膠原蛋白改性聚乳酸-羥基乙酸載藥納米纖維膜的制備及其性能

吳煥嶺， 謝周良， 汪 陽， 孫萬超， 康正芳， 徐國華

(1.鹽城工學(xué)院 紡織服裝學(xué)院， 江蘇 鹽城 224051； 2.鹽城市權(quán)航科技有限公司， 江蘇 鹽城 224056； 3.鹽城創(chuàng)能新屏蔽材料有限公司， 江蘇 鹽城 224043)

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)具有優(yōu)異的生物相容性和體內(nèi)降解性，在體內(nèi)可通過水解作用全部降解，且具有非常好的可塑成型性，能夠用于藥物載體材料、醫(yī)用組織工程材料等領(lǐng)域。為了實(shí)現(xiàn)較高且穩(wěn)定的力學(xué)性能，一般采用中、高分子質(zhì)量PLGA材料制備組織工程支架材料。與此同時，這些支架材料的降解速率緩慢，但在體內(nèi)降解周期較長，有些可長達(dá)6個月以上[1-2]，在體內(nèi)長期留存將產(chǎn)生潛在機(jī)體排異和組織炎癥等副作用。另外，由于PLGA較強(qiáng)的疏水性，將其用于藥物傳遞材料時常常會出現(xiàn)藥物釋放速率慢、藥物累積釋放量低等問題。

基于構(gòu)效關(guān)系與表界面作用理論[3-5]，通過復(fù)配調(diào)控方式將不同材料的分子鏈從分子水平進(jìn)行重排，能夠減弱高聚物大分子之間的作用力，改變材料的親疏水性和降解性，也會對細(xì)胞在生物材料表面的黏附增殖性能產(chǎn)生較大影響。有研究表明，低分子質(zhì)量與高分子質(zhì)量的聚己內(nèi)酯(PCL)通過共混靜電紡絲的方式，能夠有效改善高分子質(zhì)量PCL納米纖維膜的降解性[6]。也有研究顯示：借助靜電紡絲技術(shù)制備PLGA、膠原蛋白復(fù)合纖維膜，可用于修復(fù)硬腦膜支架材料[7]、骨材料[8]和縫線材料[9]，能夠顯著提高PLGA材料的降解速率。原因在于膠原蛋白的引入能夠提高PLGA的親水性和生物相容性[10]，易于水分子的滲透和降解反應(yīng)的發(fā)生。

在藥物載體應(yīng)用方面，將藥物載入特定的有機(jī)或無機(jī)材料中，再置于腫瘤部位，能夠在腫瘤部位富集較高濃度的藥物，實(shí)現(xiàn)藥物的長效、精確輸送，降低給藥頻率，且避免口服藥的首關(guān)效應(yīng)及全身性毒副作用[11-13]。近年來，靜電紡絲技術(shù)飛速發(fā)展，由于該技術(shù)所制備的納米纖維具有比表面積高、孔隙率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為制備納米纖維最簡單高效的技術(shù)之一，并廣泛用于藥物緩釋材料和組織工程支架材料等領(lǐng)域[14-15]。基于以上分析，為改善PLGA基藥物載體的降解性能和釋藥性能，本文以PLGA為基材，以膠原蛋白(Col)為改性材料，以鹽酸阿霉素(DOX·HCl，文中均簡寫為DOX)為藥物模型，利用靜電紡絲技術(shù)制備PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維膜，作為乳腺癌局部治療藥物緩釋材料使用，并對其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行表征與分析。

1 實(shí)驗部分

1.1 實(shí)驗材料

材料：聚乳酸-羥基乙酸(重均分子質(zhì)量為120 000～160 000)，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH值為7.4)，南京森貝伽生物科技有限公司；透析袋(截留相對分子質(zhì)量為2.5×104)，上海吉至生化科技有限公司；鹽酸阿霉素(純度為98%)、牛跟腱I型膠原蛋白、六氟異丙醇(HFIP，純度為99.5%)，上海麥克林生化科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)胰酶，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；二甲基亞砜，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清，Hyclone公司；小鼠成纖維細(xì)胞L929，中國科學(xué)院。

1.2 靜電紡絲溶液的配制與纖維制備

1.2.1 DOX、PLGA和Col溶液的制備

以HFIP作為DOX、PLGA、Col的溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為0.1 g/mL PLGA溶液150 mL、0.01 g/mL DOX溶液10 mL和0.1 g/mL Col溶液20 mL。

1.2.2 紡絲液的復(fù)配

將不同溶液組分按照表1所示的體積比進(jìn)行混合，并充分?jǐn)嚢杈鶆?，分別得到PLGA、PLGA/Col、PLGA/DOX、PLGA/Col/DOX 4種紡絲溶液[16]。

表1 紡絲液的復(fù)配組分Tab.1 Composition of spinning solution

1.2.3 靜電紡納米纖維膜的制備

將配制的紡絲液通過DP30-S型靜電紡絲機(jī)進(jìn)行紡絲。紡絲條件為：溫度25 ℃，相對濕度45%，電壓18 kV，接收板與噴絲頭距離14～16 cm，溶液流速為1.2 mL/ h，接收基材為鋁箔紙。每個樣品紡制平行樣3份，每份紡絲時長均為1 h[16]。

1.3 測試與表征

1.3.1 纖維形貌觀察

利用Nova Nano-450型場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察納米纖維膜樣品的外觀形貌，測試前先將納米纖維膜連同其所附著的錫箔紙一同裁剪成0.5 cm × 0.5 cm尺寸大小，用導(dǎo)電膠粘貼到專用載物臺上，并進(jìn)行噴金處理45 s。

1.3.2 力學(xué)性能測試

將待測納米纖維膜從烘箱中取出，先裁成2 cm×7 cm規(guī)格，再揭除錫箔紙只留下納米纖維膜，采用WDS-20型斷裂強(qiáng)力測試儀測試試樣的力學(xué)性能。測試環(huán)境為：溫度20 ℃，相對濕度65%。樣品測試參數(shù)為：夾持長度5 cm，拉伸速率25 cm/min。

1.3.3 接觸角測試

將納米纖維膜連同其所附著的錫箔紙一同裁剪成2 cm × 2 cm規(guī)格，平鋪并固定在JCY-2型接觸角測試儀工作臺上，測試并讀數(shù)。測試參數(shù)：液滴體積3 μL，采用去離子水。

1.3.4 化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

采用NEXUS-670型傅里葉變換紅外光譜儀對納米纖維膜進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)測試，掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.3.5 熱分析

采用STA-449C型TG-DSC同步熱分析儀分別對不同納米纖維膜進(jìn)行降解性能測試。測試環(huán)境為N2氣氛，升溫速率為10.0 ℃/min，溫度范圍為50～800 ℃。

1.3.6 體外降解實(shí)驗及降解性能測試

利用質(zhì)量損失法分別對膠原改性前后的納米纖維膜進(jìn)行降解性能測試。具體過程為：首先，精確稱量納米纖維膜25 mg并裝入透析袋中封口，再置于50 mL離心管底部，隨后向離心管注入25 mL PBS緩沖溶液，并設(shè)置3份平行樣；然后，將試樣置于恒溫水浴振蕩搖床中，在37 ℃、100 r/min的條件下分別恒溫振蕩降解0、3、7、15、22和30 d；最后，稱量降解后的質(zhì)量，通過下式計算質(zhì)量損失率：

式中：m0為納米纖維膜降解前的質(zhì)量，mg；mt為納米纖維膜降解后的質(zhì)量，mg。

1.3.7 體外釋藥性測試

將恒溫振蕩搖床預(yù)先設(shè)置為37 ℃、100 r/min，備用。精確稱量Col改性前后的納米纖維膜25 mg并裝入透析袋中封口，再置于50 mL離心管底部，隨后向離心管注入25 mL PBS緩沖溶液，并設(shè)置3份平行樣。用封口膜將離心管密封完好，之后迅速置于恒溫振蕩搖床中。在一定的時間間隔從樣品離心管中吸取2 mL待測溶液，并及時補(bǔ)充2 mL新鮮PBS溶液。將取出溶液避光保存，并在2 h內(nèi)使用UV1 810 S型紫外分光光度計將取出的樣品溶液在480.0 nm(鹽酸阿霉素的最大吸收波長)處測試其吸光度(A)，并結(jié)合DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算釋藥濃度(C)和藥物累計釋放量。

1.3.8 細(xì)胞相容性測試

參照ISO 10993《生物相容性測試標(biāo)準(zhǔn)(生物學(xué)評價)》和GB/T 16886—2022《醫(yī)療器械生物學(xué)評價》進(jìn)行測試。通過PT-3502型酶標(biāo)儀測試570 nm(甲瓚的最大吸收波長)下吸光度值來反映細(xì)胞在不同膜材料上的黏附增殖能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 微觀形貌分析

采用場發(fā)射掃描電鏡觀察所制備的不同納米纖維膜的表面形貌，結(jié)果如圖1所示?？梢姡w維均呈現(xiàn)出清晰的網(wǎng)狀交織結(jié)構(gòu)。PLGA、PLGA/Col和PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維膜的單根纖維直徑均在200～500 nm范圍內(nèi)，但呈現(xiàn)出逐漸變細(xì)的趨勢，表明相同質(zhì)量納米纖維膜的比表面積在逐漸增大。對比來看，PLGA納米纖維形貌最均勻，PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維最不規(guī)整，出現(xiàn)了少部分粘連現(xiàn)象?？傮w上，PLGA與膠原蛋白以體積比3:1進(jìn)行復(fù)合后，仍可達(dá)到均勻紡絲的效果。

圖1 不同納米纖維膜的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM images of different nanofibrous membranes

2.2 力學(xué)性能分析

表2示出改性前后納米纖維膜的力學(xué)性能測試結(jié)果?？芍?，未改性未載藥PLGA納米纖維膜的拉伸斷裂強(qiáng)度和彈性模量在3個樣品中均最高，分別為5.22與180.3 MPa，說明其發(fā)生單位形變所需要的力最大。PLGA/Col復(fù)合納米纖維膜具有最高的斷裂伸長率，為63.6%，說明膠原的加入能夠改善PLGA纖維的形變能力。但隨著藥物的載入，納米纖維膜的拉伸斷裂強(qiáng)度、斷裂伸長率和彈性模量等均發(fā)生明顯下降。分析原因可能是DOX藥物的分子質(zhì)量小，其在一定程度上破壞了PLGA大分子的有序排列，因此，在材料使用時應(yīng)根據(jù)使用性能的需要匹配相應(yīng)的復(fù)配比例，以獲取適當(dāng)?shù)膹?qiáng)力性能。

表2 不同納米纖維膜的力學(xué)性能Tab.2 Mechanical properties of different nanofibrous membranes

2.3 親疏水性分析

圖2示出改性前后納米纖維膜表面的水接觸角?？芍琍LGA納米纖維膜表面在未改性未載藥前的水接觸角為93.5°，顯示出PLGA材料的疏水性；PLGA/Col(51.5°)和PLGA/DOX(54°)復(fù)合納米纖維膜表面的水接觸角在改性和載藥后均降至50°左右，充分證實(shí)膠原蛋白或DOX的載入能夠使PLGA納米纖維膜表面呈現(xiàn)出較大程度的親水性。水接觸角降低最為明顯的是PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維膜，其表面水接觸角降至0°。該結(jié)果進(jìn)一步說明，膠原蛋白和DOX的協(xié)同作用能夠極大地促進(jìn)強(qiáng)疏水性PLGA材料表面親水性的顯著改善，實(shí)現(xiàn)了PLGA材料疏水性向親水性的轉(zhuǎn)變。究其原因，與改性材料膠原蛋白分子上的強(qiáng)極性基團(tuán)有關(guān)，也與DOX·HCl的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。盡管經(jīng)過酸化的阿霉素水溶性有了大幅提高，但其在水中的溶解度仍然較低。在噴絲過程中伴隨著溶劑的不斷揮發(fā)，鹽酸阿霉素小分子物質(zhì)會發(fā)生不同程度地聚集，并附著在納米纖維表面上，能夠大幅增加納米纖維表面微結(jié)構(gòu)的粗糙度，使材料表面的親水性增強(qiáng)，因此，水接觸角減小[17]。隨著納米纖維膜親水性逐漸增大，水分子更易潤濕聚合物并進(jìn)入其內(nèi)部，促進(jìn)PLGA大分子發(fā)生水解反應(yīng)，并有助于提高納米纖維載藥體系的藥物溶出速率。

圖2 不同納米纖維膜的水接觸角Fig.2 Water contact angle images of different nanofibrous membranes

2.4 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖3 不同材料的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of different materials

2.5 納米纖維膜的降解性能評價

2.5.1 熱穩(wěn)定性能分析

圖4示出改性前后納米纖維膜的熱重曲線?？芍?，3種納米纖維膜的熱分解過程均始于250 ℃左右，并持續(xù)到400 ℃左右結(jié)束。雖然熱降解起始溫度非常接近，但后期的質(zhì)量損失率、質(zhì)量損失速率最大值對應(yīng)的溫度均有明顯不同。PLGA納米纖維膜的質(zhì)量殘留率僅約為1%，而PLGA/Col與PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維膜的質(zhì)量殘留率約為10%；PLGA納米纖維膜的熱質(zhì)量損失速率最大值對應(yīng)的溫度約為375 ℃，而PLGA/Col與PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維膜均約為350 ℃，相差約為25 ℃。以上分析表明，經(jīng)過復(fù)合改性后的納米纖維膜更易發(fā)生熱降解，說明膠原蛋白和藥物小分子的加入能夠加速PLGA的熱降解歷程[19]。

圖4 不同納米纖維膜的熱重曲線Fig.4 Thermogravimetric curves of different nanofiber membranes

2.5.2 體外降解分析

圖5示出膠原蛋白改性前后PLGA納米纖維膜的降解情況?？芍?，膠原蛋白改性后的納米纖維膜的質(zhì)量損失率明顯提高。在30 d的降解周期內(nèi)，未改性PLGA納米纖維膜的質(zhì)量損失率僅為3.5%，而PLGA/Col復(fù)合納米纖維膜的質(zhì)量損失率增至19%。值得注意的是，2種納米膜材料在降解前3 d均沒有發(fā)生明顯的質(zhì)量損失。隨著時間的延長，PLGA/Col復(fù)合納米纖維膜的質(zhì)量損失率快速增加，而未改性PLGA納米纖維膜的質(zhì)量損失率仍增加緩慢。該結(jié)果一方面與膠原蛋白復(fù)合改性使膜材料的親水性提高有關(guān)，水分子更易進(jìn)入納米纖維內(nèi)部，從而促進(jìn)PLGA材料的降解。另一方面與PLGA本身的降解規(guī)律有關(guān)?，F(xiàn)有研究表明PLGA材料的降解過程主要分為3個步驟：無規(guī)鏈段降解，此時分子質(zhì)量下降較快，但無明顯的質(zhì)量損失；分子質(zhì)量下降幅度減小，質(zhì)量損失增加；形成大量溶于降解環(huán)境的低聚物并發(fā)生降解，質(zhì)量損失增加明顯[20-22]。這與本文實(shí)驗結(jié)果一致，越到后期質(zhì)量損失速率越快，且膠原的加入加速了降解歷程。

圖5 PLGA、PLGA/Col納米纖維膜降解30 d后的質(zhì)量損失率Fig.5 Weight loss rate of PLGA and PLGA/Col nanofiber membranes after 30 d of degradation

2.6 體外釋藥性能分析

圖6示出DOX分別在PLGA納米纖維膜和PLGA/Col復(fù)合納米纖維膜中的藥物釋放情況?？梢?，PLGA納米纖維膜和PLGA/Col復(fù)合納米纖維膜的藥物釋放周期為120 h，二者的累積釋藥量分別為10與21.5 μg，說明經(jīng)膠原蛋白復(fù)合改性后的納米纖維膜的藥物釋放速率顯著提升。PLGA納米纖維膜在釋放48 h時基本停止釋放，究其原因PLGA是強(qiáng)疏水性材料，水分子較難穿越材料內(nèi)部孔道進(jìn)入到纖維內(nèi)部，導(dǎo)致載藥纖維內(nèi)部的藥物無法在水分子的作用下擴(kuò)散到纖維外部，因此，所釋放的藥物主要來自于纖維表面附著的藥物。而PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維膜在釋藥溶液中浸漬20 h后，釋藥速度明顯加快，且48 h后仍在緩慢釋藥。主要原因在于膠原蛋白復(fù)合改性可使纖維的親水性提高，水分子可穿越材料內(nèi)部孔道進(jìn)入到纖維內(nèi)部，并將纖維內(nèi)部的藥物通過水分子的作用擴(kuò)散到纖維外部。綜上所述，經(jīng)膠原蛋白復(fù)合改性后，PLGA由于親水性的提高，納米纖維載藥體系的釋藥性得到改善，提高了藥物持續(xù)釋放作用和藥物利用率。

圖6 PLGA/DOX、PLGA/Col/DOX載藥納米纖維膜的藥物釋放曲線Fig.6 Drug release curve of PLGA/DOX and PLGA/Col/DOX nanofiber membranes

2.7 細(xì)胞相容性評價

利用MTT法檢測活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的活力，可間接反映細(xì)胞在待測材料上的黏附增殖能力及共培養(yǎng)材料的細(xì)胞毒性。圖7示出小鼠成纖維細(xì)胞L929分別與PLGA、PLGA/Col、PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維膜共培養(yǎng)1、3、5 d后的細(xì)胞增殖情況?？芍S著培養(yǎng)時間的延長，與3種納米纖維膜共培養(yǎng)的細(xì)胞均顯示出增殖趨勢。其中，PLGA膜材料的細(xì)胞黏附增殖情況最差；膠原蛋白改性的PLGA/Col復(fù)合膜材料顯示出最優(yōu)的細(xì)胞黏附增殖性能，也說明材料對細(xì)胞毒性影響最低，細(xì)胞的活性最高；PLGA/Col/DOX復(fù)合載藥納米纖維膜材料顯示出來的黏附增殖性能略低于PLGA/Col，與阿霉素抗腫瘤藥物會對正常細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性有關(guān)。該結(jié)果表明膠原蛋白復(fù)合改性通過改善PLGA的親水性、電荷性等表界面性質(zhì)，能夠大幅提升PLGA材料的生物相容性，有利于細(xì)胞黏附增殖[3-4]。

圖7 L929細(xì)胞在不同納米纖維膜上的黏附增殖能力Fig.7 Adhesion and proliferation of L929 cells on different nanofiber membranes

3 結(jié) 論

基于生物醫(yī)用材料應(yīng)具備一定的親疏水性、可控降解性及細(xì)胞相容性等性質(zhì)，本文采用膠原蛋白對聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)進(jìn)行復(fù)合改性以實(shí)現(xiàn)材料結(jié)構(gòu)的重組和性能的改善，得到以下主要結(jié)論。

1)采用膠原蛋白對PLGA材料進(jìn)行復(fù)合改性能夠顯著提高PLGA納米膜表面的親水性。PLGA與膠原蛋白(Col)以3:1的質(zhì)量比進(jìn)行復(fù)合后，制備得到復(fù)合納米纖維膜的水接觸角由93.5°降至51.5°。

2)采用膠原蛋白對PLGA材料進(jìn)行復(fù)合改性能夠改善PLGA降解速率過慢的缺陷，膠原蛋白改性前后納米纖維膜30 d的質(zhì)量損失速率分別為3.5%和19%，且改性后的載藥體系的釋藥速率大幅提高。

3)采用膠原蛋白對PLGA材料進(jìn)行復(fù)合改性能夠提高PLGA材料的細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞黏附增殖。PLGA/Col/鹽酸阿霉素(DOX)復(fù)合載藥納米纖維膜具有作為腫瘤局部治療藥物傳遞體系的應(yīng)用潛力。研究策略可為生物材料及其表界面構(gòu)建方法提供新的思路。