摩澤蒲螨攜帶殺蟲真菌靶向防治光肩星天牛*

唐漢堯 鄭吉陽 王 敦

(西北農林科技大學昆蟲學研究所 楊凌 712100)

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)屬于鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)溝脛天牛亞科 (Lamiinae)星天牛屬 (Anoplophora)，其分布廣泛，是世界性嚴重的林業(yè)蛀干害蟲，對楊樹 (Populusspp.)、柳樹 (Salixspp.)、榆樹 (Ulmusspp.)等闊葉樹造成毀滅性危害。在我國， 1937年劉鶴昌先生首次報道并簡要描述了光肩星天牛(高瑞桐等， 2001)。據(jù)記載，光肩星天牛以前一直為一般性害蟲，很少暴發(fā)成災。1978年，我國啟動了“三北”防護林建設工程，為盡快改善我國西北地區(qū)惡劣的生態(tài)環(huán)境，選擇了適應能力強、生長速度快的楊樹為主要造林樹種。由于防護林樹種單一，造成光肩星天牛暴發(fā)成災； 由于光肩星天牛生活習性隱蔽，防治困難； 因此，數(shù)以萬計的林木被害致死，造成了巨大的經(jīng)濟損失，并對西北地區(qū)的生態(tài)環(huán)境造成極大破壞(駱有慶等， 1999)。此后，該蟲逐步發(fā)展為林業(yè)主要害蟲。

目前，光肩星天牛幾乎在我國全國范圍內均有分布。近年來，新疆、西藏也有發(fā)現(xiàn)楊樹等樹種被危害(楊忠岐等， 2018)。其中，寧夏、甘肅和內蒙古地區(qū)的危害最為嚴重(王哲等， 2016)。光肩星天牛在甘肅對天然次生白樺(Betulaplatyphylla)林也造成了嚴重危害(高瑞桐等， 2009)。在國外，光肩星天牛作為入侵物種，為害美國、加拿大兩國常見的楓樹 (Acerspp.)，使當?shù)氐牧帜驹馐艿絿乐匚：?(Pedlaretal., 2020; Daraetal.， 2019)。隨后，光肩星天牛又傳播到歐洲一些國家，其對農業(yè)防風林、種植園、城市街道、森林地區(qū)均構成嚴重威脅 (Javaletal., 2017)。

防治光肩星天牛最直接有效的方法是施用化學農藥，近年來不斷篩選高效低毒農藥并優(yōu)化施藥方式(于斌等， 2021； 高玉梅等， 2010)。然而在不污染環(huán)境的前提下，生物防治是首選， 近年來也篩選出了花絨寄甲 (Dastarcushelophoroide)、白蠟吉丁腫腿蜂 (Sclerodermuspupariae) 等優(yōu)良天敵(楊忠岐等， 2018)； 昆蟲病原真菌的篩選及施用方式也有大量研究，多以無紡布菌條防治成蟲為主(Cliftonetal., 2020; Daraetal.， 2019; Shanleyetal., 2009)?，F(xiàn)有防治光肩星天牛的方法在實驗室內和野外片區(qū)效果很好，但在大面積林區(qū)的防效會大打折扣，且難以解決工作量大、成本高的問題(Cliftonetal., 2020; 楊忠岐等， 2018； 王嘉冰等， 2017)。目前能有效控制光肩星天牛的技術不多 (Dhandapanietal., 2020)。

摩澤蒲螨 (Pyemotesmoseri) 屬于蜱螨目(Acarina)蒲螨科(Pyemotidae),是一種廣譜性的寄生螨，雌雄比和寄生率高，具有很強的攻擊能力和搜索寄主能力，是非常優(yōu)良的蛀干害蟲天敵(張彥龍等， 2017)。摩澤蒲螨能有效控制我國野生的新疆野蘋果 (Malussieversii) 上的毀滅性害蟲蘋小吉丁蟲 (Agrilusmali) (Cuietal., 2019)； 在室內能成功寄生臺灣狹天牛 (Stenhomalustaiwanus) 幼蟲、苧麻天牛 (Paragleneafortunei) 蛹(張彥龍等， 2017)； 但對于較為活躍的幼蟲較難形成有效寄生，林間應用摩澤蒲螨防治光肩星天牛尚無成功實例。由于摩澤蒲螨個體微小、活力強、能主動搜尋生活場所隱蔽的害蟲，亦可靠風力擴散(馬立芹等， 2009)，非常適宜作為媒介生物攜帶傳播昆蟲病原菌來防治蛀干害蟲，但截至目前尚未見到相關研究報道。本研究利用摩澤蒲螨為媒介生物，讓摩澤蒲螨攜高效生防菌真菌孢子進入光肩星天牛幼蟲的蛀道，從而將真菌孢子傳播給光肩星天牛幼蟲，使其感染真菌死亡。解決昆蟲病原真菌較難達到天牛幼蟲體上而感染寄主的技術瓶頸，嘗試采用較低的防治成本和工作量，達到高效便捷、有效生物防治光肩星天牛的效果。

1 材料與方法

1.1 媒介生物

室外模擬防治試驗和林間防治試驗所用的摩澤蒲螨成熟膨腹體購自北京香林佳業(yè)科技有限公司(北京昌平)。

1.2 昆蟲病原真菌

試驗所用昆蟲病原真菌Ma1為金龜子綠僵菌 (Metarhiziumanisopliae)，分離自實驗室飼養(yǎng)的蠐螬。Bb-LHS為球孢白僵菌 (Beauveriabassiana)，分離自內蒙古烏蘭察布老虎山公園染菌的光肩星天牛幼蟲。2種昆蟲病原真菌均由西北農林科技大學昆蟲與微生物資源利用實驗室鑒定并保存。

1.3 釋放裝置

將摩澤蒲螨成熟膨腹體放置于5 mL離心管底部，用小號平頭排筆蘸取由實驗室培養(yǎng)提供的昆蟲病原真菌孢子粉，將其刷在管口內壁，形成一層寬度約1.5cm的真菌孢子粉環(huán)帶。所刷孢子粉與無菌水混合后，經(jīng)血球計數(shù)板測定其孢子含量為1.08×109個·mL-1。當子螨爬出離心管后，體表就會攜帶上真菌孢子。

1.4 試驗樣地

1.4.1 室外模擬防治試驗樣地 在陜西省咸陽市西北農林科技大學南校區(qū)綠化地內，試驗所用受害楊樹木段由甘肅省酒泉市肅州區(qū)林業(yè)資源管理站提供，受害木段為新疆楊 (Populusalba)。

1.4.2 林間防治試驗樣地 在甘肅省酒泉市肅州區(qū)石河橋道班林地內(海拔1400 m左右，98°36′38″E，39°46′10″N)。受害樹種為新疆楊和二白楊 (P.gansuensis)，種植密度大，每棵樹有光肩星天牛排糞孔上百個。

1.5 試驗方法

1.5.1 室外模擬防治試驗 將受光肩星天牛危害的長1.0 m左右，直徑10～15cm的楊樹木段按自然生長方向下端植于室外土壤中，每日澆水，保證楊樹木段存活。用蚊帳罩住各組木段，每日檢查3次，及時采集羽化的成蟲并統(tǒng)計，防止光肩星天牛逃離后在當?shù)財U散。分別用膠帶在每根木段頂部固定釋放裝置，淹沒釋放。一共設置5組不同處理，每個處理(含對照)3個重復、每個重復10個木段，具體如下：

摩澤蒲螨和球孢白僵菌處理組(P-Bb-LHS)： 釋放裝置內有摩澤蒲螨和球孢白僵菌；

摩澤蒲螨和金龜子綠僵菌處理組(P-Ma1)： 裝置內為摩澤蒲螨和金龜子綠僵菌；

金龜子綠僵菌和球孢白僵菌處理組(Ma1-Bb-LHS)： 裝置內為金龜子綠僵菌和球孢白僵菌；

摩澤蒲螨處理組(P)： 裝置內只有摩澤蒲螨；

無螨無菌組(N)： 為空白對照組，裝置內無螨無菌。

統(tǒng)計防治前后每根木段排糞孔數(shù)量、羽化孔數(shù)量，并在防治1個月后剖開木段，檢查光肩星天牛死亡情況。

1.5.2 林間防治試驗 2021年8月在甘肅省酒泉市石河橋道班，選擇光肩星天牛危害嚴重的楊樹作為中心母樹，用尼龍扎帶將內有螨和真菌孢子的釋放裝置固定在母樹上，固定位置于距地面高度1 m左右的側枝上，管口朝向主干且略傾斜向下。防治所用真菌為Ma1和Bb-LHS的混合孢子粉，淹沒釋放。統(tǒng)計防治前和防治1個月后母樹及周圍楊樹距地面高度2 m以下排糞孔數(shù)量，確定蒲螨傳播直徑。

1.6 昆蟲病原真菌感染天牛幼蟲的鑒定方法

挑取室外模擬防治試驗中死亡蟲體體表的菌絲，按照Aljanabi等 (1997) 的方法提取菌絲總DNA，再以提取的總DNA為模板，選用3對引物分別進行PCR擴增及測序，在GenBank中進行BLAST分析確定真菌種類，同時與試驗所用殺蟲真菌的同源序列比對，以確定是否為試驗所釋放真菌菌株。PCR所用引物序列、體系及反應條件(孟云等， 2021)如下：

ITS1 : 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

ITS2 : 5′-GCTGCGTTCTTCATCGGATGC-3

EF1α-EF : 5′-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTY AT-3′

EF1α-ER : 5′-ATGACACCRACRGCRACRGTY TG-3′

nrSSU-CoF : 5′-TCTCAAAGATTAAGCCATGC-3′

nrSSU-CoR : 5′-TCACCAACGGAGACCTTG-3′

PCR體系 (25μL) ： dd H2O 17.7μL，10×PCR Reaction Buffer 2.5μL，dNTPs (2.5mmol·L-1)2μL，正、反向引物 (10μmol·L-1) 各 0.5μL，0.1% BSA 0.3μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5μL，DNA模板1μL。

ITS基因的PCR反應條件： 95℃ 5min； 95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1min，35個循環(huán)； 72℃ 10min。

TEF基因的PCR反應條件： 95℃ 4min； 94℃ 50 s、56℃ 50 s、72℃ 70 s，循環(huán)8次，每循環(huán)退火溫度降低0.5℃； 94℃ 50 s、52℃ 50 s、72℃ 70 s，循環(huán)25次； 72℃ 10min，12℃保存。

nrSSU基因的PCR反應條件： 95℃ 4min； 94℃ 50 s、56℃ 50 s、72℃ 2min，循環(huán)8次，每循環(huán)退火溫度降低0.5℃； 94℃ 50 s、52℃ 50 s、72℃ 2min，循環(huán)25次； 72℃ 10min，12℃保存。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad 8.0.2軟件檢驗處理之間的差異性，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 室外模擬防治試驗

2.1.1 防治前后光肩星天牛排糞孔數(shù)變化 防治1個月后，摩澤蒲螨和球孢白僵菌處理組(P-Bb-LHS)的木段排糞孔減少比例為77.0%(圖1左)，極顯著高于金龜子綠僵菌和球孢白僵菌處理組(Ma1-Bb-LHS)、摩澤蒲螨處理組(P)、無菌無螨組(N)的木段 (P<0.01) 。摩澤蒲螨和金龜子綠僵菌處理組(P-Ma1)的木段排糞孔減少比例為83.1%(圖1右)，極顯著高于Ma1-Bb-LHS、P、N 3組的木段 (P<0.01) 。

圖1 不同處理組平均每根木段的排糞孔減少比例

圖2 不同處理組平均每根木段的羽化孔增加比例

圖3 不同處理組平均每根木段的天牛死亡率

圖4 剖開木段后的光肩星天牛

2.1.2 防治前后光肩星天牛羽化孔數(shù)變化 摩澤蒲螨和球孢白僵菌處理組(P-Bb-LHS)、摩澤蒲螨和金龜子綠僵菌處理組(P-Ma1)的木段羽化孔增加比例為0(圖2)。金龜子綠僵菌和球孢白僵菌處理組(Ma1-Bb-LHS)的木段羽化孔增加比例為21.3%，極顯著高于P-Bb-LHS和P-Ma1組的木段(P<0.01) 。摩澤蒲螨處理組(P)、無菌無螨組(N)的木段羽化孔增加比例分別為18.7%和18.0%，均顯著高于P-Bb-LHS組和P-Ma1組的木段 (P<0.05)。

2.1.3 防治后光肩星天牛的死亡率 防治1個月后剖開木段檢查，金龜子綠僵菌和球孢白僵菌處理組(Ma1-Bb-LHS)、摩澤蒲螨處理組(P)、無菌無螨組(N)3種處理的木段天牛死亡率為0(圖3)。摩澤蒲螨和球孢白僵菌處理組(P-Bb-LHS)的木段天牛死亡率為85.0%，摩澤蒲螨和金龜子綠僵菌處理組(P-Ma1)的木段天牛死亡率為77.5%(圖3)，兩種處理木段天牛死亡率均極顯著高于P-Bb-LHS、P、N 3組的木段 (P<0.01) 。P-Bb-LHS和P-Ma1兩組的木段內蟲道發(fā)黑，內有感染真菌死亡的天牛幼蟲(圖4)。

2.1.4 天牛幼蟲感染真菌的分子鑒定結果 摩澤蒲螨和球孢白僵菌處理組(P-Bb-LHS)，死亡光肩星天牛幼蟲蟲體表面菌絲，3種引物的分子鑒定結果均為球孢白僵菌 (Beauveriabassiana)，同源性均在99%以上； 并序列與試驗所用菌株Bb-LHS序列完全一致。

2.2 林間防治試驗

防治1個月后發(fā)現(xiàn)，以母樹為中心，直徑2 m范圍內楊樹排糞孔減少比例為79.5%，直徑2～4 m范圍內楊樹排糞孔減少比例為77.5%(圖5)。當直徑逐步擴大時，排糞孔減少比例逐漸降低。傳播直徑8～10 m時，排糞孔減少比例為55.2%； 傳播直徑10～12 m時，排糞孔減少比例為43.9%； 傳播直徑大于12 m時，排糞孔減少比例僅有28.7%。

圖5 不同傳播直徑排糞孔的減少比例

3 討論

自然界中的蒲螨主要依靠風力傳播擴散，降落后爬行搜索寄主(馬立芹等， 2009)，故其擴散能力并不能局限于其爬行速度和能力。本研究表明蒲螨攜帶真菌孢子的水平傳播直徑10 m范圍內可以產生顯著的防效，如果存在風力等利于蒲螨傳播的自然因素，其防治有效面積將進一步增大。對于受害嚴重的林區(qū)，采用淹沒釋放方式也不失為一種有效策略。盡管有報道利用殺蟲真菌來防治天牛，但都是針對羽化飛出的成蟲(Gobleetal., 2014; Hajeketal., 2008)，能夠對成蟲形成一定的感染率，但無法突破樹干屏障去感染蛀道內的幼蟲。本研究利用蒲螨突破了真菌難以有效抵達蛀道內天牛幼蟲的屏障，對于已經(jīng)報道能夠感染天牛的殺蟲微生物而言，將會是一個強有力的輔助感染手段。

與昆蟲病原真菌聯(lián)用最廣泛的天敵是捕食螨，目前最大的爭議是真菌是否會侵染捕食螨，導致對害蟲的防效降低，因為當捕食螨取食獵物后，其腹部側面會膨脹，暴露的膜質部分更易受真菌侵染(吳圣勇等， 2019)。蒲螨在昆蟲體外寄生時，腹部膜質末端會膨大形成膨腹體(馬立芹等， 2009)，存在被真菌感染的可能性?？紤]到本研究只是利于蒲螨去傳播真菌孢子，即使蒲螨被真菌感染，直到蒲螨染菌致死需要1周以上時間，在此期間蒲螨已成功進入蛀道、并抵達天牛幼蟲蟲體，已經(jīng)有效完成真菌孢子的靶向傳遞。被真菌感染的蒲螨最終會在蛀道內死亡，死亡蟲體一樣可以作為感染源產生真菌孢子、并形成持續(xù)傳播，反而有利于感染天牛幼蟲。未被真菌感染的蒲螨依然可以寄生天牛蛹，能夠彌補單獨釋放蒲螨只能寄生天牛蛹而不能成功寄生天牛幼蟲的缺陷(李葉晨等， 2019； 胡帥等， 2013)，對于利用蒲螨防治天?；蚱渌珊οx能夠起到防效疊加作用。

由于天牛隱蔽性生活和危害，幼蟲蟲道均在樹干內，一般藥劑很難抵達幼蟲危害部位(余漢鋆等， 2017)。因此，在天牛防治實踐中，對發(fā)生相對較輕的林區(qū)，生產單位多用寄生性天敵來防治天牛，天敵昆蟲可以突破樹干屏障對天牛幼蟲和蛹形成有效的控制(楊忠岐等， 2018)。但當天牛危害嚴重時，天敵昆蟲控害作用則會被弱化，生產單位往往采用高劑量的化學農藥來防治成蟲，以有效壓制林間天牛種群數(shù)量(呂云彤等， 2018)。但光肩星天牛世代不整齊，在陜西、甘肅等地，每年4—10月均有成蟲出現(xiàn)(高瑞桐等， 2001)，化學農藥大面積、大量、長時間使用，不僅會造成嚴重的環(huán)境污染，也會對釋放的天敵昆蟲造成毀滅性影響。因此，避免化學農藥的使用、尋求能夠與天敵昆蟲協(xié)同控害的生物防治手段，將是控制天牛類害蟲的合理途徑。利于蒲螨來傳播天牛的病原真菌，可以與其他生物防治技術協(xié)同發(fā)揮作用，盡可能地減少或避免大面積噴施化學農藥，不僅可以達到減少環(huán)境污染和保護天敵的作用，也有望緩解大規(guī)模化學農藥防治和利用天敵生物防治之間的矛盾。

該技術為防治隱蔽危害的光肩星天牛提供了一種新的方法，能夠通過較為簡單、高效的手段，來有效地使蛀道內的天牛幼蟲感病死亡。同時，本研究為其他蛀干害蟲生物防治提供了新的思路。

4 結論

本研究利用摩澤蒲螨作為媒介生物傳播昆蟲病原真菌進行試驗，結果表明，能成功將真菌孢子傳播到光肩星天牛幼蟲蛀道中，病原真菌靶向性感染天牛幼蟲并最終致死天牛。室外模擬實驗表明，蒲螨能夠有效攜帶真菌孢子進入天牛蛀道，成功感染天牛幼蟲并造成85.0%光肩星天牛幼蟲死亡。林間防治試驗結果表明，蒲螨攜帶真菌孢子的水平傳播直徑為10 m，在這個范圍內排糞孔數(shù)量減少50%以上，表明具有顯著的防效。