芪歸銀方對左氧氟沙星大鼠半體內(nèi)抗耐藥銅綠假單胞菌的PK/ PD 分析

張婉喬 李顏伶 吳 珺 劉清泉 徐 廣 秦 銘 吉 莉 馬 群

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100010

銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，PA）為革蘭氏陰性菌，具有耐藥性強(qiáng)，耐藥機(jī)制復(fù)雜的特點，耐藥PA 所致的重癥肺炎死亡率較高[1-3]。左氧氟沙星（Levofloxacin，LVFX）是氟喹諾酮類抗菌藥物，可用于治療由PA 引發(fā)的各種感染性疾病[4-5]。近年來LVFX抗菌活性下降，PA 對LVFX 的耐藥率始終保持在30.0%以上[6-8]。

芪歸銀方由黃芪、當(dāng)歸、金銀花、青蒿和虎杖五味中藥組成，具有攻補(bǔ)兼施、扶正透邪之功。前期研究表明，芪歸銀方與抗生素聯(lián)用能夠提高抗生素對多重耐藥菌感染的治療效果[9-14]。本研究通過建立并評價LVFX 單用及LVFX 聯(lián)用芪歸銀方后的藥動學(xué)/藥效學(xué)（pharmacokinetic/pharmacodynamics，PK/PD）模型，探索芪歸銀方對LVFX 抗PA 的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黃芪、當(dāng)歸、金銀花、青蒿和虎杖（北京三和藥業(yè)有限公司，批號：90541102、93451002、90280901、9305 1001、90510501），北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系楊瑤珺教授鑒定為正品；左氧氟沙星片[第一三制藥（北京）有限公司]；左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸環(huán)丙沙星（上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號：W14M11H113063、Y04D8C49703）；甲醇、乙腈、甲酸均為質(zhì)譜級。

1.2 儀器

ACQUITY 型超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司），XevoTQ-SMicro 型三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Waters 公司），SorvallST8R 型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司），XW-80A 型旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），CM-24 型水浴氮吹儀（北京成萌偉業(yè)科技有限公司），LERD-Tech 型恒溫培養(yǎng)箱[立德泰勊（上海）科學(xué)儀器有限公司]，DNM-9602G 型酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗動物與菌株

SPF 級Wistar 雄性大鼠6～7 周齡，體重240～260 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006；飼養(yǎng)條件：室溫（23±2）℃，相對濕度為（60±5）%。本研究通過動物實驗倫理學(xué)審核（BUCM-4-2021113001-4079）；多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株（No.1912109）由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗科提供。

1.4 大鼠灌胃液的制備

1.4.1 芪歸銀方灌胃液 黃芪、金銀花、當(dāng)歸、青蒿和虎杖（12∶3∶2∶3∶2）加去離子水提取3 次，合并水提液，濃縮至生藥濃度為1.0 g/ml，加乙醇至醇濃度為60%，4℃靜置24 h。上清液揮發(fā)至無醇味后干燥，得提取物浸膏。按臨床處方量將提取物浸膏加蒸餾水稀釋得1 g/ml 生藥濃度的灌胃液。

1.4.2 LVFX 灌胃液 取LVFX，按臨床處方量加蒸餾水稀釋得0.01 g/ml 濃度的灌胃液。

1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法的建立

1.5.1 溶液的制備LVFX 標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，置于10 ml 容量瓶中，加甲醇定容。使用前，加甲醇稀釋至濃度為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml 的LVFX系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。同法配制濃度為5 μg/ml 的環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CPFX）內(nèi)標(biāo)液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 檢測條件 ACQUITY UPLC CSH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流速0.4 ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣體積1 μl。流動相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～0.1 min，90%→85%A；0.1～3.0 min，85%→20%A；3.0～3.5 min，20%→90%A。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，離子對選擇LVFX m/z=362.239 5～261.176 7，錐孔電壓44 V，碰撞能量22 eV；CPFX m/z=332.165 1～245.191 9，錐孔電壓42 V，碰撞能量20 eV。毛細(xì)管電壓2.5 kV，離子源溫度150℃，去溶劑氣溫度350℃，去溶劑氣流速650 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。

1.6 實驗分組及處理

1.6.1 實驗分組和樣品采集 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，分為空白組、單用組、聯(lián)用組，每組5 只。單用組灌胃0.01 g/ml LVFX（0.003 0 ml/g 大鼠）；聯(lián)用組先灌胃1 g/ml 血藥濃度的芪歸銀方（0.011 5 ml/g 大鼠），再灌胃0.01 g/ml VFX（0.003 0 ml/g 大鼠）；空白組灌胃等量蒸餾水。末次給藥前12 h 禁食不禁水，末次給藥后0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、4.00、8.00、12.00、24.00 h眼眶取血，4℃3 500 r/min 離心15 min（離心半徑6.6 cm）分離血清，56℃水浴30 min，滅活，-80℃保存。

1.6.2 血清樣品預(yù)處理與分析 取含藥血清20 μl，加5 μl 甲醇、5 μl 內(nèi)標(biāo)液混勻，50 μl 甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，4℃14 000 r/min 離心15 min 取上清液，氮氣吹干后加入1 ml 初始比例的流動相復(fù)溶，渦旋30 s，離心，取上清液。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 線性范圍

取空白血清20 μl，分別加入LVFX 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 μl，內(nèi)標(biāo)液5 μl，配成內(nèi)標(biāo)溶液終濃度為25 ng/ml，LVFX 終濃度分別為200、100、50、20、10、5、2、1 ng/ml 的系列濃度血清樣品。按“1.6.2”項下進(jìn)樣測定，以LVFX 峰面積As 與內(nèi)標(biāo)峰面積Ai 的比值（Y）對LVFX 濃度（X）作權(quán)重回歸。LVFX 在血清中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.113 2X+0.140 0，r=0.999。

2.2 精密度試驗

取空白血清20 μl，加入LVFX 標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μl，配置5、20、100 ng/ml 的樣品，每個濃度5 個樣品，處理后連續(xù)進(jìn)樣5 次，得日內(nèi)精密度，連續(xù)進(jìn)樣5 d，得日間精密度。結(jié)果顯示，LVFX 在大鼠血清中的日內(nèi)精密度平均RSD 值為7.70%，日間精密度平均RSD值為7.56%。

2.3 穩(wěn)定性試驗

制備LVFX 5、20、100 ng/ml 的血清樣品各5 份，分別在室溫25℃放置4 h，-80℃冰箱冷凍14 d 及-20℃冰箱冷凍-室溫解凍反復(fù)凍融3 次，處理后進(jìn)樣。結(jié)果顯示，3 種條件下平均RSD 值分別為7.00%，4.83%和6.88%。

2.4 提取回收率

制備5、20、100 ng/ml 的LVFX 血清樣品各5 份，進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示高、中、低三個濃度下LVFX 平均提取回收率為81.03%～93.46%，平均RSD 值為7.28%。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

①配制LVFX 低、中、高濃度分別為5、20、100 ng/ml的甲醇溶液各5 份；②配制LVFX 濃度為5、20、100ng/ml的空白血清樣品各5 份，處理后測定，基質(zhì)效應(yīng)=響應(yīng)值②/響應(yīng)值①×100%[20]。結(jié)果顯示基質(zhì)效應(yīng)范圍為86.74%～92.00%，平均RSD 值為3.18%。

2.6 PK 實驗及結(jié)果

處理后的血清樣品按“1.5”項下進(jìn)樣分析，采用DAS 2.0 軟件計算PK 參數(shù)，采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，單用組與聯(lián)用組曲線下面積（area under the curve，AUC）、最大血藥濃度（Cmax）、平均滯留時間[MRT（0-t）]、達(dá)峰時間（Tmax）和清除率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 單用組及聯(lián)用組大鼠血清中平均藥物濃度-時間曲線

表1 單用組及聯(lián)用組PK 參數(shù)（n=5，）

表1 單用組及聯(lián)用組PK 參數(shù)（n=5，）

注 與單用組比較，aP ＜0.01。PK：藥代動力學(xué)；AUC：曲線下面積；MRT：平均滯留時間；Tmax：達(dá)峰時間；Cmax：最大血藥濃度

2.7 PD 實驗及結(jié)果

2.7.1 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測定 采用肉湯稀釋法測定單用組及聯(lián)用組對耐藥PA 的MIC 值。結(jié)果顯示，單用組MIC 為8 μg/ml，聯(lián)用組MIC 為4 μg/ml。

2.7.2 抑菌率測定 取PA 單個菌落接種并培養(yǎng)后，配制1.5×108CFU/ml 的PA 菌液。用MHB 培養(yǎng)基稀釋得1×106CFU/ml 的PA 肉湯培養(yǎng)基混合液。取50 μl各時間點的血清于96 孔板中，每孔中加入PA 肉湯培養(yǎng)基混合液50 μl，3 個平行孔。另設(shè)含空白血清的陽性和陰性對照孔平行對照。37℃培養(yǎng)24 h 后測定各孔吸光度值，計算含藥血清對PA 的抑菌率。結(jié)果顯示，單用組和聯(lián)用組的抑菌率初始值4.49%和37.40%，在給藥24 h 后的血清抑菌率為7.69%和32.91%。見圖2。

圖2 單用組及聯(lián)用組大鼠血清抑菌效應(yīng)-時間曲線

2.8 PK/PD 模型的建立

計算大鼠血清半體內(nèi)各時間點平均孔內(nèi)濃度Ci和各個時間點血清的半體內(nèi)AUC24h值（AUC24h=Ci×24），采用Phoenix WinNonlin 軟件擬合半體內(nèi)參數(shù)AUC/MIC 與抑菌效果，以標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)評估模型擬合精度，以最小信息化準(zhǔn)則（akaike information criterion，AIC）值評估模型擬合優(yōu)度，確定最優(yōu)模型。結(jié)果顯示，單用組采用無基線SigmoidEmax 模型（E0=0）擬合效果較好，AIC 值為73.08；聯(lián)用組采用有基線SigmoidEmax 模型擬合效果較好，AIC 值為47.39。以血清抑菌率為藥效指標(biāo)，通過Phoenix WinNonlin 軟件擬合得到兩組的PK-PD 參數(shù)，見表2。單用組半體內(nèi)PK/PD 模型為E=（63.80×C2.96）/（0.94+C2.96）；聯(lián)用組半體內(nèi)PK/PD 模型為E=34.72+（57.88×C3.04）/（66.63+C3.04）。

表2 以血清抑菌率為藥效指標(biāo)的PK-PD 參數(shù)

3 討論

本研究結(jié)果中LVFX 單用時的Tmax及Cmax與文獻(xiàn)[15-16]報道基本一致，提示本研究結(jié)果準(zhǔn)確可信。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)用芪歸銀方雖然減慢了LVFX 在大鼠體內(nèi)的吸收速度和程度，但可使其在體內(nèi)的平均滯留時間延長，控制LVFX 在體內(nèi)的釋放速度；聯(lián)用芪歸銀方后血清抑菌率的初始值較高，達(dá)峰時間較長，給藥24 h 后抑菌率繼續(xù)保持在30%以上。芪歸銀方中黃芪提取物、青蒿精油、虎杖中分離的醌類化合物和當(dāng)歸總黃酮醇提液對大腸埃希菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等有抑制作用；且金銀花能破壞PA 生物膜的形成，達(dá)到抑菌效果[17-26]。芪歸銀方聯(lián)用對LVFX 抗耐藥PA 的優(yōu)勢除了協(xié)同作用外，可能與其中中藥成分的抑菌作用有關(guān)。同時，PK/PD 模型顯示大鼠體內(nèi)LVFX 不同時間點的血藥濃度與其抑菌率有一定的相關(guān)性，芪歸銀方可能通過影響LVFX 在大鼠體內(nèi)的血藥濃度從而增強(qiáng)LVFX 對耐藥PA 的抑制效果。