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    山桐子健康和感病植株不同器官區(qū)細菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性與功能預(yù)測分析*

    2022-12-23 09:04:24薛曉焱蔡齊飛耿曉東周慧娜李明婉王艷梅
    林業(yè)科學 2022年8期
    關(guān)鍵詞:山桐子感病樹皮

    李 志 薛曉焱 劉 震 蔡齊飛 耿曉東 馮 建 周慧娜 張 濤 李明婉 王艷梅

    (河南農(nóng)業(yè)大學林學院 鄭州 450002)

    山桐子(Idesiapolycarpa)是大風子科(Flacourtiaceae)山桐子屬落葉闊葉喬木,樹形優(yōu)美,木材松軟,果實艷麗,在不同立地環(huán)境均具有較好的適應(yīng)性,是良好的新型用材樹種和觀賞樹種(陳珺肄等, 2019)。山桐子果實含油率高且營養(yǎng)物質(zhì)豐富,其果肉和種子中不飽和脂肪酸含量可達到75%和85%以上,是優(yōu)良的木本油料樹種,可作為開發(fā)高檔保健型木本食用油的原料,素有“樹上油庫”的美譽(代莉, 2014)。山桐子作為木本油料樹種,具有抗逆性強、適生地廣、“不與糧爭地”的優(yōu)勢,在林業(yè)、食品、醫(yī)藥及生態(tài)等多個領(lǐng)域有巨大的開發(fā)前景(陳釗等, 2019; 房麗莎等, 2020)。近年來,國家正式制定頒布了山桐子、山桐子油、山桐子餅粕3個行業(yè)標準,并將山桐子納入到了國家儲備林建設(shè)的政策體系中。

    在自然界,植物生長環(huán)境中有大量微生物,寄主在植物宿主體內(nèi)或附著其表面,這些微生物群體統(tǒng)稱為植物微生物組。細菌是這些微生物群落中最豐富的類群(Mülleretal., 2016)。同種植物不同器官區(qū)微生物存在一定差異,李聰聰?shù)?2020)比較了高寒草甸優(yōu)勢植物葉內(nèi)、根內(nèi)、土壤原核微生物組的組成,發(fā)現(xiàn)植物器官對微生物具有強烈選擇性,只有部分土壤微生物能夠進入植物根內(nèi)和葉內(nèi); Wu等(2020)研究結(jié)果表明柑桔(Citrusreticulata)葉片和韌皮部的微生物群落數(shù)量遠低于根系和土壤。細菌與植物形成復(fù)雜、動態(tài)的關(guān)聯(lián),包括互利共生或致病,Zarraonaindia等(2015)的研究發(fā)現(xiàn)葡萄(Vitisvinifera)葉子和果實中的甲基桿菌(Methylobacteriumspp.)可以通過產(chǎn)生植物激素的生產(chǎn)來刺激植物的發(fā)育; 尹詩琳等(2021)的研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌屬(Bacillus)對桑樹(Morusalba)病原菌存在著某種程度的拮抗作用,而泛菌屬(Pantoea)可能對桑輪紋病的發(fā)生有協(xié)同或者伴生作用。

    山桐子林木出現(xiàn)感病現(xiàn)象,部分植株根系變黑腐爛,樹皮出現(xiàn)褐色水漬病斑,葉片邊緣枯萎且葉面有褐色斑點,病害發(fā)生原因及致病因子尚未明確。目前,山桐子相關(guān)研究主要集中在栽培技術(shù)、油脂提取、開發(fā)利用等方面,而微生物病害方面的研究相對薄弱。 李佛生等(2021)對山桐子內(nèi)生真菌進行分離,鑒定出4種山桐子組織來源共同的內(nèi)生真菌為芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans); 有研究報道了山桐子葉斑病的病原真菌鏈格孢菌(Alternariaalternata)(Sunetal., 2015)。 細菌是否為造成山桐子病害的關(guān)鍵因子還有待進一步探索。研究基于高通量測序技術(shù),以健康和感病山桐子植株為對象,探究山桐子土壤、樹皮及葉片中細菌群落組成和多樣性,分析其差異,探討健康和感病山桐子不同器官區(qū)的優(yōu)勢菌屬及其潛在功能,探究各器官區(qū)的關(guān)鍵菌屬與山桐子感病之間的關(guān)系,以期為山桐子病害防治及經(jīng)營管理提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗地概況

    研究試驗地位于河南農(nóng)業(yè)大學林業(yè)試驗站,屬于暖溫帶大陸性氣候,年平均氣溫14.2℃,極端最高氣溫43℃,極端最低氣溫-17.9℃,年平均降水量650.1mm,全年日照時數(shù)約2 400 h。試驗地0~20cm土壤的基礎(chǔ)化學性質(zhì)為: pH 8.0,土壤全碳(TC)17.76 g·kg-1,全氮(TN)0.81 g·kg-1,有效磷(AP)2.43 mg·kg-1,有效鉀(AK)75.78 mg·kg-1。

    1.2 樣品采集

    2020年5月,在樣地內(nèi)采集健康山桐子植株和感病山桐子植株的根際土壤、樹皮、葉片樣品,以及樣地非根際土壤樣品。土壤樣品采集時,每樣株隨機選取3個樣點,去除植株基部表層土壤及雜物,取5~20cm土層側(cè)根或須根表面0.4cm左右的土壤作為根際土壤,空地同土層隨機取3個樣點作為非根際土壤,將每個樣點采集的土壤分別裝入無菌自封袋中充分混勻,共計9份土樣,土壤樣品編號為健康植株根際土壤(G)、感病植株根際土壤(BG)、非根際土壤(FG)。用無菌剪刀和鑷子采集植物樹皮和葉片,每樣株2個部位分別采3份,共6份皮樣、6份葉樣,編號分別為健康植株樹皮(P)、感病植株樹皮(BP)、健康植株葉片(Y)和感病植株葉片(BY)。采集好的樣品用冰盒保存帶回實驗室后,置于-80℃冰箱保存,供檢測使用。

    1.3 測定指標及方法

    對健康、感病山桐子植株根際土壤、樹皮、葉片及非根際土的總DNA進行提取,提取的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳,用紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。選擇引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),對樣品細菌16 S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)進行PCR 擴增(Claessonetal., 2009)。采用的25μL擴增體系包括5×reaction buffer 5μL,5×GC buffer 5μL,dNTP(2.5mmol·L-1)2μL,F(xiàn)orwardprimer(10μmol·L-1)1μL,Reverseprimer(10μmol·L-1)1μL,DNA Template 2μL,ddH2O 8.75μL,Q5 DNA Polymerase 0.25μL。擴增參數(shù)為98℃ 2min,98℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,72℃ 5min,30個循環(huán),10℃保存。Illumina miseq測序平臺進行高通量測序,測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    利用QIIME2(2019.4)軟件調(diào)用DADA2進行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體,采用97%的序列相似度作為OTU(operational taxonomic unit,OTU)的劃分閾值,獲得的OTU代表序列用于細菌群落組成分析、α多樣性分析和β多樣性分析、菌群功能預(yù)測等; 運用R軟件等工具,繪制稀疏曲線; 根據(jù)ASV/OTU豐度表制作upsetR圖; 對樣本中相對豐度前20位的屬進行聚類分析并繪制熱圖; 根據(jù)樣本差異距離進行主坐標分析(Principal coordinate analysis,PCoA); 利用SPSS 24.0分析α多樣性指數(shù)在各樣本間的差異(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 微生物測序結(jié)果分析

    對山桐子林地非根際土壤及健康、感病山桐子植株的根際土壤、樹皮、葉片進行高通量測序,21個樣本(3個重復(fù)/處理)中的細菌16 S rRNA V3-V4序列過濾后,共獲得1 193 103條高質(zhì)量序列。稀疏曲線可以用來比較測序數(shù)量不同的樣本物種豐富度,也可說明樣本的取樣大小是否合理。根據(jù)樣本的測序數(shù)據(jù),繪制對應(yīng)的稀疏曲線(圖1)。結(jié)果表明,各樣本的稀疏曲線均趨于平緩,說明該測序深度包含了樣本中絕大多數(shù)細菌類型,測序深度充足,可以反映真實的細菌群落生物多樣性。

    圖1 各區(qū)域樣本中細菌稀釋曲線

    2.2 山桐子健康、感病植株不同器官區(qū)細菌群落結(jié)構(gòu)

    2.2.1 山桐子健康、感病植株不同器官區(qū)OTU數(shù) 使用upset圖分析山桐子不同器官區(qū)細菌的物種組成(圖2)。土壤樣本健康植株根際土壤感病植株根際土壤(G)、感病植株根際土壤(BG)、非根際土壤(FG)中包含的OTU 數(shù)目分別是17 236、17 403、15 461 個,3組共有OTU 數(shù)量為1 100個,各自特有OTU 數(shù)目分別是14 517、14 577、12 776個,根際土壤樣本特有的OTU 數(shù)均高于非根際土壤,預(yù)示著根際土壤中含有較多的特有微生物種類; G和BG兩組特有OTU分別占其總OTU的84.22%和83.76%。樹皮樣本P、BP中的特有OTU數(shù)量為737、857個,分別占其總OTU的74.29%和80.77%。葉片樣本Y、BY中特有OTU數(shù)量為181、156個,分別占其總OTU的69.35%和70.91%。以上數(shù)據(jù)表明,健康植株根際土壤和樹皮中特有OTU數(shù)量少于感病植株,葉片特有OTU數(shù)量多于感病植株,7組樣本中特有OTU數(shù)量均占較大比例。

    圖2 各器官區(qū)細菌群落

    2.2.2 山桐子健康、感病植株不同器官區(qū)細菌門、綱、目、科水平群落結(jié)構(gòu) 對各樣本中得到的OTU序列進行分類注釋,所有樣本的細菌OTU隸屬于37個門,118個綱,291個目,511個科,1051個屬,2772個種。

    各分類水平上物種相對豐度前10位的細菌分布見圖3。在門水平上(圖3a),土壤樣本的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria); 其中變形菌門在G、BG和FG中所占比例為BG>G>FG,在根際土壤中相對豐度較大; FG中的酸桿菌門和綠彎菌門(Chloroflexi)占比數(shù)量顯著高于根際土壤(P<0.05),且綠彎菌門為FG的優(yōu)勢菌門。樹皮、葉片樣本的優(yōu)勢菌門為藍細菌門(Cyanobacteria)和變形菌門。在樹皮樣本中,變形菌門在P、BP中的相對豐度分別為30.52%、62.26%,P的相對豐度顯著低于BP; 藍細菌門在P、BP中的相對豐度分別為61.57%、28.39%,P的相對豐度顯著高于BP(P<0.05)。在葉片樣本中占比最多的是藍細菌門84.58%(Y)、88.42%(BY),其次是變形菌門15.16%(Y)、11.33%(BY),2個門的細菌占總數(shù)量的99.7%以上。

    在綱水平上(圖3b),變形菌門中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteo-bacteria)和放線菌門中放線菌鋼(Actinobacteria)在G和BG中占比較為接近,但均高于FG,其中放線菌綱在根際與非根際土壤中差異達到顯著水平(P<0.05); 而放線菌門中嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)在FG中的相對豐度顯著高于根際土壤。在樹皮樣本中,藍細菌門中產(chǎn)氧光細菌綱(Oxyphotobacteria)在P(61.57%)中的相對豐度顯著高于BP(28.39%),γ-變形菌綱在BP(43.82%)中的相對豐度顯著高于P(5.15%)。綱水平上,葉片樣本主要綱為產(chǎn)氧光細菌綱和α-變形菌綱,兩者在Y和BY中占比接近。

    在目(圖3c)、科(圖3d)水平上,產(chǎn)氧光細菌綱中葉綠體(Chloroplast)是樹皮、葉片的主要組成,在P、BP、Y、BY中占比分別為61.56%、28.39%、84.54%、88.41%; α-變形菌綱中立克次氏體目(Rickettsiales)及其下屬線粒體(Mitochondria)的相對豐度在P、Y、BY 3組樣本中占比分別為14.03%、14.06%和10.76%; γ-變形菌綱中腸桿菌目及其下屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)在樹皮樣本BP(41.03%)中的相對豐度顯著高于P(1.02%)。

    圖3 各分類水平上相對豐度前10物種在各樣本的分布和豐度

    2.2.3 山桐子健康、感病植株不同器官區(qū)細菌屬水平群落結(jié)構(gòu) 對3組土壤樣本中相對豐度排名前20位的細菌屬進行UPGMA聚類分析,結(jié)果表明(圖4),根際土壤G、BG具有相似的細菌群落結(jié)構(gòu),聚為一類; FG與根際土壤差異較大,單獨為一類。20個細菌屬可以分為3組(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。FG中Ⅰ組細菌屬豐度較高,主要包括變形菌門中的bacteriap25、Haliangium、MND1; 放線菌門中的Gaiella、MB-A2-108、67-14、IMCC26256; 綠彎菌門中的A4b、KD4-96; 酸桿菌門中的Subgroup_17、RB41; 以及浮霉菌門的OM190,Rokubacteria的Rokubacteriales,共13個菌屬。G中Ⅲ組細菌屬豐度較高,主要包括放線菌門中的類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、芽球菌屬(Blastococcus)、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter); 酸桿菌門中的Subgroup_6; 變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas),共5個菌屬。BG中Ⅱ組細菌屬豐度較高,主要包括變形菌門中Dongia以及放線菌門中的鏈霉菌屬(Streptomyces),共2個菌屬。

    圖4 土壤在屬水平上的細菌豐度聚類熱圖

    選取2組樹皮樣本中豐度排名為前20位細菌屬進行UPGMA聚類,繪制物種豐度聚類熱圖(圖5)。由圖5可知,2組樹皮中的細菌群落在屬水平上差異明顯。P中豐度較高的細菌屬,主要包括變形菌門中的鞘氨醇單胞菌屬、不動桿菌屬(Acinetobacter)、Aureimonas; 放線菌門中的Quadrisphaera、貧養(yǎng)桿菌屬(Modestobacter)和擬桿菌門的薄層菌屬(Hymenobacter),共6個菌屬。BP中豐度較高的細菌屬,主要包括變形菌門中的Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、小坂菌屬(Kosakonia)、Brenneria、Hafnia-Obesumbacterium、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas); 厚壁菌門中的類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、Saccharibacillus; 放線菌門的芽球菌屬,共12個菌屬。

    對樹皮樣本中的細菌進行優(yōu)勢菌屬分析,在健康和感病山桐子樹皮細菌中,細菌豐度10%以上且存在顯著差異(P<0.05)的屬有2個,分別是Brenneria和Hafnia-Obesumbacterium,在健康山桐子樹皮中相對豐度僅為0.79%和0,顯著低于感病山桐子樹皮中Brenneria(18.33%)和Hafnia-Obesumbacterium(17.5%)的相對豐度。

    選取2組葉片樣本中豐度排名為前20位細菌屬進行UPGMA聚類(圖6)。由圖6可知,Y中豐度較高的細菌屬,主要包括變形菌門中的鞘氨醇單胞菌屬、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、不動桿菌屬、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、假單胞菌屬、貪銅菌屬(Cupriavidus)、草螺菌屬(Herbaspirillum); 以及綠彎菌門的KD4-96,共11個菌屬。BY中豐度較高的細菌屬,主要包括厚壁菌門中的魏斯氏菌屬(Weissella)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus); 以及變形菌門中的Escherichia-Shigella、Phreatobacter、Pusillimonas,共7個菌屬。

    2.3 不同器官區(qū)細菌群落多樣性分析

    2.3.1 α多樣性分析 對山桐子植株不同器官區(qū)細菌多樣性指數(shù)進行差異分析(表1)。采用Chao1指數(shù)反映物種豐富度; 采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映細菌群落的多樣性; Goods coverage指數(shù)反映群落覆蓋度。山桐子植株不同器官區(qū)細菌的Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)值都表現(xiàn)為土壤樣本最高,其次是樹皮樣本,最后是葉片樣本,說明土壤細菌群落豐富度和多樣性是最高的。土壤各組的Chao1指數(shù)由大到小排列依次為: BG>G>FG,感病植株根際土壤細菌群落豐富度最高; Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)由大到小依次為: G>FG>BG,說明健康植株根際土壤細菌群落多樣性最高。葉片中Y組的Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)均高于BY,表明健康植株葉片細菌群落豐富度和多樣性高于感病植株葉片。但健康植株與感病植株土壤、葉片細菌群落的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異均未達到顯著水平(P>0.05)。樹皮細菌群落Chao1指數(shù)表現(xiàn)為P高于BP,而Shannon、Simpson指數(shù)均表現(xiàn)為BP高于P,其中Simpson指數(shù)差異達到顯著水平(P<0.05),說明健康植株樹皮細菌群落豐富度較高,但細菌群落多樣性低于感病植株樹皮。

    圖5 樹皮在屬水平上的細菌豐度聚類熱圖

    圖6 葉片在屬水平上的細菌豐度聚類熱圖

    2.3.2 β多樣性分析 為進一步明晰樣本間在群落物種組成上的差異性,采用PCoA分析山桐子不同器官區(qū)細菌群落物種組成的相似度。如圖7所示,PCo1和PCo2分別解釋變量方差的42.9%、8.6%,兩者累計貢獻率達51.5%。PCo1可以將土壤的細菌群落與樹皮、葉片明顯區(qū)分開,土壤分布在PCo1負方向,樹皮和葉片主要分布在正方向,說明樹皮和葉片與土壤細菌群落差異較大。不同健康狀態(tài)山桐子的土壤和樹皮細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異性,其中健康、感病樹皮細菌組成差異明顯。而Y和BY相聚較近,表明健康和感病山桐子葉片細菌組成相似度較高。

    表1 不同器官區(qū)細菌Alpha多樣性指數(shù)①

    圖7 不同器官區(qū)細菌PCoA分析

    2.4 菌群代謝功能預(yù)測分析

    使用PICRUSt2軟件對健康、感病山桐子中不同器官區(qū)的細菌微生物群落進行代謝功能預(yù)測。通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對,結(jié)果共注釋到6條一級代謝通路,包括生物進程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、人類疾病(human diseases)、代謝(metabolism)和生物體系統(tǒng)(organismal systems); 一級代謝通路中代謝、遺傳信息處理為主要代謝通路,占全功能分類的80.68%~82.24%、11.26%~13.48%。在二級代謝通路中共注釋到34種代謝通路子功能,選取豐度占總豐度比值大于1.00%的子功能進行統(tǒng)計(表2)。山桐子不同器官區(qū)的微生物群落功能相似,但在子功能通路豐度上存在較大差異; 感病、健康山桐子的代謝功能,在土壤和葉片樣本中組內(nèi)差異較小,樹皮樣本組內(nèi)差異較大。細胞進程中的細胞運動(0.64%~2.72%)和環(huán)境信息處理中的膜運輸(1.58%~2.32%),在子功能通路豐度上呈P低于BP。遺傳信息處理中復(fù)制和修復(fù)(4.73%~4.87%)、折疊、分類和降解(3.08%~4.46%)、翻譯(2.52%~3.22%)為主要子功能,在子功能通路豐度上呈P高于BP。與代謝有關(guān)的主要子功能有11種,在各樣本中豐度均較高,其中5種子功能通路豐度為土壤>樹皮>葉片,包括碳水化合物代謝(12.01%~13.21%)、氨基酸代謝(11.63%~13.13%)、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝(7.02%~9.72%)、外源生物降解與代謝(4.49%~7.74%)、脂質(zhì)代謝(4.06%~7.25%); 輔助因子和維生素的代謝(11.4%~16.58%)、能量代謝(5.01%~9.51%)2種子功能通路豐度表現(xiàn)為葉片高于土壤和樹皮; 氨基酸代謝、能量代謝、聚糖生物合成與代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸代謝在子功能通路豐度上呈P高于BP; 脂質(zhì)代謝、外源生物降解與代謝在子功能通路豐度上呈G高于BG,P低于BP。

    表2 KEGG 數(shù)據(jù)庫主要代謝通路豐度

    對已有代謝通路的豐度數(shù)據(jù)進行分析,使用metagenomeSeq方法對樣本組進行兩兩比較,分析相同器官區(qū)、不同樣本之間在功能上的差異(圖8),篩選條件為P<0.05。分析結(jié)果表明,在土壤中,BG組12,14和16元大環(huán)內(nèi)酯的生物合成(Biosynthesis of 12-, 14-and 16-membered macrolides)、植物晝夜節(jié)律(Circadian rhythm-plant)、軸突導(dǎo)向(axon guidance)、倍半萜生物合成(sesquiterpenoid biosynthesis)、Ⅱ型聚酮主鏈的生物合成(biosynthesis of type II polyketide backbone)、Ⅱ型聚酮產(chǎn)品的生物合成(biosynthesis of type II polyketide products)、糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)和溶酶體(Lysosome)通路相關(guān)功能基因?qū)φ誈組顯著增加,而萘降解(Naphthalene degradation)通路相關(guān)功能基因?qū)φ誈組極顯著降低。在樹皮中,BP組的D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝(D-Arginine and D-ornithine metabolism)和金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureus infection)通路相關(guān)功能基因?qū)φ誔組極顯著增加,而類胡蘿卜素生物合成(Carotenoid biosynthesis)、弓形體病(Toxoplasmosis)和志賀菌病(Shigellosis)相關(guān)功能基因?qū)φ誔組顯著降低。

    圖8 兩兩組間代謝通路存在顯著差異的功能分類

    3 討論

    3.1 健康和感病山桐子各器官區(qū)細菌群落結(jié)構(gòu)特征

    本研究采用Illumina miseq高通量測序技術(shù)分析健康和感病山桐子土壤、樹皮、葉片細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異。結(jié)果表明,山桐子不同器官區(qū)細菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異,OTU數(shù)量由高到低為土壤>樹皮>葉片,土壤相較于植物組織含有較多的OTU數(shù)量,這與其他林木研究結(jié)果相似(劉海燕等, 2019; 楊多等, 2022),一定程度上也反映了不同器官區(qū)環(huán)境的特性。進一步的物種分析注釋發(fā)現(xiàn),山桐子不同器官區(qū)細菌群落的主要成分存在差異,在分類學上不同種類細菌的相對豐度發(fā)生變化。山桐子根際土壤細菌群落主要由變形菌門、放線菌門和酸桿菌門構(gòu)成,這些優(yōu)勢菌門在根際環(huán)境中富集,與其較強的環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)(王安寧等, 2019; Lietal., 2020)。其中變形菌門包括多種病原菌和固氮菌,因為其外膜主要由脂多糖組成可以保護其內(nèi)部遺傳物質(zhì)不受外部干擾,可以在大多數(shù)環(huán)境中生存并繁衍成為優(yōu)勢菌(葛藝等, 2021; 翟婉璐等, 2017)。山桐子樹皮和葉片細菌群落主要由藍細菌門和變形菌門構(gòu)成,這一結(jié)果與前人的研究發(fā)現(xiàn)相似(暴家兵等, 2020; 李慧娟等, 2021)。藍細菌門在山桐子葉際細菌中處于優(yōu)勢地位,相對豐度范圍為84.58%~88.42%,產(chǎn)氧光細菌綱是其主要的細菌類群,有研究表明,藍細菌是地球上廣泛存在的一種自養(yǎng)型細菌,種類繁多,有些種類能夠進行產(chǎn)氧的光合作用,有些種類在暗環(huán)境下也能生長,營養(yǎng)要求低,對極端環(huán)境適應(yīng)性很強(王文曉等, 2020)。山桐子樹皮和葉片中的微生物群落與土壤微生物群落差異較大,可能與不同器官區(qū)域的周邊環(huán)境有關(guān),藍細菌能夠為山桐子樹皮、葉片區(qū)域提供更適宜生長的微環(huán)境,促進山桐子的生長。

    3.2 健康和感病山桐子各器官區(qū)細菌群落差異菌屬

    健康和感病山桐子各器官區(qū)細菌在屬水平有顯著差異。本研究中鞘氨醇單胞菌屬是健康山桐子各器官區(qū)共有的優(yōu)勢菌屬,不動桿菌屬是健康山桐子樹皮、葉片的優(yōu)勢菌屬,與抑病能力密切相關(guān)。鞘氨醇單胞菌屬具有植物促生特性(陳兆進等, 2021),鞘氨醇單胞菌在降解有毒物質(zhì)、抵抗病原菌(秦立金等, 2018)、促進植物生長(葛藝等, 2021)等方面的功能。不動桿菌屬能產(chǎn)生生物表面活性劑和一些酶類物質(zhì),具有較高的促生、抗菌和降解有機污染物性能(程淺, 2020; 顧美英等, 2021)。從核桃根際土壤中分離到的2種不動桿菌屬菌株,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)對核桃細菌性疫病具有明顯拮抗作用,可以抑制病原菌生長,進而提高植物的抗病性(涂昌等, 2020)。本研究從感病山桐子樹皮中篩選出的優(yōu)勢菌屬為腸桿菌科的Brenneria和Hafnia-Obesumbacterium,在感病山桐子樹皮中的相對豐度均顯著高于健康山桐子樹皮。Brenneria是重要的林木病原細菌,該屬細菌侵染林木樹皮后會引起不規(guī)則的潰瘍病斑,對經(jīng)濟林木生長有嚴重的威脅(Frutos, 2010)。國內(nèi)外研究表明,Brenneria細菌會引起許多林木病害,例如Brennerianigrifluens是核桃樹皮潰瘍病的病原菌(Morettietal., 2007);Brenneriasalicis是柳樹水紋病的病原菌(Martineetal., 2009);Brenneriaquercina和B.corticissp. nov.是中國歐美楊潰瘍病的致病菌(楊莉, 2013; Lietal., 2019);Brenneriarubrifaciens可引起核桃深層樹皮潰瘍病(Amirsardarietal., 2017)等。Brenneria可能對山桐子樹皮區(qū)域病害的發(fā)生有協(xié)同或伴生作用,但其是否為山桐子感病的致病菌仍需進一步的研究。Hafnia-Obesumbacterium近年來已經(jīng)被證明某些細菌具有較高的耐鹽性(王改萍等, 2021),而Qing等(2020)研究發(fā)現(xiàn)Hafnia-Obesumbacterium在感病林蛙腸道菌群中的相對豐度較高,可能與動物腹瀉相關(guān)。但是,對于Hafnia-Obesumbacterium在植物致病性方面的報道還較少,有待進一步探究。

    3.3 健康和感病山桐子各器官區(qū)細菌群落多樣性

    本研究對不同器官區(qū)山桐子細菌群落多樣性分析可知,山桐子各器官區(qū)細菌群落多樣性和豐富度由高到低均表現(xiàn)為土壤>樹皮>葉片,這與Wu等(2020)的研究結(jié)果類似,表明山桐子不同器官區(qū)細菌群落在多樣性和豐富度方面存在顯著差異。本研究中,感病山桐子樹皮細菌多樣性高于健康植株,樹皮細菌豐富度低于健康植株,這與林馬水等(2019)以健康和干腐病山核桃植株為研究對象,得出感病山核桃(Caryacathayensis)樹皮多樣性及豐富度指數(shù)均低于健康植株的結(jié)果不同,這可能是由于病菌在寄主體內(nèi)存在時間的長短,對樹體生態(tài)平衡造成的影響不同; 同時,植株發(fā)病時間的長短也可能是造成感病山桐子樹皮組內(nèi)細菌多樣性差異較大的主要原因。

    3.4 健康和感病山桐子各器官區(qū)細菌功能特征

    菌群代謝功能預(yù)測結(jié)果表明,山桐子中的細菌主要涉及代謝、遺傳信息處理等6條一級代謝通路和34種子功能,表現(xiàn)出功能上的豐富度。山桐子不同器官區(qū)樣本中所含的功能基因種類大致相同,說明山桐子相關(guān)細菌群的功能基因具有一定相似性。對山桐子不同器官區(qū)樣本細菌功能基因相對豐度進行分析,發(fā)現(xiàn)代謝通路在山桐子不同器官區(qū)中相對豐度均最大。在代謝通路中,代謝功能注釋相對豐度大多表現(xiàn)為土壤微生物組含有更多的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、外源生物降解與代謝和脂質(zhì)代謝,這可能與土壤益生菌的含量有關(guān)(馬欣等, 2021),其中碳水化合物代謝調(diào)控著生物體內(nèi)碳水化合物的代謝形成、分解和互相轉(zhuǎn)化,有益于植物的氮、磷循環(huán)(馬欣等, 2021; 丁鈺珮等, 2021); 氨基酸代謝與碳代謝和氮代謝相關(guān)(南鎮(zhèn)武等, 2021); 萜類化合物代謝與植物抗病性和抗逆性有關(guān)(叢微等, 2021),間接說明土壤細菌代謝功能活躍有利于植物生長發(fā)育。而輔助因子和維生素的代謝、能量代謝在葉片微生物組中注釋豐度明顯高于土壤和樹皮,這2種代謝功能可能在維持植物葉際環(huán)境中發(fā)揮重要功能。通過代謝通路差異分析可知,感病山桐子根際土壤和樹皮中相關(guān)生物合成與氨基酸代謝的功能基因富集,說明感病后山桐子感病區(qū)域微生物群落的結(jié)構(gòu)及其功能已做出了有益于生長發(fā)育的響應(yīng)。而感病山桐子樹皮中金黃色葡萄球菌感染功能基因富集,造成代謝紊亂,降低山桐子抗病性,進而導(dǎo)致山桐子病害的發(fā)生。因PICRUSt功能預(yù)測分析只是初步預(yù)測相關(guān)細菌的功能,未來的研究將需要進一步驗證山桐子的致病菌,明晰引起山桐子病害的機制,更好地為山桐子病害防治及高質(zhì)量經(jīng)營提供理論支撐。

    4 結(jié)論

    健康和感病山桐子植株根際、樹皮及葉片細菌結(jié)構(gòu)組成、多樣性和功能存在差異。山桐子土壤主要優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門,樹皮和葉片主要優(yōu)勢菌門為藍細菌門和變形菌門。健康山桐子各器官區(qū)中主要的優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬和不動桿菌屬,感病后群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,健康樹皮與感病樹皮細菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著,感病山桐子樹皮的主要優(yōu)勢菌屬為腸桿菌科的Brenneria和Hafnia-Obesumbacterium。功能預(yù)測表明山桐子各器官區(qū)細菌生態(tài)功能較為豐富,健康和感病山桐子的土壤及樹皮區(qū)域代謝功能有明顯差異。

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