植物內(nèi)生菌功能及應(yīng)用研究

曹 陽(yáng) 胡月 劉 彬

（黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000）

1.植物內(nèi)生菌的定義

內(nèi)生菌一詞是由植物病理學(xué)之父De Bary在1866年首先提出，是指生活在植物組織內(nèi)的微生物，用以區(qū)分那些生活在植物表面的表生菌?，F(xiàn)在被定義為能夠在植物內(nèi)部定殖而不引起宿主致病的微生物。內(nèi)生菌種類豐富，包括細(xì)菌、真菌、放線菌。內(nèi)生菌在控制病原菌，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，新化合物的合成等方面有很好的應(yīng)用。

2.植物內(nèi)生菌多樣性

植物不是單一微生物的宿主，而是同時(shí)宿主許多不同的有機(jī)體，它們統(tǒng)稱為內(nèi)生微生物組。內(nèi)生微生物組是多樣的，包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌以及內(nèi)生放線菌。宿主植物不同，其內(nèi)生菌的種類和數(shù)量也存在差異，同一宿主植物在不同組織中內(nèi)生菌的分布及其豐度也有所差異。很多內(nèi)生菌雖然在形態(tài)學(xué)上沒(méi)有較大差異，但是其內(nèi)生菌的遺傳型卻不盡相同，從而豐富了內(nèi)生菌的多樣性。目前研究較多植物物種有小麥、大豆、棉花，馬鈴薯等。已分離出的內(nèi)生真菌，大多數(shù)的內(nèi)生真菌是子囊菌類。而分離的內(nèi)生細(xì)菌已經(jīng)超過(guò)了129種，有50多個(gè)屬，主要有芽孢桿菌屬、單胞菌屬、泛生菌屬、假單胞菌屬等。植物內(nèi)生放線菌主要的種類為鏈霉菌屬等。地球上內(nèi)生菌的種類100萬(wàn)左右，然而目前記載的植物內(nèi)生菌尚不足1/10，植物內(nèi)生菌的研究任重而道遠(yuǎn)。

3.植物生防內(nèi)生菌分離

植物生防內(nèi)生菌的分離篩選過(guò)程：（1）在病害壓力地區(qū)對(duì)健康植物進(jìn)行取樣。（2）利用人工培養(yǎng)基從表面無(wú)菌組織中分離。（3）利用核糖體基因?qū)Ψ蛛x物進(jìn)行分子鑒定。（4）定殖效率和大規(guī)模生產(chǎn)試驗(yàn)可以減少潛在分離菌的數(shù)量，以及發(fā)現(xiàn)潛在的病原體。（5）溫室內(nèi)進(jìn)行植物內(nèi)生菌對(duì)植物的篩選試驗(yàn)。（6）成功的分離菌可以在大田條件下進(jìn)行大規(guī)模試驗(yàn)，以評(píng)估田間的一致性。（7）潛在的生防內(nèi)生菌可以進(jìn)入工業(yè)階段或大規(guī)模生產(chǎn)和銷售。

許多研究人員通過(guò)分離可培養(yǎng)微生物并測(cè)試其潛在的生防功能，尋找潛在的生防菌。通常采用體外對(duì)抗試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定抑制目標(biāo)病原體生長(zhǎng)的能力，即直接抗菌活性尋找潛在生防菌。從生境中尋找健康的植物，從植物上分離出新的內(nèi)生菌，它們可以與病原體相互作用，為了檢驗(yàn)從一些環(huán)境中分離出來(lái)的內(nèi)生菌更有可能適應(yīng)這些特定的環(huán)境條件（例如，溫度、紫外線輻射、競(jìng)爭(zhēng)生物等），之后可以進(jìn)行小規(guī)模的田間試驗(yàn)，以評(píng)估疾病癥狀的發(fā)展，并優(yōu)化時(shí)間點(diǎn)和應(yīng)用方法。

從植物中篩選出的內(nèi)生微生物對(duì)寄主植物的適應(yīng)性特別好，因?yàn)樗鼈冎辽僭谄渖芷诘囊徊糠衷谥参锝M織內(nèi)部定居，而不會(huì)造成任何直接的、明顯的負(fù)面影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)內(nèi)生菌分離篩選并進(jìn)行相關(guān)的應(yīng)用進(jìn)行了全面而深入的研究。革蘭氏陽(yáng)性蠟樣芽孢桿菌REN3和REN4從水稻根際和根中分離得到，實(shí)驗(yàn)證明具有促進(jìn)水稻生長(zhǎng)和抑制水稻病原真菌生長(zhǎng)的特性。一種拮抗枝孢菌的分離物從一種產(chǎn)孢菌的黑曲霉菌落中分離出來(lái)，在田間被證明與殺菌劑一樣有效控制蘋(píng)果疥瘡。有研究表明從工業(yè)和城市污水灌溉玉米根際土壤和根系中分離的可培養(yǎng)根際和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)重金屬和鹽分的抗性和植物生長(zhǎng)促進(jìn)（PGP）特性，結(jié)果表明，大量細(xì)菌分離株（包括內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌）對(duì)重金屬具有耐受能力。

4.植物內(nèi)生菌功能

4.1 增強(qiáng)植物抗病性

內(nèi)生菌能夠增強(qiáng)植物宿主對(duì)病原生物的抗性，保護(hù)宿主免受危害。近年來(lái)，隨著內(nèi)生菌研究領(lǐng)域的不斷深入，內(nèi)生菌作為潛在的生防資源方面成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。內(nèi)生菌增強(qiáng)植物的抗病性可能機(jī)理主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：激活自身防御系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性；重寄生作用; 通過(guò)抗菌物質(zhì)直接抑制；爭(zhēng)奪空間和營(yíng)養(yǎng)。通常，不同內(nèi)生菌的生防機(jī)制有所差異，或單獨(dú)發(fā)揮作用或幾個(gè)機(jī)制同時(shí)作用。通過(guò)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（氮、磷和必需礦物質(zhì)）或調(diào)節(jié)植物激素水平促進(jìn)生長(zhǎng)也可以改善植物的整體健康，從而保護(hù)植物免受疾病。

4.1.1誘導(dǎo)抗性

誘導(dǎo)抗性是植物防御機(jī)制共同作用的結(jié)果。為了使植物不受病原侵染，大量的防御反應(yīng)被激活，包括加強(qiáng)結(jié)構(gòu)性障礙，抗微生物代謝物的生產(chǎn)，合成和分泌的抗病原體的蛋白質(zhì)，包括防御酶與抗菌蛋白。誘導(dǎo)植物反應(yīng)的內(nèi)生植物衍生化合物，能夠識(shí)別外來(lái)特定的微生物成分。一旦認(rèn)定這些化合物是潛在的有害微生物，就會(huì)誘導(dǎo)防御反應(yīng)。植物對(duì)病原菌和內(nèi)生菌的反應(yīng)比較表明兩者的識(shí)別方式相同，但在誘導(dǎo)防御反應(yīng)方面有所不同。因此，誘導(dǎo)抗性很可能是內(nèi)生菌在疾病控制中最重要的機(jī)制之一。這些能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的化合物，有些在所有內(nèi)生菌中都是普遍性的，如細(xì)胞壁成分幾丁質(zhì)和β-葡聚糖，而有些則是具有有特異性的化合物，包括分泌蛋白、某些脂類和專門(mén)的代謝物、具有激素作用的分子和揮發(fā)性化合物。感染和定植過(guò)程中分泌的酶，如木聚糖酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶，可被宿主直接識(shí)別或通過(guò)其降解產(chǎn)物誘導(dǎo)防御反應(yīng)。在致病和內(nèi)生定殖過(guò)程中分泌的真菌效應(yīng)蛋白，如一些富含半胱氨酸的小分子蛋白質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)防御反應(yīng)和生理來(lái)促進(jìn)與宿主植物的相容性。

典型的系統(tǒng)抗性主要分為兩種類型，系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）和誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性（ISR）。大量研究表明，生防菌通過(guò)刺激植物自身的ISR反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)植物抵抗病原菌的能力。而ISR反應(yīng)主要特征是植株體內(nèi)活性氧變化，這與植物自身SOD、POD和CAT等相關(guān)抗逆酶活力息息相關(guān)。Mahunu等研究結(jié)果表明植物酸聯(lián)合酵母菌降低了由青霉菌引起的蘋(píng)果病害，并增加了CAT，POD，PPO防御酶活性。孫潤(rùn)紅等研究了生防菌枯草芽胞桿菌YB-05對(duì)小麥抗病性相關(guān)防御酶的誘導(dǎo)作用，結(jié)果表明，小麥經(jīng)生防菌處理后，葉片和根部與植物防御抗病相關(guān)的PPO、POD、SOD、PAL、CAT防御酶活性均比對(duì)照組高。

4.1.2 重寄生作用

重寄生是指包含了一系列情況的連續(xù)體，從宿主存活并從宿主細(xì)胞內(nèi)獲取營(yíng)養(yǎng)的生物營(yíng)養(yǎng)相互作用，到寄生體殺死宿主以死亡細(xì)胞生存的死性營(yíng)養(yǎng)相互作用。因?yàn)樵谂囵B(yǎng)皿中比在植物上更容易觀察到寄生的跡象，所以證實(shí)真菌寄生行為的研究通常是在體外進(jìn)行的。借助各種顯微鏡技術(shù)，可以看到寄生體和寄主之間的直接相互作用。真菌可以直接接觸，滲透進(jìn)被寄生的菌絲，纏繞在菌絲周圍，最終導(dǎo)致獵物菌絲的破壞。Donayre和Dalisay研究了一種從牧草中分離出來(lái)的內(nèi)生真菌Geotrichum sp.對(duì)水稻紋枯病菌的寄生作用。國(guó)內(nèi)有研究者檢測(cè)了從蘆葦中分離出來(lái)的內(nèi)生真菌，可以對(duì)抗土壤傳播的病原菌，在顯微鏡下可觀察到菌絲纏繞在病原菌菌絲周圍，細(xì)胞質(zhì)降解。

4.1.3 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)

抗生素指的是生防菌直接產(chǎn)生的對(duì)病原體的有抑制作用的化合物。人們已經(jīng)鑒定和開(kāi)發(fā)了一些生防菌代謝物，并研究了一系列不同化合物對(duì)植物病原的抑制活性。從內(nèi)生菌中分離出了大量具有抗菌活性的天然產(chǎn)物，包括生物堿、黃酮類、甾體、萜類、多酮類以及揮發(fā)性有機(jī)化合物，其中萜類和多酮類是目前對(duì)內(nèi)生真菌抗菌活性研究最多的代謝物，代謝產(chǎn)物可以在植物體內(nèi)從內(nèi)生菌轉(zhuǎn)移到病原感染的部位。目前研究較多的是關(guān)于內(nèi)生菌生產(chǎn)特定代謝物的能力和內(nèi)生菌培養(yǎng)物或粗提物對(duì)病原體的抑制作用。

4.1.4 爭(zhēng)奪空間和營(yíng)養(yǎng)

有益內(nèi)生菌和致病菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)和空間，也是一種可能的機(jī)制，通過(guò)其棲息的內(nèi)生植物可以防止宿主的侵染病原體。內(nèi)生菌可以在局部或系統(tǒng)地、細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)定植不同的植物組織。通過(guò)快速定植和清除可用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們占據(jù)了原本可能被病原微生物利用的生態(tài)位，從而在滿足自身的營(yíng)養(yǎng)條件需求的情況下，又減少了病原菌入侵的可能性。有研究發(fā)現(xiàn)從可可樹(shù)葉片上分離的內(nèi)生菌葉面施用到幼苗上可以局部減輕葉片上疫霉菌的病害癥狀，這些表明競(jìng)爭(zhēng)是一種機(jī)制。然而，體外對(duì)抗試驗(yàn)也顯示了所選菌株產(chǎn)生的代謝物，表明競(jìng)爭(zhēng)可能不是唯一的機(jī)制。

4.2 促進(jìn)植物生長(zhǎng)

大多數(shù)植物內(nèi)生菌具有直接和間接的機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，一些內(nèi)生菌的生長(zhǎng)代謝會(huì)產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素、細(xì)胞激素，能夠直接對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)起到促進(jìn)的作用，如吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素、磷溶解，鉀溶解等，通過(guò)生物固氮增強(qiáng)宿主的可攻氮可用性，吲哚乙酸在植物中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過(guò)不同水平的吲哚乙酸產(chǎn)生刺激細(xì)胞伸長(zhǎng)、種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。在間接機(jī)制中，內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，如鐵載體、抗生素、酶這些物質(zhì)能夠間接地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。許多細(xì)菌內(nèi)生菌具有產(chǎn)生鐵載體的能力，鐵載體與鐵離子螯合成可溶性復(fù)合體，當(dāng)這些復(fù)合物被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中時(shí)，它們會(huì)被水解，鐵被還原從而被植物吸收。纖維素酶和蛋白酶對(duì)提高植物對(duì)生物和非生物脅迫的耐受性很重要。

4.3 天然藥物資源

內(nèi)生菌是具生物活性化合物的來(lái)源之一，在醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有重要的意義。研究證實(shí)，內(nèi)生菌與宿主植物在協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，內(nèi)生菌及其次生代謝物能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分。近年來(lái)，從植物內(nèi)生菌中分離出的藥用活性成分不斷增加，包括酯類、多糖、二萜類、醌類、黃酮類、生物堿類等物質(zhì)。在1990-2010年期間，已有超過(guò)100種抗癌化合物從內(nèi)生真菌中被描述。此外，Govindappa等人從植物組織中分離出鏈格孢菌的凝集素，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌凝集素具有較強(qiáng)的抗糖尿病作用。2017年，Uzor等研究了內(nèi)生真菌黑孢菌中的活性物質(zhì)脫落酸的抗糖尿病作用，結(jié)果表明可以顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道從烏拉爾藥用植物中分離篩選出多種內(nèi)生菌，體內(nèi)及體外均表現(xiàn)出有抑菌作用，并對(duì)小鼠有鎮(zhèn)咳、祛痰作用。這些研究表明，植物內(nèi)生菌在新藥的研發(fā)及技術(shù)方面都具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。

5.內(nèi)生菌在植物上的應(yīng)用

內(nèi)生菌種類繁多，最常見(jiàn)的有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬、泛菌屬等，這些內(nèi)生菌與植物相互作用中發(fā)揮著有益的作用。利用全基因組測(cè)序方法對(duì)內(nèi)生菌在植物病原菌生物防治方面的潛力研究表明菌株能產(chǎn)生抗菌素，具有抗菌活性。Contreras-Pérez等在體外生物測(cè)定中，內(nèi)生菌株B. toyonensis COPE52顯示出對(duì)灰霉病植物病原灰霉病菌的抗真菌作用。此外，菌株COPE52在溫室條件下對(duì)藍(lán)莓植株的生物量和葉綠素含量均有促進(jìn)作用。2008年張鐸等利用平板對(duì)峙試驗(yàn)證明內(nèi)生菌BSD-2具有較強(qiáng)的抑菌活性，利用硫酸銨沉淀拮抗物粗提液，并證明該提取物具有良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、耐蛋白酶性、對(duì)氯仿敏感，能夠有效抑制V.dahliae孢子萌發(fā)。2012年王蘭英等從南藥植物砂仁中分離出一株對(duì)水稻紋枯病防效作用理想的內(nèi)生菌屬于芽孢桿菌屬的菌株SRJ2-4，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)水稻紋枯病的防效作用在盆栽和田間的防效效果分別是80.7%和79.4%，同時(shí)該菌株還能增加水稻的產(chǎn)量，每畝產(chǎn)量為488.79kg。2018年趙媛等以對(duì)葉紅景天（Rhodiola subopposita）為研究對(duì)象，從根、莖、葉中分離得到24株對(duì)葉紅景天內(nèi)生菌，其中有12株菌對(duì)蠶豆莢枯萎病病原菌、菜豆黑斑病病原菌、茄鐮刀菌有不同程度的抑菌作用。2018年陸藍(lán)翔等利用組織切片法、組織勻漿法從健康樟樹(shù)組織中分離出的巨大芽孢桿菌ZS-3具有一定的抗病促生的作用。

6.展望

一方面從植物內(nèi)生菌體內(nèi)提取的相關(guān)次生代謝產(chǎn)物具有抗菌、促生長(zhǎng)、抗病毒、抗氧化等很多功能；另一方面，植物內(nèi)生菌通過(guò)生物固氮、調(diào)節(jié)植物激素等作用促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量增加，有利于病蟲(chóng)害生物防治、污染土壤的生物修復(fù)，有利于減少化學(xué)藥劑的使用，促進(jìn)全球農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。然而，相比發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)在植物內(nèi)生菌方面的研究和應(yīng)用還存在著一定的差距，這就需要我們朝著更深的方向研究和探索。