測[26]。

上述生物傳感器無法區(qū)分致病性鉤體血清型，針對該問題，Bothammal 等[27]于 2022 年首次報道了基于檢測鉤體外膜脂多糖（LPS）電化學生物傳感器，將十二烷硫醇通過共價鍵結合在金電極上，形成自組裝單層膜結構并固定 LPS，與待檢血清樣本中鉤體抗體結合，實現(xiàn)鉤體感染的快速診斷。

總體而言，生物傳感器在疾病診斷領域顯示出巨大的潛力，但仍需進一步解決生物傳感器診斷鉤體病可重復性和設備成本等問題[8]。

3.4 宏基因組二代測序技術

宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術指采用二代測序技術對特定標本中所有核酸序列進行測序[28]。mNGS 因?qū)颖局兴泻怂嵝蛄羞M行無偏倚測序，在病原體檢測方面有檢測新發(fā)未知病原體、罕見病原體、跨物種傳播病原體等優(yōu)勢[28]。

鉤體病典型特征為黃疸、腎功能衰竭和出血性并發(fā)癥等，當出現(xiàn)罕見表現(xiàn)，如嚴重的肺泡出血、社區(qū)獲得性肺炎或其他病原體檢測均呈陰性的病例時，極容易誤診。因此mNGS 對幫助識別不明原因感染的病例具有重要價值[29-30]。2014 年，Wilson 等[31]對一名患有嚴重聯(lián)合免疫缺陷的 14 歲男孩采用 mNGS 進行病原體檢測，是文獻記載的最早采用 mNGS 技術對鉤體病進行診斷的病例。該病例出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱、頭疼，繼而出現(xiàn)腦積水、癲癇癥狀，在 4 個月內(nèi) 3 次就診，采用腦組織活檢進行 38 項病原學檢測，均未發(fā)現(xiàn)病原體，最終采用 mNGS 技術診斷為鉤體腦膜炎。我國近幾年也有不少 mNGS 技術用于鉤體實驗室診斷的報道。研究人員對一名流感試驗陽性患者樣品進行 mNGS 檢測分析，結果提示鉤體感染。病人隨后接受常規(guī)青霉素治療和機械呼吸支持，最終獲得治愈[30]；譚錦花等[5]對一名因初診為多器官功能障礙綜合征、流行性出血熱待排且MAT 顯示鉤體病陰性的患者采用 mNGS 檢測，發(fā)現(xiàn)鉤體基因序列，但因確診時間晚，患者第二天死亡；此外，還有多例在細菌培養(yǎng)、MAT、血清學分析、PCR 擴增等方法檢測病原體陰性的情況下，采用 mNGS 對患者樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)鉤體且對癥治療后好轉的研究報道[32-33]。

上述結果表明，mNGS 作為一種新的診斷方法，可更早、更精確地發(fā)現(xiàn)常規(guī)檢查所不能發(fā)現(xiàn)的病原體，尤其是針對傳統(tǒng)的培養(yǎng)法生長緩慢的病原體[34]，這有助于臨床上盡早使用有針對性的藥物進行治療。

mNGS 的分析是基于 DNA 文庫構建所獲得的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)與微生物基因組數(shù)據(jù)庫比對進行判定，因此，完善和獲得不同血清群致病型鉤體的全基因組信息數(shù)據(jù)是 mNGS 發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎。從 2003 年我國科學家完成第一株致病性鉤體測序工作以來[35]，國內(nèi)外研究人員對上千株鉤體基因組進行了研究，尤其是對致病性鉤體基因組的研究，這些研究促進了對該病原菌遺傳多樣性、分子進化和致病機制的認識，形成了海量鉤體基因組信息，這些數(shù)據(jù)信息的共享將助力全世界臨床實驗室對鉤體的快速準確診斷[36-38]。

4 結語

在長期研究過程中建立與發(fā)展起來的鉤體病實驗室診斷方法中，盡管傳統(tǒng)的鉤體分離培養(yǎng)和 MAT 法的靈敏度和檢出率低，但仍需通過培養(yǎng)方法獲得不同來源的鉤體分離菌株，為后續(xù)鉤體遺傳多樣性、分子進化和致病機制、疫苗研制等工作提供物質(zhì)基礎；以 PCR 為基礎的各種分子檢測方法是鉤體病實驗室診斷技術中靈敏度和特異性均較好的檢測方法。在臨床實踐中，操作人員需通過嚴格規(guī)范操作，避免假陽性、假陰性結果的出現(xiàn)。而 LAMP 檢測方法無需貴重儀器，操作簡單、檢測所需時間短且特異性高，尤其適合于基層或偏遠地區(qū)實驗室。

基于微型電化學傳感器芯片（生物傳感器）的分子診斷方法靈敏、快速，但現(xiàn)在仍處于臨床驗證階段。另外，mNGS 分析成本較高，還面臨診斷標準、實驗流程與分析流程的標準化以及不同國家公共衛(wèi)生監(jiān)管等問題。

生命科學的發(fā)展，為致病性鉤體基因組和蛋白質(zhì)組學研究提供了強大而豐富的手段，為了解鉤體病的分子機制、推動開發(fā)新的診斷治療方法提供了新的機遇。未來鉤體診斷技術的發(fā)展應注重診斷方法的準確性、靈敏度和穩(wěn)定性，實現(xiàn)裝置的便攜化，提高檢測設備的檢測速度和通量。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.006

國家科技重大專項（2018ZX10102-001）；國家自然科學基金（81471968）

葉強，Email：qiangyee@nifdc.org.cn；徐穎華，Email：xuyh@nifdc.org.cn

2022-01-27